◎ 陳春艷，李 姣

（火箭軍工程大學(xué)，陜西 西安 710038）

柑橘是被子植物門、雙子葉植物綱、蕓香目植物，在溫暖濕潤(rùn)氣候地方大量種植。柑橘中富含柚皮苷，這既是柑橘苦味的主要來(lái)源，同時(shí)也是柑橘中的藥用有效成分。本研究擬采用超高效液相色譜分析檢測(cè)漢中柑橘葉中的柚皮苷，得出柑橘葉中這種功能物質(zhì)的含量，評(píng)價(jià)柑橘葉是否具有分離提純柚皮苷的開發(fā)利用價(jià)值，為柑橘的綜合利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)[1-3]。柚皮苷，又為柚苷（柚皮甙），是一種雙氫黃酮類化合物，通過(guò)查閱文獻(xiàn)可知柚皮苷類化合物主要集中分布在果皮、果汁和果核中，含量?jī)H為1%～5%[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘葉樣品（柑橘園現(xiàn)摘）洗凈，經(jīng)烘箱60 ℃烘干、粉碎，過(guò)60目分樣篩，備用。

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98.7%），上海同田生物技術(shù)股份有限公司；甲醇（分析純），天津市登峰化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純），Burdick and Jackson公司；純水，杭州娃哈哈礦泉水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY-UPLC帶PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；SHIMADZU AUY220萬(wàn)分之一電子天平、SHIMADZU AUW220D十萬(wàn)分之一電子天平，日本島津公司；KQ100-DA超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；101-3A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，滬南電爐烘箱廠；ZN-02中草藥粉碎機(jī)，北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取適當(dāng)濃度的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在Waters ACQUITY PDA檢測(cè)器下進(jìn)行光譜掃描，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.2 樣品溶液制備

稱取柑橘葉1.00 g于100 mL的三角燒瓶中，加20 mL甲醇，超聲振蕩40 min，過(guò)濾溶液于50 mL容量瓶中，殘?jiān)?0 mL甲醇再提取2次，合并提取液并用甲醇定容，用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品2.6 mg，用甲醇溶解并定于10 mL的容量瓶，得到260 μg·mL-1的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)母液。分別取柚皮苷母液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為 2.6 μg·mL-1、5.2 μg·mL-1、10.4 μg·mL-1、20.8 μg·mL-1和 26.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）； 流 動(dòng) 相：A為 乙腈，B為純水；采用梯度洗脫：0～1 min，10% A，1～5 min，40% A，5～6 min，10% A；檢測(cè)波長(zhǎng)：288 nm；流速：0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：5 μL，柱溫：30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長(zhǎng)的確定

在Waters ACQUITY PDA檢測(cè)器下對(duì)柚皮苷進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。為保證實(shí)驗(yàn)的靈敏度和被測(cè)組分的準(zhǔn)確性，經(jīng)參考其他文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)在288 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)[5]。

圖1 柚皮苷的紫外掃描圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍考察

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，按上述色譜條件依次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定其各自色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線[14]。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=155.113X-793.126，r=0.998 947，表明柚皮苷在2.6～26.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

圖2 柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2.2 精密度考察

取同一柑橘葉樣品，按上述方法制備樣品，在上述色譜條件下平行測(cè)定5次，每次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定橙皮苷的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的精密度。測(cè)得柚皮苷的峰面積分別為13 393.9、12 186.6、12 588.7、13 156.5和13 045.2，計(jì)算得到其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.75%；RSD＜5.0%，表明在該條件下方法精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性考察

取同一柑橘葉試樣，在上述色譜條件下，分別于0.5 h、1.0 h、6.0 h、12.0 h和 24.0 h進(jìn)樣 5 μL檢測(cè)柚皮苷的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以考察方法的穩(wěn)定性。測(cè)得柚皮苷的峰面積分別為12 623.7、12 735.8、12 977.4、12 895.6和12 932.5，計(jì)算得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.16%；RSD＜3%，表明在該條件下方法穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性考察

取5個(gè)柑橘葉樣品，按上述方法制備樣品，在上述色譜條件下測(cè)定，每個(gè)樣進(jìn)樣5 μL，測(cè)定橙皮苷的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的重復(fù)性。測(cè)得5個(gè)柑橘葉中柚皮苷的峰面積分別為12 286.5、12 347.8、12 154.7、12 433.2和12 154.1，計(jì)算得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.99%；RSD＜3%，表明在該條件下重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率考察

精密稱取已測(cè)定柚皮苷含量為4.2 mg·kg-1的柑橘葉試樣1.0 g，加入260.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品母液2 mL，按上述方法制備平行制備3個(gè)樣品，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算該方法的回收率。柚皮苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，該分析方法的平均回收率為99.35%，表明方法準(zhǔn)確性良好；回收率的RSD為4.03%＜5%，表明該回收率實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，該檢測(cè)結(jié)果可信。

表1 柚皮苷回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 樣品溶液的測(cè)定

樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，上機(jī)檢測(cè)，色譜圖見圖3。由標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖可知2.51 min峰為柚皮苷。

圖3 柑橘葉中柚皮苷分析色譜圖

3 結(jié)論

本文以柑橘葉為原料，采用超高效液相色譜對(duì)其中的柚皮苷進(jìn)行定性、定量分析，為柑橘葉的綜合利用提供準(zhǔn)確的信息。柑橘葉子全年不凋零，若其中柚皮苷含量高且穩(wěn)定，就可全年批量生產(chǎn)提取，更好地研究利用柑橘葉中柚皮苷。