◎ 倪帆呈，江喜梅，李金貴，楊雙旭，周炎花

（1.漳州科技職業(yè)學(xué)院，福建 漳浦 363200；2.南京融點(diǎn)食品科技有限公司，江蘇 南京 211399）

丹參，是指唇形科的多年生草本丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根莖或根。丹參酮、丹參素、丹酚酸、維生素E[1-2]、黃酮類和異黃酮類等化合物均為其主要的活性成分。其中，黃酮具有抗腫瘤、消炎、降血脂、保護(hù)神經(jīng)和抗高血脂等藥理作用[3-6]。當(dāng)前，常見的黃酮提取方法有酶輔助提取、溶劑浸提法、高速剪切法、回流提取法、超臨萃取法、超聲提取法、發(fā)酵法和微波輔助法[7-10]等。

裕丹參享有“丹參之首”的美稱，是地理標(biāo)志產(chǎn)品（GB/T 22745—2008）。目前研究主要集中于其最主要的兩個(gè)成分丹參酚酸和丹參酮[11-12]等，總黃酮的研究較少。本文以裕丹參根為主要原材料，采用超聲波輔助提取黃酮類化合物，以期通過本研究，為促進(jìn)丹參經(jīng)濟(jì)價(jià)值提升及后續(xù)相關(guān)研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

裕丹參購于河南省方城縣中藥公司；95%乙醇；AlCl3（上海試劑四廠）；KAc（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁等化學(xué)試劑均為分析純。

JA3003A分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；V-1600可見分光光度儀（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理方法

參考文獻(xiàn)[13-14]方法，將裕丹參根粉碎，稱取其粗粉2 g，置于錐形瓶中，加入適量一定濃度的乙醇溶液，混勻。置于一定溫度下恒溫水浴，冷凝回流，經(jīng)一定提取時(shí)間，趁熱減壓抽濾。將合并提取液置于100 mL容量瓶，用與提取時(shí)相同濃度的乙醇溶液定容，作待測液備用。

1.2.2 總黃酮含量的測定方法

（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15]，采用AlCl3-KAc法測定總黃酮含量。稱取0.011 g蘆丁，用95%乙醇定容至50 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)液。再取20 mL標(biāo)準(zhǔn)液，95%乙醇定容至100 mL，作工作液。分別取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL工作液于50 mL容量瓶中，分別向瓶中加2 mL 2.5% AlCl3和9.82% KAc搖勻，30%乙醇定容，靜置30 min于415 nm下測量吸光值。以濃度C（mg·mL-1）為縱坐標(biāo)，以吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程C=1.263 6A+0.000 9，R2=0.999 8（n=6）。

（2）裕丹參根黃酮水分含量的測定。參照《中國藥典》（2020版）通則0832第二法進(jìn)行。以減失的裕丹參重量為根據(jù)，計(jì)算其粗粉含水量（%）。

（3）黃酮的提取與測定。取1 mL提取液至50 mL容量瓶中，參照（1）方法測溶液吸光度，對照回歸方程得到黃酮的濃度。裕丹參根黃酮的提取率計(jì)算公式為

式中：C為總黃酮濃度，mg·mL-1；V為樣品提取液第一次定容的體積，mL；X為稀釋倍數(shù)；m為樣品干重，g。

1.3 黃酮提取工藝的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

傳統(tǒng)的水煎煮法提取黃酮存在提取時(shí)間過長、產(chǎn)品易腐敗等缺點(diǎn)[16]。本法采用乙醇作為溶劑，在此基礎(chǔ)上采用超聲波輔助提取黃酮，將溫度、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度4個(gè)因素作為考察對象，其中超聲波功率為250 W，各因素的考察范圍如表1所示。

表1 超聲波提取法單因素實(shí)驗(yàn)各因素的考察范圍列表

1.3.2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，系統(tǒng)考察提取溫度、料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度對裕丹參根黃酮提取率的影響，實(shí)驗(yàn)因素水平如表2所示。

表2 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 裕丹參粗粉的水分含量

根據(jù)1.2.2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測得裕丹參粗粉的水分含量為9.918%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 溫度對裕丹參根黃酮提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)提取溫度低于60 ℃時(shí)，黃酮提取率呈上升趨勢，這可能是溫度升高致使裕丹參根黃酮溶解，進(jìn)而提取率增加[17]。但當(dāng)提取溫度超過60 ℃后，黃酮提取率開始下降。這可能是過高的溫度使部分對溫度變化比較敏感的黃酮類物質(zhì)，如酚式結(jié)構(gòu)類被破壞，提取率下降[18]。當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，黃酮提取率最高。故最適宜提取溫度為60 ℃。

圖1 提取溫度對丹參根黃酮得率的影響圖

2.2.2 料液比對裕丹參根黃酮提取率的影響

由圖2可知，料液比（g∶mL）在1∶20時(shí)，裕丹參根黃酮提取率達(dá)到最大，后隨料液比的增大而呈下降趨勢。一定范圍內(nèi)，料液比的增加會促進(jìn)黃酮物質(zhì)的溶解，后隨著料液比的增加，則會出現(xiàn)雜質(zhì)增加、黃酮類物質(zhì)的極性發(fā)生改變和結(jié)構(gòu)被破壞等情況，從而引起提取率的降低[19]。故料液比為1∶20時(shí)較為適宜。

圖2 料液比對裕丹參根黃酮得率的影響圖

2.2.3 提取時(shí)間對裕丹參根黃酮提取率的影響

由圖3可知，提取時(shí)間小于40 min時(shí)提取率無明顯的增加，在提取時(shí)間為50 min時(shí)提取率最低且提取時(shí)間的延長可能會破壞部分黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)。出于時(shí)間和能效因素考慮，將提取時(shí)間定為20 min為宜。

圖3 提取時(shí)間對裕丹參根黃酮得率的影響圖

2.2.4 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，丹參黃酮提取率整體上波動較小。在乙醇濃度為70%時(shí)，提取率達(dá)到最大；大于70%時(shí)，提取率出現(xiàn)一定的下降。黃酮類物質(zhì)的組分及其性質(zhì)對提取率有一定的影響，如在熱水中黃酮苷類溶解度高，在醇等溶劑中黃酮苷元溶解度高[20]。另外，溶劑的極性對黃酮的提取效率也有一定的影響[21]。由結(jié)果看來，整體影響較小，故出于成本因素考慮，將乙醇濃度定為50%較為適宜。

圖4 乙醇濃度對裕丹參根黃酮得率的影響圖

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3和表4可知，影響裕丹參根黃酮得率因素的主次順序?yàn)榱弦罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間＞乙醇濃度，其中料液比對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05）。最佳組合為A1B1C3D3，由于乙醇濃度對結(jié)果影響不顯著，出于節(jié)約材料考慮，故最終選取工藝為A1B1C3D1，即料液比（g∶mL）為1∶10，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為40 min，乙醇濃度為50%。以此最佳條件下，提取率達(dá)到4.81%。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4 方差分析表

3 結(jié)論

（1）以超聲輔助提取裕丹參根總黃酮方案是可行的。料液比在4個(gè)考察因素中（提取溫度、料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度）料液比對結(jié)果的影響最大。不同因素對其提取率影響大小可能與此類黃酮的結(jié)構(gòu)和極性有一定的關(guān)系，需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證與研究。

（2）以黃酮得率為指標(biāo)，通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)確定提取裕丹參根黃酮的最佳工藝為料液比1∶10、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間40 min、乙醇濃度50%，其黃酮提取率達(dá)到4.81%。

（3）在提取裕丹參根黃酮方面，超聲輔助提取法較水煎煮法具有用時(shí)更短、提取效率高、節(jié)省樣品等優(yōu)點(diǎn)。