類晶晶，公茂慶，劉麗娟

山東省寄生蟲病防治研究所醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)部，山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 濟(jì)寧 272033

目前世界上有3 500 多種蚊蟲，其中一些種屬能夠作為媒介宿主傳播多種病原體，對人類和其他動(dòng)物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-2]。蚊蟲是絲蟲病、瘧疾、流行性乙型腦炎、黃熱病以及登革熱等多種疾病的傳播媒介，這些疾病給許多國家衛(wèi)生健康系統(tǒng)帶來沉重負(fù)擔(dān)，奪走了眾多生命[3]。

媒介控制是蚊媒疾病防控最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段[4]。蚊媒防控呈現(xiàn)多元化和綜合治理的特點(diǎn)，包括物理防治、化學(xué)防治、生物防治、遺傳防治、法規(guī)防治和環(huán)境治理等多種措施。其中生物殺蟲劑因綠色環(huán)保、安全性高等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。本文綜述了蚊蟲生物殺蟲劑的殺蟲機(jī)制及效果，以期為蚊蟲的防控提供參考。

1 細(xì)菌類殺蟲劑

在眾多媒介蚊蟲生物殺蟲劑中，細(xì)菌類生物殺蟲劑的應(yīng)用最為廣泛，目前已投入生產(chǎn)使用的主要有蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt）、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus,Bs）以及沃爾巴克氏菌（Wolbachia）三種。基于Bt和Bs的殺蟲劑主要適用于水體中孳生的蚊幼蟲防制，沃爾巴克氏菌則是憑借“以蚊制蚊”的策略對蚊蟲實(shí)施種群壓制。

1.1 蘇云金芽孢桿菌 作為目前應(yīng)用最成功、生產(chǎn)最廣泛的生物殺蟲制劑之一，蘇云金芽孢桿菌在其營養(yǎng)和孢子形成階段產(chǎn)生3 類殺蟲蛋白，包括孢子形成階段的Cry蛋白（晶體蛋白）和Cyt蛋白（溶細(xì)胞毒素蛋白），以及營養(yǎng)階段的Vip 蛋白（營養(yǎng)殺蟲蛋白）[5]。在蚊腸道堿性環(huán)境下，其芽孢內(nèi)伴孢晶體（由Cry 和Cyt 毒素組成）中的前毒素會轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)，破壞蚊幼蟲中腸腸壁后進(jìn)入血腔，產(chǎn)生敗血癥，導(dǎo)致蚊蟲死亡[6]。因此基于該菌的生物殺蟲劑被部分地區(qū)應(yīng)用于幼蚊的控制。全世界已發(fā)現(xiàn)的240 多種Cry 毒素對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目昆蟲均有活性[7]。

蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringi‐ensis var israelensis, Bti）于 1977 年被分離，主要通過具有特異性殺蟲活性的毒素蛋白發(fā)揮殺蟲作用。研究顯示，除了對人類致病的媒介按蚊、伊蚊和庫蚊，小菜蛾、草地貪夜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲也對Bti毒素敏感[8]。Bti對生態(tài)環(huán)境友好，長期使用不易產(chǎn)生抗藥性，在室內(nèi)和野外實(shí)驗(yàn)中，埃及伊蚊和白蚊伊蚊對蘇云金芽孢桿菌均未產(chǎn)生抗藥性[9-11]，Bti糖片制劑對耐藥性岡比亞按蚊仍然具有殺滅作用；目前僅鱗翅目昆蟲小菜蛾對Bti噴霧進(jìn)化出了田間抗性[12]。此外，Bti重組蛋白具有協(xié)同活性，如Bti的Cry10Aa 和Cyt2Ba 重組蛋白對埃及伊蚊的協(xié)同殺蚊活性增效至68.6 倍，是目前協(xié)同活性最強(qiáng)的毒素之一；重組蛋白Cyt2Ba 和Cry4Aa 之間也存在協(xié)同活性，但增效強(qiáng)度遠(yuǎn)不及前者[13]。Bti可與多種低毒化學(xué)試劑混合使用，能有效提高殺蟲效果，如將Bti與含有二銨磷酸二銨或尿素的化肥混合施用7～10天，能夠明顯降低稻田中蚊幼蟲的密度而不影響水稻生長，說明該技術(shù)在保證水稻產(chǎn)量的基礎(chǔ)上對控制蚊蟲密度具有一定的效果[14]。Bti與昆蟲不育技術(shù)（sterile insect technique, SIT）的聯(lián)合使用對白紋伊蚊具有較為突出的防制效果[15]。Bti制劑在害蟲防制中雖然具有顯著優(yōu)勢，但也存在一定的不足，如常規(guī)Bti殺蟲制劑缺乏長效性，且對不同蚊種的防制效果差異較大。為克服這一問題，研究者利用基因工程技術(shù)，將蘇云金芽孢桿菌CryIVD基因轉(zhuǎn)入藍(lán)藻，在實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場條件下均具有長效殺蟲效果[16]；另有研究者采用固體分散技術(shù)使Bti毒素緩慢釋放，持效期達(dá)六個(gè)月，對媒介伊蚊具有良好的長效防制效果[17]，但延長持效期的研究仍處于實(shí)驗(yàn)階段，還未有相關(guān)的商業(yè)化產(chǎn)品。雖然Bt的宿主特異性對非靶標(biāo)生物較為安全，但越來越多的研究提示該類殺蟲制劑的安全性需要進(jìn)一步評估[18]。

1.2 球形芽孢桿菌 球形芽孢桿菌（Bs）又稱球形賴氨酸芽孢桿菌（lysinibacillus sphaericus），由Kel‐len 于1965 年首次分離。該菌可產(chǎn)生二元毒素（bi‐nary toxin, Bin）、殺蚊毒素（mosquitocidal toxin,Mtx）以 及 兩 組 分 毒 素（two- component toxin）Cry48Aa/Cry49Aa 等殺蚊毒素蛋白從而實(shí)現(xiàn)對蚊幼蟲的毒殺作用。該菌被蚊幼蟲攝取后，感染蚊蟲的消化道繼而引發(fā)敗血癥，最終導(dǎo)致蚊蟲死亡。目前已鑒定的Bs中有9 個(gè)血清型16 種菌株對蚊幼蟲具有殺滅作用，基于Bs不同菌株的殺蟲制劑主要應(yīng)用于庫蚊的控制[19]。

Bti和Bs各有優(yōu)缺點(diǎn)，Bti的殺蟲譜廣，但Bs的持效期長，而且Bs處理過的蚊蟲死亡后，其體內(nèi)的Bs仍然能夠在環(huán)境中循環(huán)使用。Bs與Bti混合使用時(shí)，Bin和Cyt1Aa毒素表現(xiàn)為協(xié)同作用，對耐藥性致倦庫蚊和埃及伊蚊仍具有毒性[20]。采集自肯尼亞的岡比亞按蚊復(fù)合種群經(jīng)Bti和Bs處理后，易感性測試顯示對Bti和Bs完全敏感，且受試種群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[21]，但在淡色庫蚊中出現(xiàn)了抗藥性報(bào)道[22]。類似的結(jié)果在大劣按蚊中也有發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量Bs處理大劣按蚊后導(dǎo)致其繁殖力下降，在短期內(nèi)可降低蚊媒密度，但長期使用后大劣按蚊容易產(chǎn)生抗藥性[23]。細(xì)菌生物制劑的殺蟲效果易受生物因素和非生物因素的影響，對以Bti和Bs為基礎(chǔ)的幼蟲殺蟲劑藥效的研究發(fā)現(xiàn)，日照顯著降低了其殘留功效[24]。

1.3 沃爾巴克氏菌 沃爾巴克氏菌是一種胞內(nèi)共生菌，宿主范圍廣泛，可誘導(dǎo)產(chǎn)生胞質(zhì)不相容（cyto‐plasmic incompatibility,CI）現(xiàn)象，即自然環(huán)境中的雌蚊與沃爾巴克氏菌感染的雄蚊交配，產(chǎn)卵但不孵化，以此實(shí)現(xiàn)對媒介蚊蟲的種群壓制。通過釋放攜帶沃爾巴克氏菌的雄蟲達(dá)到控制靶標(biāo)昆蟲的技術(shù)稱為昆蟲不相容技術(shù)（incompatible insect technique,IIT）。

大量實(shí)驗(yàn)顯示，在蚊蟲的不同生長發(fā)育時(shí)期和不同的孳生棲息環(huán)境中，沃爾巴克氏菌對媒介蚊蟲的種群控制均具有良好的效果。將沃爾巴克氏菌所誘導(dǎo)的不育雄蚊在美國一個(gè)白紋伊蚊孳生地進(jìn)行釋放，結(jié)果顯示釋放后白紋伊蚊卵孵化率和雌蚊、雄蚊密度均低于釋放前[25]。在澳大利亞北部的實(shí)驗(yàn)顯示，定期釋放感染了白紋伊蚊體內(nèi)沃爾巴克氏體的雄性埃及伊蚊，對野生型（無沃爾巴克氏體）和攜帶沃爾巴克氏體的埃及伊蚊種群的壓制效率超過80%[26]。我國廣州建有世界最大的“蚊子工廠”，應(yīng)用昆蟲不相容技術(shù)結(jié)合昆蟲絕育技術(shù)可在小范圍內(nèi)對白紋伊蚊種群達(dá)到幾近消滅的程度，并可有效避免無意釋放的感染沃爾巴克氏體的雌蚊在野外成功繁殖[27]，一定區(qū)域內(nèi)取得良好的防制效果。此外，Ant[28]等在致倦庫蚊中發(fā)現(xiàn)兩種新的沃爾巴克氏菌感染方式（wAlbB 株單感染、wPip 株與wAlbA 株重復(fù)感染），在與野生型致倦庫蚊雜交后分別出現(xiàn)雙、單向胞質(zhì)不相容現(xiàn)象。此外，唾液腺的重復(fù)感染密度結(jié)果顯示，wAlbA 株是原生wPip株的400多倍，具有較好的病媒控制潛力。

與常規(guī)的生物殺蟲劑不同，沃爾巴克氏菌是從種群壓制的角度“以蚊制蚊”，見效緩慢，潛在風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。如感染沃爾巴克氏菌的跗斑庫蚊雖對裂谷熱病毒具有輕微抑制作用，但會增強(qiáng)其對西尼羅病毒的易感性[29-30]。最近研究發(fā)現(xiàn)，沃爾巴克氏菌會提高埃及伊蚊的熱敏感性，使其在高溫下更易快速死亡，這可能會限制病毒傳播給人類的地理范圍以及共生菌用于生物控制的能力[31]。受蚊蟲飼養(yǎng)規(guī)模和運(yùn)輸?shù)纫蛩氐南拗?，該方法目前難以大規(guī)模的生產(chǎn)和大范圍的投放。

2 病毒類殺蟲劑

除細(xì)菌外，一些病毒也對媒介蚊蟲的控制具有重要作用，其中以桿狀病毒和蚊濃核病毒（mosqui‐to densoviruses, MDVs）多見。它們對宿主特異性強(qiáng)，對人畜不具有危害性。這些病毒主要通過蚊幼蟲的中腸上皮細(xì)胞進(jìn)入體腔，進(jìn)入宿主細(xì)胞后大量繁殖，導(dǎo)致宿主死亡。

桿狀病毒可以特異性感染蚊幼蟲的中腸組織，誘導(dǎo)蚊蟲的死亡。桿狀病毒科核型多角體病毒（nu‐clear polyhedrosis viruses, NPV）被廣泛應(yīng)用于棉鈴蟲、舞毒蛾等農(nóng)林業(yè)害蟲的防制[32-33]。此外，作為一種高效的基因傳遞載體，桿狀病毒可以轉(zhuǎn)染到多種蚊子細(xì)胞中，比通常使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和經(jīng)典的質(zhì)粒DNA 方法更有效[34]。然而受生產(chǎn)方法、生產(chǎn)成本以及殺蟲速度等因素的限制，基于該病毒的殺蟲劑市場規(guī)模較小。

蚊濃核病毒入侵方式簡單。蚊幼蟲經(jīng)孳生水體感染，大多死于成蟲期前；受感染的成蚊雌蚊可以在產(chǎn)卵期間通過卵膜或分泌物將病毒粒子沉積到幼蟲環(huán)境中，這些病毒粒子會進(jìn)一步在未感染幼蟲與環(huán)境之間傳播[35]。該病毒主要作用于伊蚊幼蟲，且由病毒感染引起的幼蟲死亡率因蚊蟲種類和毒株的不同而具有差異。一種基于Bti和蚊濃核病毒協(xié)同增效作用的復(fù)合殺蚊油懸劑，在提高殺蚊效果的同時(shí)延緩了抗藥性的產(chǎn)生[36]。此外，一種重組埃及伊蚊濃核病毒的基因分析工具可實(shí)現(xiàn)在白紋伊蚊幼蟲體內(nèi)基因的表達(dá)和敲除[37]，提示蚊濃核病毒也可以是很好的基因載體工具。眾多研究表明，蚊濃核病毒在媒介蚊蟲控制方面有巨大潛能，但生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的研究空白以及較高的生產(chǎn)成本限制了其商業(yè)化[38]。

3 真菌類殺蟲劑

在媒介蚊蟲的控制上，病原性真菌也是不可或缺的一員。基于真菌的蚊蟲殺蟲劑種類繁多，與細(xì)菌類殺蟲劑不同，真菌類殺蟲劑無需蚊幼蟲經(jīng)口攝取，可穿透幼蟲體壁進(jìn)入體內(nèi)進(jìn)而導(dǎo)致蚊蟲死亡。這類殺蟲劑對成蚊也具有一定的毒性。常見的真菌包括金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、大鏈壺菌（Lagenidi‐um giganteum）、貴陽腐霉（Pythium guiyangense）和雕蝕菌屬（Coelomomyces）。盡管真菌的作用效果緩慢，但不易產(chǎn)生抗藥性。中國、美國以及南美洲和非洲一些國家都存在綠僵菌制劑殺蟲的安全使用記錄[39]。

3.1 綠僵菌、白僵菌 綠僵菌可寄生于多種昆蟲，尤其是在煙田害蟲防制上有巨大潛力，對媒介按蚊、伊蚊和庫蚊也有一定的致病性。天然綠僵菌菌株的殺滅速度緩慢，易受各種因素影響，往往不作為獨(dú)立的蚊蟲殺蟲劑。實(shí)驗(yàn)顯示，綠僵菌分生孢子與阿維菌素協(xié)同會改變埃及伊蚊的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，易感染真菌[40]；綠僵菌與印楝素組合可有效延長真菌半衰期同時(shí)提高其毒力[41]。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使綠僵菌表達(dá)昆蟲特異性毒素，能夠快速殺滅蚊蟲，且比轉(zhuǎn)基因蚊蟲效果更佳[42]。此外，與自然種群中埃及伊蚊雌蚊的接觸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雄蚊感染綠僵菌后接觸率明顯升高[43]，即綠僵菌有望同沃爾巴克氏菌一樣，成為一種蚊蟲防制的有效策略。

球孢白僵菌寄主范圍廣于綠僵菌，對淡色庫蚊、致倦庫蚊等多種蚊蟲[44-45]以及煙粉虱[46]等農(nóng)業(yè)害蟲具有殺滅作用。其作用機(jī)制主要是在眾多酶的助力下穿透宿主的表皮和角質(zhì)層進(jìn)入血淋巴，分泌大量殺蟲物質(zhì)對宿主產(chǎn)生殺滅作用[47]，并且白僵菌與蚊腸道菌群之間相互作用也可加速蚊蟲死亡[48]。利用基因重組技術(shù)，使球孢白僵菌表達(dá)蘇云金芽孢桿菌毒素Cyt2Ba，可顯著降低埃及伊蚊和白紋伊蚊的存活率和繁殖率[49]。除此之外，該菌還有降解氯氰菊酯[50]、抑制伊蚊體內(nèi)寨卡病毒復(fù)制[51]等優(yōu)點(diǎn)。

雖然白僵菌、綠僵菌已經(jīng)商品化生產(chǎn)，在某些害蟲防制中取得了較成功的經(jīng)驗(yàn)，但以兩者分生孢子為殺蟲活性的殺蟲劑對32~35 ℃的持久性高溫高度敏感，因此，為提高該類殺蟲劑穩(wěn)定性和持久性，應(yīng)篩選耐熱菌株，進(jìn)一步開發(fā)及優(yōu)化生產(chǎn)技術(shù)[52]。

3.2 大鏈壺菌、貴陽腐霉、雕蝕菌屬 大鏈壺菌以無性繁殖階段（游動(dòng)孢子）感染蚊幼蟲，侵入體內(nèi)后殺死宿主，且幼蚊死后體內(nèi)孢子對其他宿主仍具有感染性，即也可經(jīng)尸體繁殖傳播。一種基于大鏈壺菌的生物殺蟲劑曾在美國得到商業(yè)化并廣泛應(yīng)用，然而，由于該菌可引起健康犬感染，導(dǎo)致該產(chǎn)品不再出售和使用[53-54]。另外，大鏈壺菌對環(huán)境敏感，其殺蟲制劑易受溫度、鹽度等因素的影響。

貴陽腐霉分離自感染的白紋伊蚊，在水體中經(jīng)無性繁殖釋放游動(dòng)孢子，可選擇性識別和附著于水中蚊幼蟲的體表，繼而侵入體內(nèi)，對宿主產(chǎn)生機(jī)械損傷和營養(yǎng)掠奪，致使蚊蟲死亡[55]。該菌用于蚊蟲殺滅效果好、安全性高，在商業(yè)開發(fā)和工業(yè)生產(chǎn)中具有一定的優(yōu)勢。但貴陽腐霉的長效貯存條件影響因素眾多，菌種的保存方法需要進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化。為解決貴陽腐霉作用不穩(wěn)定和早期滅蚊效果緩慢的問題，蘇曉慶設(shè)計(jì)了海藻酸鈣微膠囊和菌絲體懸液兩種新劑型用于蚊蟲的生物防治[55]，目前還未形成商業(yè)化產(chǎn)品。

雕蝕菌屬包含70多種水生寄生真菌，其孢子可專性寄生于蚊科和搖蚊科幼蟲等水生昆蟲。感染雕蝕菌屬后，多數(shù)情況下幼蟲死亡，少數(shù)情況下受感染雌蚊幼蟲會存活至成蟲階段，出現(xiàn)可交配、不可產(chǎn)卵和可產(chǎn)真菌孢子的現(xiàn)象，產(chǎn)生的孢子可持續(xù)感染蚊幼蟲[56]。因此，雕飾菌屬可用于蚊蟲密度的控制，但受中間宿主劍水蚤的限制，商業(yè)化生產(chǎn)的難度大大增加。

4 其他生物制劑

植物精油多源自植物葉片，其中的活性化合物具有驅(qū)蚊、抑制生長發(fā)育、干擾味覺感受器官進(jìn)而影響其攝食功能等作用[57-58]，且基于植物精油的殺蟲劑對不同發(fā)育時(shí)期的蚊蟲均有效。一些萜類和苯丙烷類化合物具有滅蚊和殺菌的功效，多作為驅(qū)避劑的有效成分，在埃及伊蚊的密度控制上具有良好的效果[59-60]。樟科植物精油對埃及伊蚊和致倦庫蚊幼蟲具有殺滅作用，并可有效抑制一些細(xì)菌和真菌[61]。香茅中提取的香茅油，因其良好的驅(qū)蚊效果成為美國環(huán)保署注冊驅(qū)蚊劑，但穩(wěn)定性差[62]。源于印楝樹的印楝素作為殺蟲劑的活性成分具有廣譜、高效、易降解等多種優(yōu)勢，受到人們的青睞[63]；除蟲菊素取自除蟲菊花，不同于化學(xué)殺蟲劑擬除蟲菊酯，天然除蟲菊素為植物源性殺蟲劑，具有毒性低、安全性好、可再生等優(yōu)點(diǎn)[64]，但植物精油提取需要一定的過程，提取成本高昂，且有效成分含量不高。此外，環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)的食蚊羅索線蟲（Romanomer‐mis culicivorax），對伊蚊和庫蚊具有一定的感染力，一定濃度的線蟲也可有效控制岡比亞按蚊幼蟲[65]。新報(bào)告的水生新綠藻對庫蚊的發(fā)育具有抑制作用，有望作為一種新的生物制劑用于蚊媒的控制[66]。

5 結(jié)語與展望

當(dāng)前，人口流動(dòng)、經(jīng)濟(jì)全球化為媒介蚊蟲的防控帶來新的挑戰(zhàn)，蚊媒傳染病缺乏特異性疫苗和有效治療方法，且蚊媒防制方面的抗藥性問題日益凸顯。因此，強(qiáng)有力的監(jiān)測計(jì)劃和積極的病媒控制工作仍是限制蚊媒傳染病傳播的最佳方法[67]。相較于其他殺蟲劑而言，生物殺蟲劑在安全性、抗藥性以及環(huán)境保護(hù)等方面具有很大的優(yōu)勢，但受自身及其他因素影響，真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的生物殺蟲劑并不多。改進(jìn)和完善生物殺蟲劑的生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸和使用條件，以及如何在維持生態(tài)平衡的前提下發(fā)揮生物殺蟲劑的最大優(yōu)勢值得進(jìn)一步探索和研究。