萬(wàn)莉，鄧曉風(fēng)，畢媛媛，唐玲，代青

（貴州省貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550081）

0 引言

自然流產(chǎn)是妊娠最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，且患者蛻膜組織中細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與CRT、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體作為影響主因。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子又稱血管通透因子，是一類特殊的細(xì)胞因子，廣泛分布于腦、心、肝、脾等組織和細(xì)胞中[1,2]。它在血管形成、腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展、動(dòng)脈粥樣硬化等方面有重要的調(diào)節(jié)作用。該蛋白質(zhì)在非肌肉組織中含量豐富，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要的鈣結(jié)合蛋白之一，參與蛋白質(zhì)分選的第二條途徑，協(xié)調(diào)一些膜表面蛋白，外分泌蛋白或者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白的折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)，存在于高等生物除紅細(xì)胞之外的所有細(xì)胞中[3-5]，結(jié)合鈣的能力強(qiáng)。經(jīng)體位實(shí)驗(yàn)研究并指導(dǎo)臨床盡早診斷本病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。由此，從技術(shù)層面，構(gòu)筑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究促進(jìn)流產(chǎn)的細(xì)胞分子機(jī)制，可為臨床指導(dǎo)流產(chǎn)提供新的參考?，F(xiàn)就相關(guān)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)分析總結(jié)如下。

1 材料和方法

1.1 一般材料

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立——篩選CCL4刺激濃度：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，置于37℃含5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，正常進(jìn)行細(xì)胞換液和傳代后，將CCL4按0、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L濃度梯度加入細(xì)胞中刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，利用qRT-PCR、Western Blotting、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞CRT、VEGF表達(dá)情況；通過(guò)合成si-CRT并轉(zhuǎn)染至小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞以檢測(cè)CRT mRNA及蛋白表達(dá)量，同時(shí)運(yùn)用qPCR技術(shù)來(lái)研究抑制CRT表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞因子VEGF表達(dá)后對(duì)蛻膜血管生成的影響。

1.2 方法

應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)，采用qPCR、Western Blotting、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，研究四氯化碳暴露引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并誘導(dǎo)小鼠蛻膜細(xì)胞表面CRT異常表達(dá)進(jìn)而抑制血管生成，最后促進(jìn)流產(chǎn)發(fā)生的分子機(jī)制。將妊娠期小鼠進(jìn)行四氯化碳處理后，將小鼠分為對(duì)照組及觀察組，利用qRT-PCR、Western Blotting、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞CRT表達(dá)情況；通過(guò)合成si-CRT并轉(zhuǎn)染至小鼠胎盤絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞以檢測(cè)CRT mRNA及蛋白表達(dá)量，同時(shí)運(yùn)用qPCR技術(shù)來(lái)研究抑制CRT表達(dá)后對(duì)蛻膜血管生成的影響。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）兩組CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平、VEGF表達(dá)水平；（2）觀察組稽留流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、正常早孕小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平；（3）觀察組小鼠CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析工具采用SPSS21.0軟件，計(jì)數(shù)資料用率[n(%)]表示，用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用（±s）表示，用t檢驗(yàn)或方差分析。P＜0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平比較

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促發(fā)相關(guān)細(xì)胞死亡途徑而導(dǎo)致CRT異常表達(dá)增高，通過(guò)敲低CRT表達(dá)后，研究小鼠蛻膜血管調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1所示。

表1 兩組CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平比較

2.2兩組VEGF表達(dá)水平比較

觀察組蛻膜組織、絨毛組織中VEGF表達(dá)水平均高于對(duì)照組（t=2.189，4.322，P＜0.05）。詳見(jiàn)表2所示。

表2 兩組VEGF表達(dá)水平比較（MOD，±s）

表2 兩組VEGF表達(dá)水平比較（MOD，±s）

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2.3 觀察組稽留流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、正常早孕小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平比較

觀察組稽留流產(chǎn)小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平低于先兆流產(chǎn)、正常早孕小鼠，先兆流產(chǎn)小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平低于正常早孕小鼠（F=7.638，P＜0.05）。詳見(jiàn)表3所示。

表3 觀察組稽留流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、正常早孕小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平比較（MOD，±s）

表3 觀察組稽留流產(chǎn)、先兆流產(chǎn)、正常早孕小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平比較（MOD，±s）

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2.4 觀察組小鼠CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性分析

觀察組小鼠CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平與蛻膜組織、絨毛組織中VEGF表達(dá)水平均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.569，0.678，P＜0.05）。詳見(jiàn)表4所示。

表4 觀察組小鼠CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平與VEGF表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

自然流產(chǎn)的發(fā)生受染色體、內(nèi)分泌、免疫、感染、環(huán)境、應(yīng)激等因素影響，目前尚缺乏有效的診斷和治療方法，因此，對(duì)自然流產(chǎn)發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制的探討有著重要的社會(huì)及臨床意義。VEGR表達(dá)下降或功能缺陷為自然流產(chǎn)發(fā)生的原因之一，且與CRT的高表達(dá)相關(guān)[7-11]。

本文研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促發(fā)相關(guān)細(xì)胞死亡途徑而導(dǎo)致CRT異常表達(dá)增高，通過(guò)敲低CRT表達(dá)后，研究小鼠蛻膜血管調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組蛻膜組織、絨毛組織中VEGF表達(dá)水平均高于對(duì)照組（t=2.189，4.322，P＜0.05）。觀察組稽留流產(chǎn)小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平低于先兆流產(chǎn)、正常早孕小鼠，先兆流產(chǎn)小鼠絨毛組織中VEGF表達(dá)水平低于正常早孕小鼠（F=7.638，P＜0.05）。觀察組小鼠CRT陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果及其水平與蛻膜組織、絨毛組織中VEGF表達(dá)水平均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.569，0.678，P＜0.05）。既往研究在本論題的研究成果進(jìn)一步表明，蛻膜組織中CRT異常表達(dá)，可能對(duì)流產(chǎn)進(jìn)程發(fā)揮著重要作用；Western Blotbing檢測(cè)患者蛻膜組織中CRT表達(dá)極顯著升高，CRT在脫膜組織中定位于細(xì)胞漿及胞膜呈陽(yáng)性表達(dá)，患者蛻膜組織中CRT的積分光密度值（integral optical density，IOD）水平；稽留流產(chǎn)組蛻膜組織中CRT與VEGF的IOD值 呈 負(fù) 相 關(guān)（r=-0.648，P=0.05），對(duì)照組患者蛻膜組織中CRT與VEGF的IOD值呈正相關(guān)（r=0.324，P=0.05）。

流產(chǎn)患者，可根據(jù)妊娠早期血清β-hCG水平及妊娠囊平均徑線及早進(jìn)行診斷和妊娠的終止；流產(chǎn)患者蛻膜組織中CRT表達(dá)較正常妊娠患者蛻膜增加；CRT與VEGF含量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，存在某種機(jī)制調(diào)節(jié)二者在蛻膜組織中的表達(dá)，共同作用母-胎界面上母體細(xì)胞穩(wěn)定的維持[12-15]。

近來(lái)研究表明[16-20]，在自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，大量錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白堆積于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，此時(shí)對(duì)分子伴侶的需求量增加，CRT的合成也相應(yīng)增加，CRT的vasostatin片段會(huì)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生，使得新生血管無(wú)法生成，抑制蛻膜血管的重建，從而引起自然流產(chǎn)；其作用表現(xiàn)在，細(xì)胞表面的鈣網(wǎng)織蛋白能夠和白細(xì)胞表面的HLA-DRB結(jié)合，刺激產(chǎn)生蛋白的自身抗體。據(jù)此研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)CRT異常表達(dá)，從而抑制蛻膜血管生成并引起流產(chǎn)的作用機(jī)制至關(guān)重要，具有良好的理論依據(jù)，也為預(yù)測(cè)自然流產(chǎn)患者提供有效借鑒。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)CRT高表達(dá)在自然流產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促發(fā)相關(guān)細(xì)胞死亡途徑而導(dǎo)致CRT異常表達(dá)增高最終導(dǎo)致流產(chǎn)；VEGF是血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子，在早期妊娠中起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)敲低CRT表達(dá)后，研究小鼠蛻膜血管調(diào)節(jié)因子的表達(dá)情況。