◎ 袁京磊
(平邑縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東 平邑 273300)
黃曲霉毒素(AFT)主要是由黃曲霉、寄生曲霉等霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的毒性代謝產(chǎn)物,它們廣泛存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中,特別容易污染花生、玉米、稻米等糧食,是霉菌毒素中毒性最大的一類(lèi)霉菌毒素[1]。最常見(jiàn)的6種AFT分別是黃曲 霉 毒 素 B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG2)、M1(AFM1) 和 M2(AFM2), 其 中AFB1的急性毒性、致癌性、致突變性、致畸性在所有的真菌毒素中均居首位。AFT是目前發(fā)現(xiàn)的較強(qiáng)的致癌物質(zhì),主要誘發(fā)肝癌,嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。防止AFT污染的策略主要有防霉、去毒(物理去及化學(xué)去除法、生物脫毒方法)和檢測(cè),其中對(duì)食品中AFT進(jìn)行檢測(cè)是防止AFT中毒的重要一環(huán),也是保障食品安全的重要措施。
目前,國(guó)標(biāo)法主要使用高效液相色譜(HPLC)對(duì)食品中的AFT進(jìn)行檢測(cè),其原理是將試樣中的AFT提取后,再經(jīng)凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì),再經(jīng)液相色譜分離、熒光檢測(cè)器檢測(cè)、外標(biāo)法定量等步驟,實(shí)現(xiàn)對(duì)AFT準(zhǔn)確的檢測(cè)。姚譽(yù)陽(yáng)等[2]建立了QuEChERS-HPLC-柱后光化學(xué)衍生法測(cè)定糧谷類(lèi)食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的分析方法;樣品經(jīng)過(guò)1%甲酸-乙腈提取,MgSO4+C18+PSA凈化,HPLC-柱后光化學(xué)衍生化法檢測(cè),AFB1、AFG1和AFB2、AFG2線性范圍分別為 0.5 ~ 20 μg·L-1、0.125 ~ 5 μg·L-1,檢出限為0.1 ~ 0.3 μg·kg-1,定量限為 0.3 ~ 1.0 μg·kg-1,加標(biāo)回收率為86.4%~97.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%~6.3%,該方法可用于糧谷類(lèi)食品中AFT的大批量檢測(cè)。劉穎等[3]建立了同步檢測(cè)飼料中AFB1、玉米赤霉烯酮(ZEN)及嘔吐毒素的高效液相色譜法;樣品用乙腈-水提取,過(guò)三合一免疫親和柱凈化,用甲醇洗脫,洗脫液經(jīng)50 ℃濃縮氮?dú)獯蹈珊笥?0%甲醇-水復(fù)溶,采用HPLC串聯(lián)光化學(xué)衍生器、熒光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè);其中,檢測(cè)AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍為2.5~50.0 ng·mL-1,平均加標(biāo)回收率為81.2%~92.3%,RSD為4.3%~9.5%;該方法具有準(zhǔn)確度和精密度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn),可用于飼料中AFB1、ZEN及嘔吐毒素的同步檢測(cè)。
可視化檢測(cè)方法能夠直觀地觀察到檢測(cè)結(jié)果,無(wú)需借助復(fù)雜的儀器設(shè)備,具有簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果可視化等優(yōu)勢(shì)。目前,已有應(yīng)用可視化檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)AFT檢測(cè)的報(bào)道。ABNOUS等[4]基于CRISPR-Cas12a、滾環(huán)放大和納米金的催化活性,建立了高靈敏度檢測(cè)AFM1的比色適配體傳感器;在AFM1存在的情況下,CRISPR-Cas12a會(huì)失活,添加T4 DNA連接酶和phi29 DNA聚合酶后,納米金表面會(huì)形成大的單鏈DNA結(jié)構(gòu);因此,加入4-硝基苯酚后,顏色仍為黃色;當(dāng)不存在AFM1時(shí),由于CRISPR-Cas12a激活和引物消失,納米金表面沒(méi)有形成大的DNA結(jié)構(gòu),樣品的顏色變?yōu)闊o(wú)色;該方法對(duì)AFM1具有高選擇性,檢測(cè)限(LOD)低至0.05 ng·L-1,并成功用于牛奶樣品中AFM1的檢測(cè)。TANG等[5]設(shè)計(jì)了一種使用智能手機(jī)讀取比色信號(hào)的快速檢測(cè)AFB1的紙基微流控芯片,實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的可視化檢測(cè),該方法的LOD和定量限分別為9.4 ng·mL-1、12.00 ng·mL-1。
電化學(xué)檢測(cè)方法在食品安全檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)食品中有害成分高靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)。近年來(lái),隨著適配體研究的深入,基于適配體和電化學(xué)的新型檢測(cè)方法在AFT檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越多?;萱骆碌萚6]基于還原氧化石墨烯(RGO)構(gòu)建了用于AFM1檢測(cè)的電化學(xué)適配體傳感器;采用紅棗汁還原氧化石墨烯(GO)制備RGO,通過(guò)滴涂法將RGO修飾在玻碳電極(GCE)表面,利用電沉積法將納米金修飾在RGO/GCE上,AFM1的適配體(Apt)通過(guò)Au-S鍵固定在AuNPs/RGO/GCE電極表面用于靶標(biāo)AFM1的捕獲;當(dāng)AFM1存在時(shí),AFM1與適配體特異性結(jié)合形成AFM1-Apt復(fù)合物,該復(fù)合物阻礙了電子的傳遞,導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)減弱,該方法的檢測(cè)范圍為1×10-7~ 5×10-4ng·mL-1,LOD為 3.3×10-5pg·mL-1。GUO等[7]基于聚4-乙烯基吡啶、碳化鈦和羧化氧化石墨烯復(fù)合材料構(gòu)建了一種用于檢測(cè)AFB1的獨(dú)特開(kāi)/關(guān)轉(zhuǎn)換電化學(xué)適配體傳感器,用于檢測(cè)酸性環(huán)境中的AFB1,該方法具有較寬的檢測(cè)范圍(0.01~50 ng·mL-1)和較低的LOD(3 pg·mL-1)。SINGH等[8]設(shè)計(jì)了一種基于氧化錳納米粒子的電化學(xué)免疫傳感器,實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的檢測(cè);使用電泳技術(shù)在氧化銦錫表面上覆蓋了一層氧化錳納米粒子薄膜,用來(lái)固定AFB1抗體,再用差分脈沖伏安法選擇性檢測(cè)AFB1;檢測(cè)范圍為1 ~ 10 μg·mL-1,LOD為 0.54 pg·mL-1;對(duì)玉米提取物進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),回收率為98.6%。
熒光分析法是指利用某些物質(zhì)被紫外光照射后處于激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個(gè)碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過(guò)程所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光,可以進(jìn)行定性或定量分析的方法,熒光分析法在AFT的檢測(cè)中應(yīng)用也較多。JIANG等[9]構(gòu)建了雙色持續(xù)發(fā)光納米傳感器,用于同時(shí)和無(wú)自發(fā)熒光測(cè)定AFB1和ZON;通過(guò)制備功能性雙色持續(xù)發(fā)光納米粒子與Fe3O4磁性納米粒子,并使用具有高親和力和特異性的適配體作為識(shí)別工具,實(shí)現(xiàn)對(duì)食品樣品中AFB1和ZON的高靈敏度和選擇性檢測(cè),LOD分別為0.29 pg·mL-1和0.22 pg·mL-1,加標(biāo)回收率分別為93.6%~103.2%和94.7%~105.1%。QIAO等[10]基于AFM1/適配體復(fù)合物導(dǎo)致熒光信號(hào)變化的原理,設(shè)計(jì)了一種快速、簡(jiǎn)單檢測(cè)牛奶中AFM1的方法;首先,將AFM1的適配體用羧基熒光素修飾,它的互補(bǔ)DNA(cDNA)用羧基四甲基羅丹明淬滅基團(tuán)修飾;在沒(méi)有AFM1的情況下,適配體與cDNA雜交,由于適配體的熒光團(tuán)靠近c(diǎn)DNA上的淬滅基團(tuán),導(dǎo)致適配體熒光淬滅;當(dāng)AFM1存在的情況下,AFM1適配體復(fù)合物的形成誘導(dǎo)了適配體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換,導(dǎo)致cDNA釋放,從而產(chǎn)生熒光信號(hào);該方法的線性響應(yīng)范圍為1~100 ng·mL-1,LOD為0.5 ng·mL-1;對(duì)牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),回收率為93.4%~101.3%。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法,在疾病診斷和食品安全檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用。張寧等[11]結(jié)合間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)機(jī)制,運(yùn)用ELISA方法建立了快速檢測(cè)AFT的改進(jìn)方法,該方法的半抑制濃度(IC50)< 0.1 μg·L-1,加標(biāo)回收率為 67% ~ 116 %,靈敏度達(dá)到0.03 μg·L-1。WANG等[12]建立了一種間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法,用于快速檢測(cè)地甲蟲(chóng)、蟑螂、蠶和蚯蚓中的AFB1;該方法的IC50為0.092~0.135 ng·mL-1,LOD為0.008~0.020 ng·mL-1;對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。YAN等[13]基于生物素化納米抗體Nb26和鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶設(shè)計(jì)了一種生物素-鏈霉親和素?cái)U(kuò)增的ELISA方法,用于靈敏、快速地檢測(cè)谷物中的AFB1;該方法的IC50值為0.21 ng·mL-1,檢測(cè)時(shí)間為50 min,可節(jié)省多達(dá)98%的抗體;應(yīng)用該方法檢測(cè)兩種谷物樣品中的AFB1,檢測(cè)結(jié)果與HPLC的結(jié)果基本一致。
除以上檢測(cè)方法外,其他檢測(cè)AFT的方法主要有生物傳感器、免疫傳感器及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、試紙條等,均能實(shí)現(xiàn)對(duì)AFT的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。HAMAMI等[14]設(shè)計(jì)了防污PEG/納米金復(fù)合物的生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶中AFM1的靈敏檢測(cè),檢測(cè)范圍為 20 ~ 300 pg·mL-1,LOD低至 7.14 pg·mL-1。LI等[15]開(kāi)發(fā)了一種超靈敏檢測(cè)牛奶中AFM1殘留的免疫傳感器;LOD為 0.018 6 ng·mL-1(18.10 ng·kg-1),線性范圍為0.003~0.81 ng·mL-1,對(duì)牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),平均回收率為79.6%~112.5%,RSD為6.7%~13.3%。WU等[16]基于FRET構(gòu)建了一種用于檢測(cè)AFB1的新型上轉(zhuǎn)換納米材料適配體傳感器;線性范圍為 0.2 ~ 500 ng·mL-1,LOD為 0.028 ng·mL-1;該方法對(duì)花生油和小麥樣品進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度與HPLC沒(méi)有明顯差異。LI等[17]開(kāi)發(fā)了一種基于時(shí)間分辨熒光微球免疫層析試紙條,用于快速定量檢測(cè)牛奶及其制品中的AFM1;該試紙條的線性范圍為 0.05 ~ 2.0 ng·mL-1,IC50為 0.204 ng·mL-1,靈敏度為0.019 ng·mL-1,加標(biāo)回收率為84.6%~119.0%;檢測(cè)牛奶樣品中AFM1的結(jié)果與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)果基本一致,可用于定量檢測(cè)牛奶中的AFM1。
隨著適配體技術(shù)的不斷發(fā)展,以適配體為識(shí)別工具的快速檢測(cè)方法將在AFT的檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用,尤其是基于適配體的電化學(xué)傳感器、生物傳感器、適配體傳感器等,將在AFT快速檢測(cè)中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。