魯澤平，裴新華，薛譽(yù)，張曉光，胡燚

（南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，材料 化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816）

化學(xué)修飾具有價(jià)格低廉、實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間短、操作便利等優(yōu)點(diǎn)，是對(duì)脂肪酶進(jìn)行分子改性的一種重要手段[1]。目前的修飾劑主要依賴于一些小分子（酸酐、脂肪酸等）和大分子（聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物等），且修飾后的脂肪酶的酶學(xué)性能提升并不顯著，各項(xiàng)酶學(xué)性能也不能同時(shí)得到提升，不能夠滿足酶分子修飾多樣性的需求[1-3]。例如，Liu等[4]分別利用檸檬酸酐、鄰苯二甲酸酐和順丁烯二酸酐對(duì)氯過(guò)氧化物酶進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾改性后的氯過(guò)氧化物酶的催化效率分別提高了7%～53%，然而修飾后的酶有機(jī)溶劑耐受性卻發(fā)生了大幅度的降低。Jayawardena 等[5]利用苯甲酸酐對(duì)南極假絲酵母脂肪酶A（CALA）進(jìn)行化學(xué)改性，修飾酶的熱穩(wěn)定性與儲(chǔ)存穩(wěn)定性得到了提升，但有機(jī)溶劑耐受性、選擇性卻發(fā)生了一定程度的降低。

離子液體是由陰陽(yáng)兩種離子組成，在室溫下為一種液態(tài)的熔融狀的鹽。由于其可設(shè)計(jì)性與良好的理化性質(zhì)，離子液體在化學(xué)合成、生物催化等多個(gè)領(lǐng)域中表現(xiàn)良好的適用性[6-7]。離子液體對(duì)酶非常友好，離子液體作為酶催化的反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，酶催化反應(yīng)的效率大大提高，反應(yīng)的區(qū)域/對(duì)映體選擇性也有所增加，當(dāng)反應(yīng)底物為高極性底物時(shí)，離子液體優(yōu)越性更是十分明顯[8-10]。在以離子液體為溶劑的酯交換和酯水解反應(yīng)中，酶的活性和穩(wěn)定性都有所提高，可能是因?yàn)殡x子液體對(duì)酶的活性構(gòu)象起到了積極的作用[11-12]。故本文選擇離子液體為修飾劑，以期更好地提高脂肪酶酶學(xué)性能。

甜菜堿作為代謝的次生產(chǎn)物，是非常重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在生物化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[13-14]。有文獻(xiàn)報(bào)道，甜菜堿類離子液體可以作為反應(yīng)介質(zhì)參與一系列的化學(xué)反應(yīng)。例如，Zhu 等[15]合成了一系列不同陰離子的甜菜堿離子液體，將其運(yùn)用到Hantzsch反應(yīng)的催化性能研究中，結(jié)果表明，在溫和條件下，這些離子液體對(duì)一鍋法制備吖啶二酮的Hantzsch反應(yīng)具有較高的選擇性，其中乳酸甜菜堿的催化活性最高。

本文作者課題組前期工作設(shè)計(jì)合成了多種離子液體用以修飾脂肪酶，展現(xiàn)出離子液體作為酶的新型修飾劑的優(yōu)勢(shì)[16-20]。例如，徐超等[16]用手性脯氨酸類離子液體化學(xué)修飾PPL，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)[BMIM][N-AC-L-pro]修飾后的PPL展現(xiàn)出最佳的酶學(xué)性能，在酶活提高了1.0 倍的同時(shí)，熱穩(wěn)定性提高了2.6 倍（50℃，2.5h），對(duì)映體選擇性提高了1.5 倍，在50%的二甲基亞砜中的穩(wěn)定性提高了0.7倍，且在不同溫度、pH下也展現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性與耐受性。Jia 等[17]利用不同鏈長(zhǎng)、不同陰陽(yáng)離子的咪唑類離子液體對(duì)南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）進(jìn)行化學(xué)修飾。其中，[HOOCMMIm][Cl]修飾后的CALB 活性提高了1.5 倍，在70℃下保存2h的耐熱性提高了7.0倍，在50%的二甲基甲酰胺中耐受性提高了0.8倍，在50%甲醇溶液中耐受性提高了5.0倍。

本文利用離子液體的可設(shè)計(jì)性，設(shè)計(jì)并合成不同鏈長(zhǎng)、不同陰離子的甜菜堿離子液體對(duì)豬胰脂肪酶（PPL）進(jìn)行修飾，考察不同鏈長(zhǎng)與陰離子對(duì)脂肪酶的活性與穩(wěn)定性的影響。預(yù)期得到能夠同時(shí)提高PPL的各項(xiàng)酶學(xué)性能的甜菜堿類離子液體，并探索其酶學(xué)性能變化機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試劑：PPL；三硝基苯磺酸（50g/L）；BCA 試劑盒；33%二甲胺水溶液、氯代正丁烷、氯代正辛烷、氯代正十二烷、氯代正十六烷、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯、對(duì)硝基苯酚、乙酸乙烯酯、N,N-羰二咪唑（CDI）、異丙醇、正己烷、丙酮、甲醇、二甲基亞砜（DMSO）皆為分析純；阿拉伯樹(shù)膠粉、牛血清蛋白、Triton-X100皆為生化試劑。

儀器：電子分析天平（BAS224S），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；透析袋（10kDa），南京圣比奧科技有限公司；振蕩恒溫/水浴鍋（WS20），德國(guó)WIGGENS公司；pH計(jì)（PHS-3C），上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微量移液器（10-1000μL），德國(guó)Eppendorf 公司；熒光分光光度計(jì)（F-7000)，日本Hitachi 公司；圓二色譜儀（J-1500)，JASCO；高 效 液 相 色 譜（UltiMate3000)，Dionex；真空冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-12N)，寧波新芝生物科技股份有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（MD190)，美谷分子儀器(上海)有限公司；低溫高速離心機(jī)（TCL-16MS)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 甜菜堿離子液體的合成

將0.01mol 氯代正丁烷（氯代正辛烷、氯代十二烷、氯代十六烷）加入到過(guò)量的33%二甲胺水溶液中；冰浴條件下反應(yīng)1h，然后在50～100℃下加熱回流24h；冷卻至室溫，用蒸餾水重復(fù)洗三次，得到黃色油狀液體；將氯乙酸和氫氧化鈉按照摩爾比1∶1.2混合攪拌反應(yīng)10min，然后將得到的氯乙酸鈉與等摩爾的黃色油狀液體在95℃條件下回流4h；得到的反應(yīng)液用過(guò)量的濃鹽酸處理，過(guò)濾收集濾渣；用乙醇、乙醚體積比為1∶10混合溶劑重結(jié)晶得到白色粉末狀離子液體。其中將氯代十六烷基甜菜堿離子液體加入到丙酮溶液中，分別加入過(guò)量的磷酸二氫鈉和氟硼酸鈉，在室溫條件下攪拌反應(yīng)48h，反應(yīng)液過(guò)濾除去沉淀，然后旋蒸除去丙酮溶液，得到H2PO4－和BF4－的十六烷基甜菜堿離子液體。

為了驗(yàn)證離子液體作為修飾劑的優(yōu)越性，合成了十六烷基肌氨酸。將肌氨酸溶解在甲醇中，緩慢滴加二氯亞砜，得到油狀肌氨酸甲酯。將肌氨酸甲酯與氯代十六烷加入到甲醇溶劑中，加入少量的三乙胺作為縛酸劑，加熱回流12h，取反應(yīng)液旋干除去甲醇溶劑，用乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相旋干得粗品，用丙酮和石油醚混合溶劑重結(jié)晶得十六烷基肌氨酸純品。

如圖1所示，修飾劑結(jié)構(gòu)由上往下依次為氯化丁基甜菜堿離子液體[BetaineC4][Cl]、氯化辛基甜菜堿離子液體[BetaineC8][Cl]、氯化十二烷基甜菜堿離子液體[BetaineC12][Cl]、氯化十六烷基甜菜堿離子液體[BetaineC16][Cl]、四氟硼酸根十六烷基甜菜堿離子液體[BetaineC16][BF4]、磷酸二氫根十六烷基甜菜堿離子液體[BetaineC16][H2PO4]、十六烷基肌氨酸Sarcosine。

圖1 修飾劑結(jié)構(gòu)

1.3 脂肪酶純化與化學(xué)修飾

（1）純化 取25mL PPL酶液粗品，在4℃環(huán)境下離心20min，轉(zhuǎn)速8000r/min，去除沉淀，取上清液于透析袋中，在冰浴條件下透析除鹽24h，中途每隔6h 換一次水，得到純化后的酶，置于冰箱中4℃條件下保存待用。

（2）化學(xué)修飾 稱取1mmol合成的甜菜堿類離子液體，加入等摩爾的羰基二咪唑（CDI），在2mL的無(wú)水二甲基亞砜的作用下磁力攪拌，室溫反應(yīng)2h 后停止，反應(yīng)完畢之后取400μL 的修飾劑加入到20mL 的酶液中，在冰浴條件下繼續(xù)磁力攪拌8h，修飾后的酶裝入10kDa的透析袋中，冰浴條件下透析24h，中途每隔6h換一次水，最后得到7種修飾酶，給修飾后的PPL 以如下方式進(jìn)行命名:[BetaineC4] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC4] [Cl] -PPL，[BetaineC8] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC8] [Cl] -PPL，[BetaineC12] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC12] [Cl] -PPL，[BetaineC16] [Cl] 修 飾 的 酶[BetaineC16] [Cl] -PPL，[BetaineC16][BF4]修飾的酶[BetaineC16][BF4]-PPL，[BetaineC16][H2PO4]修飾的酶[BetaineC16][H2PO4]-PPL， 十六烷基肌氨酸(Sarcosine) 修飾的酶SarcosineC16-PPL。

1.4 蛋白濃度、修飾度以及酶活測(cè)定

采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配制不同濃度的牛血清蛋白(BSA)溶液，測(cè)定其在562nm 下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而測(cè)定酶液中的蛋白濃度。

采用三硝基苯磺酸（TNBS）法測(cè)定修飾度。TNBS 可以與未被修飾的賴氨酸反應(yīng)生成在304nm有特定光吸收的產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)定該波長(zhǎng)下的吸光度進(jìn)而計(jì)算出修飾度。

采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定酶活。脂肪酶可以催化對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（p-NPP）水解生成在410nm有特定光吸收的對(duì)硝基苯酚（p-NP），通過(guò)測(cè)定該波長(zhǎng)下的吸光度進(jìn)而計(jì)算出酶活。以單位時(shí)間內(nèi)催化水解底物對(duì)硝基苯棕櫚酸酯產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.5 酶學(xué)性能測(cè)試

（1）最適pH測(cè)定 在各自37℃下，設(shè)置不同pH梯度的底物溶液6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，將稀釋后的酶溶液預(yù)熱5min后，取0.1mL加入到底物溶液反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束加入滅活劑（V乙醇∶V丙酮=1∶1），分別測(cè)定原酶與修飾酶酶活。

（2）最適溫度測(cè)定 在各自最適pH 下，設(shè)置不同的溫度梯度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，將稀釋后的酶溶液預(yù)熱5min 后，取0.1mL 加入到底物溶液反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束加入滅活劑（V乙醇∶V丙酮=1∶1），分別測(cè)定原酶與修飾酶酶活。

（3）熱穩(wěn)定性測(cè)定 將原酶與修飾酶分別保溫在60℃中，每隔10min 取出10μL 樣品在各自最適宜的條件下測(cè)其酶活。

（4）有機(jī)溶劑耐受性測(cè)定 將原酶與修飾酶分別在室溫下保存在含0～50%的二甲基亞砜中2h，樣品取出后在各自最適宜的條件下測(cè)試其酶活。

（5）酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定 將游離酶與修飾酶加入到9～30mg/mL的三乙酸甘油酯中，在各自最適宜的反應(yīng)溫度和pH下反應(yīng)3min，測(cè)定反應(yīng)的初速度，用Lineweaver-Burk 法求出PPL 的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（Vmax）。

（6）對(duì)映體選擇性測(cè)定 如圖2所示，以α-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化拆分反應(yīng)作為反應(yīng)模型，研究修飾前后PPL催化該反應(yīng)的對(duì)映體選擇性變化。將原酶與修飾酶用冷凍干燥機(jī)凍干，制成酶粉，稱取0.1g的酶粉置于50mL 的離心管中，加入10mL 正己烷溶液、0.05mol 苯乙醇和0.1mol 乙酸乙烯酯。放入水浴搖床中，在37℃、150r/min的條件下反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束，利用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定計(jì)算轉(zhuǎn)化率、對(duì)映體過(guò)剩值ee值、對(duì)映體選擇率E值等，計(jì)算如式(1)～式(6)。

圖2 酶促(R,S)-α-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

由于底物中(S)-α-苯乙醇參與反應(yīng)量較小，因此底物ee值采用eeS來(lái)表示，而產(chǎn)物以(R)-乙酸苯乙酯為主，產(chǎn)物的ee值以eeR表示。

1.6 光譜結(jié)構(gòu)表征

（1）熒光光譜 室溫下，將原酶和修飾酶分別稀釋到濃度為100μg/mL，取3mL 酶液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件為激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，激發(fā)和發(fā)射光柵均為5nm，掃面范圍280～400nm，在熒光分光光度計(jì)F-7000 FL Spectrophotometer上測(cè)量。

（2）圓二色譜 室溫下，取濃度為100μg/mL的酶液置于圓二色譜儀中測(cè)定。測(cè)定條件為樣品池光程為1cm，掃描波長(zhǎng)范圍為190～260nm，掃描速度為50nm/min，以溶劑（去離子水）作為空白組自動(dòng)矯正基線， 在圓二色譜儀JASCOJ810 Spectropolarimeter （Jasco Co., Japan）上測(cè)定，使用CDpro軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算出二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 原酶與修飾酶活性變化

2.1.1 pH對(duì)酶活的影響

測(cè)定不同pH 下原酶與修飾酶酶活的變化。如圖3 所示，原酶與修飾酶的最適pH 并沒(méi)有發(fā)生變化，而修飾酶在不同pH 下酶活均有了不同程度的提升，其中[BetaineC16][H2PO4]-PPL 酶活提升最明顯。Hofmeister 效應(yīng)將離子分為K 型和C 型，kosmotropic離子具有較高的表面電荷和較強(qiáng)的水合能力[21-23]。將陰離子按照K 型由高到低排序?yàn)镠2PO4->Cl->BF4-，據(jù)報(bào)道，當(dāng)離子液體的陽(yáng)離子相同時(shí)，陰離子更加K 型，修飾酶酶活提升更為明顯[24]，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。此外，隨著離子液體中烷基鏈長(zhǎng)的增加，修飾酶對(duì)pH 的敏感性降低，可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的烷烴鏈可以更好地保護(hù)酶活性中心，使之能夠適應(yīng)較寬的pH 范圍。這與徐超等[16]利用手性脯氨酸類離子液體修飾PPL的修飾效果不同，經(jīng)過(guò)[BMIM][N-AC-pro]修飾后的PPL 最適pH在6.5，而通過(guò)[N-AC-pro][Cl]修飾后的PPL最適pH提高到7.5。

圖3 原酶與修飾酶在不同pH下的酶活

2.1.2 溫度對(duì)酶活的影響

在pH為7.0條件下，測(cè)定不同溫度下原酶與修飾酶的酶活。如圖4所示，在不同溫度下，修飾酶酶活較原酶均有不同程度的提升。其中，[BetaineC16][H2PO4]-PPL 酶活提升最為明顯，這與不同陰離子對(duì)酶的修飾效果差異相符合。40℃之前，原酶與修飾酶沒(méi)有明顯的差異；40℃之后，修飾酶酶活明顯升高，可能是因?yàn)樵谳^低溫度時(shí)酶的活性中心不能被完全打開(kāi)，影響了酶的催化活性。原酶達(dá)到最適溫度45℃之后，酶活隨著溫度的升高而降低，并且60℃之后酶幾乎失活，修飾酶達(dá)到最適溫度50℃之后，仍能夠保持較高的酶活，65℃之后酶活才發(fā)生明顯降低，可見(jiàn)修飾酶表現(xiàn)出更好的溫度耐受性。這可能與烷基化甜菜堿離子液體長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷Y(jié)構(gòu)有關(guān)，同時(shí)較長(zhǎng)的烷烴鏈可以有效增強(qiáng)酶的剛性結(jié)構(gòu)[25-26]，兩者共同增強(qiáng)了修飾酶對(duì)溫度的耐受性。

圖4 原酶與修飾酶在不同溫度下的酶活

2.1.3 修飾度與酶活變化

在原酶與修飾酶各自的最適溫度與pH 下，測(cè)定其酶活。PPL上可供修飾的賴氨酸殘基有22個(gè)，且分布比較密集。如表1所示，不同鏈長(zhǎng)的甜菜堿離子液體對(duì)PPL的修飾度有明顯的差異，隨著鏈長(zhǎng)的增加，修飾度逐漸降低?？赡苁且?yàn)榭臻g位阻較大的修飾劑在某種程度上會(huì)影響酶蛋白的修飾度[21]，因此經(jīng)[BetaineC16]修飾過(guò)的PPL 具有最低的修飾度。此外，修飾度的降低并沒(méi)有影響到酶活，隨著鏈長(zhǎng)的增加，修飾酶酶活也隨之增大，[BetaineC16][Cl]-PPL 酶活提升了2.34 倍；經(jīng)過(guò)陰離子交換后，[BetaineC16][H2PO4]-PPL 酶活提升了2.44倍。此外，經(jīng)十六烷基肌氨酸修飾過(guò)的PPL酶活較原酶也有所提升，但是提升效果相比于離子液體并不明顯，由此也證明了酶分子改造中離子液體作為修飾劑的優(yōu)越性。

表1 原酶與修飾酶的修飾度與酶活

2.2 原酶與修飾酶穩(wěn)定性變化

2.2.1 熱穩(wěn)定性變化

熱穩(wěn)定性是酶在工業(yè)應(yīng)用中的關(guān)鍵因素。如圖5 所示，原酶在60℃下保存30min 后酶活幾乎喪失，而經(jīng)[BetaineC16]修飾的PPL 在60℃下保存45min 后仍能夠保留40%左右的酶活。結(jié)果表明，較長(zhǎng)側(cè)鏈甜菜堿離子液體的引入可以讓酶具有較好的熱穩(wěn)定性，可能因?yàn)殒滈L(zhǎng)越長(zhǎng)，甜菜堿離子液體的分子量越大，共價(jià)連接到酶分子上后可以穩(wěn)定酶的整體構(gòu)象，減少了酶分子在高溫環(huán)境中的熱振動(dòng)，同時(shí)較長(zhǎng)的側(cè)鏈增加了位阻，增強(qiáng)了酶分子的剛性結(jié)構(gòu)，能夠更好地保護(hù)酶活性中心，避免遭到高溫的破壞[27-28]。

圖5 原酶與修飾酶在60℃下的熱穩(wěn)定性

2.2.2 有機(jī)溶劑耐受性變化

酶的溶劑穩(wěn)定性一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，提高脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性可以有效拓寬脂肪酶在實(shí)際環(huán)境中的應(yīng)用范圍。如圖6 所示，原酶在10%的強(qiáng)極性非質(zhì)子溶劑DMSO中酶活就出現(xiàn)了降低，在50%的DMSO中，原酶的酶活僅為初始酶活的18%。而修飾后的PPL在低濃度的DMSO中出現(xiàn)了不同程度的激活作用，當(dāng)DMSO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)20%之后，酶活緩慢降低，當(dāng)DMSO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的時(shí)候，修飾酶仍能夠保持較高的酶活，其中[BetaineC16][H2PO4]-PPL 修飾酶仍能夠保持初始酶活的50%。這可能因?yàn)檩^長(zhǎng)的疏水鏈能夠更好地保護(hù)酶的活性中心，讓其很難暴露在有機(jī)溶劑中，進(jìn)而降低有機(jī)溶劑對(duì)酶的影響。

圖6 原酶與修飾酶在不同濃度的DMSO中的耐受性

2.3 原酶與修飾酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Doumèche 等[21,29]采用含羥基的咪唑、吡咯等離子液體修飾甲酸脫氫酶，修飾后的甲酸脫氫酶在水溶性[MMIm][Me2PO4]體系中的Km值降低，酶的催化性能提升了2.29～10.21倍。本文作者課題組前期的研究中利用咪唑、膽堿類離子液體化學(xué)修飾PPL，修飾后PPL 的Km發(fā)生了改變， 其中經(jīng)過(guò)[HOOCBMIm][Cl]和[HOOCBMIm][H2PO4]修飾后PPL的Km值發(fā)生降低[18]。動(dòng)力學(xué)測(cè)試結(jié)果如表2 所示，所有修飾酶的Km都比原酶低，并且隨著鏈長(zhǎng)的增加，Km值越來(lái)越小?？傮w來(lái)說(shuō)，[BetaineC16][Cl]-PPL 的底物親和力高于原酶，且優(yōu)于其他修飾酶，這可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的柔性脂肪長(zhǎng)鏈增加了其脂溶性，讓酶更容易與底物結(jié)合，并加快反應(yīng)速度；也可能是因?yàn)殚L(zhǎng)鏈烷基化甜菜堿離子液體具有較強(qiáng)的疏水性，它的引入改變了活性中心附近的疏水環(huán)境，使底物與活性中心的親和力增加。此外，長(zhǎng)鏈烷基化甜菜堿離子液體的引入增加了酶蛋白的剛性結(jié)構(gòu)，使得修飾酶較大程度上保持了PPL 的活性構(gòu)象[30]。

表2 原酶與修飾酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 原酶與修飾酶對(duì)映體選擇性變化

通過(guò)α-苯乙醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，考察了原酶與修飾酶的對(duì)映體選擇性的變化。表3 中數(shù)據(jù)顯示，所有修飾酶的總體轉(zhuǎn)化率和選擇率都比原酶的要高，其中，隨著甜菜堿離子液體的側(cè)鏈鏈長(zhǎng)的增加，催化活性和對(duì)映體選擇性提升越明顯，[BetaineC16][H2PO4]-PPL的選擇率E為16.3，是原酶選擇率的3.0 倍。總體轉(zhuǎn)化率的大幅提升可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)的烷烴鏈具有較強(qiáng)的脂溶性，能夠使酶蛋白更好地與底物結(jié)合，從而更好地發(fā)揮催化活性；此外，較長(zhǎng)的烷烴鏈具有更強(qiáng)的疏水作用，修飾酶的剛性結(jié)構(gòu)得到增強(qiáng)的同時(shí)能夠穩(wěn)定酶蛋白蓋子結(jié)構(gòu)打開(kāi)狀態(tài)，使得底物能夠更好地進(jìn)入到酶活性中心，從而提升修飾酶的選擇性[28]。

表3 原酶與修飾酶催化的(R,S)-1-乙酸苯乙酯的對(duì)映體選擇性水解

2.5 原酶與修飾酶光譜學(xué)結(jié)構(gòu)表征

2.5.1 熒光光譜

熒光光譜的靈敏度較高，能夠反應(yīng)酶蛋白某些熒光基團(tuán)附近環(huán)境的變化，因此被廣泛應(yīng)用于生化領(lǐng)域的研究中[31]。如圖7所示，修飾前后酶的最大吸收波長(zhǎng)并沒(méi)有發(fā)生改變，而修飾酶的熒光強(qiáng)度較原酶熒光強(qiáng)度降低，并且修飾度越高的PPL熒光強(qiáng)度降低得越多，可能是某些具有熒光特性基團(tuán)附近的賴氨酸被離子液體修飾，從而對(duì)熒光基團(tuán)附近微環(huán)境產(chǎn)生了影響。此外還發(fā)現(xiàn)，不同陰離子的甜菜堿離子液體修飾的PPL熒光強(qiáng)度變化差異不大。

2.5.2 圓二色譜

利用圓二色譜對(duì)原酶與修飾酶二級(jí)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行測(cè)定。如表4所示，修飾后PPL的α-螺旋含量明顯降低，而β-折疊含量有所上升，且隨著鏈長(zhǎng)的增加，α-螺旋與β-折疊變化程度也在增大。α-螺旋含量的降低可能是因?yàn)殡x子液體的引入促進(jìn)了PPL蓋子結(jié)構(gòu)的打開(kāi)，使底物更好地與酶的活性中心結(jié)合，這也解釋了酶活提升的原因；β-折疊含量上升可能是因?yàn)殡x子液體的引入，增加了酶蛋白表面的剛性結(jié)構(gòu)，這與修飾酶熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑耐受性等穩(wěn)定性酶學(xué)性能變化規(guī)律一致[32-34]。

表4 原酶與修飾酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

3 結(jié)論

用設(shè)計(jì)合成的不同鏈長(zhǎng)與陰離子的甜菜堿離子液體對(duì)PPL進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾酶的酶活、熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、對(duì)映體選擇性等酶學(xué)性能同時(shí)得到了不同程度的提升。不同鏈長(zhǎng)的甜菜堿離子液體的修飾度不同，鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)，修飾度越低。酶活測(cè)定結(jié)果顯示，修飾酶的酶活隨著修飾劑側(cè)鏈長(zhǎng)度的增加而增大，且修飾度的差異給酶活帶來(lái)的影響并不明顯。原酶與修飾酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，所有修飾酶的Km比原酶低，且鏈長(zhǎng)越長(zhǎng)的離子液體修飾的PPL與底物的親和力越好，可能是因?yàn)樘鸩藟A離子液體的引入使得脂肪酶活性中心上的蓋子結(jié)構(gòu)更容易打開(kāi)，從而表現(xiàn)出較高的活性。通過(guò)α-苯乙醇轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，[BetaineC16][H2PO4]-PPL 的選擇性提高最為明顯，是原酶的3.0 倍。光譜學(xué)結(jié)構(gòu)表征表明甜菜堿類離子液體的引入導(dǎo)致了PPL的構(gòu)象發(fā)生了變化，α-螺旋含量的降低與β-折疊含量上升使修飾后的PPL具有更高的酶活與更穩(wěn)定的構(gòu)象，初步解釋了酶活和穩(wěn)定性變化的原因。

符號(hào)說(shuō)明

A，AR，AS —— 總初始底物濃度、R-初始底物濃度、S-初始底物濃度

B，BR，BS —— 總底物剩余濃度、R-底物剩余濃度、S-底物剩余濃度

C總，CR，CS —— 總轉(zhuǎn)化率、(R)-α-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率、(S)-α-苯乙醇的轉(zhuǎn)化率

eeR，eeS ——R-對(duì)映體過(guò)剩值、S-對(duì)映體過(guò)剩值

E—— 對(duì)映體選擇率

Km —— 酶反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)底物濃度的大小

R，S——R-對(duì)映體、S-對(duì)映體

Vmax —— 最大反應(yīng)速率