司馬學琴 蘇延停 曾智

1湖北科技學院基礎醫(yī)學院（湖北 咸寧 437100）；2咸寧市中心醫(yī)院病理科（湖北 咸寧 437100）

在結直腸癌（colorectal cancer，CRC）中，抑制RAS-RAF-MAPK信號通路是CRC重要治療方法之一［1］。其中Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，KRAS）基因為RAS家族的原癌基因之一，是CRC中重要的致癌基因，當其突變后可持續(xù)激活表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號通路，使上游驅(qū)動蛋白作用及EGFR靶向藥物失效［2］。鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murinesar-coma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因位于KRAS基因的下游，同屬于RAS-RAF-MAPK信號通路［3］。研究發(fā)現(xiàn)KRAS及BARF基因突變是CRC不良預后的重要影響因素，KRAS基因突變與腫瘤的分化、侵襲轉(zhuǎn)移等明顯相關［4］。BARF基因突變則作為CRC預后風險分級的重要指標，與患者的不良預后明顯相關［5］。故在2021版《結直腸癌分子檢測高通量測序中國專家共識》中對于確診的CRC患者，應檢測KRAS和BRAF基因表達情況，以便對預后進行分層，指導臨床治療［6］。因此準確檢測CRC中KRAS及BRAF的基因狀態(tài)非常關鍵。

二代測序在基因檢測方面具有靈敏度高，檢測范圍廣等優(yōu)勢，在CRC不同標本中KRAS及BARF基因檢測的一致性較高［7］。同時NGS還可以提供定量的等位基因突變頻率，預測腫瘤異質(zhì)性，對腫瘤的治療有一定的指導意義［8］。目前使用二代測序測定KRAS及BARF基因突變已用于指導藥物治療中，但是在同一樣本量中相關研究主要局限在與臨床病理特征關系、預后、影響因素等某一方面。本研究將KRAS及BARF基因表達與臨床特征的關系、療效、預后及其影響因素相結合，有助于尋找CRC中具有預測意義的生物標志物及早期的治療療效判斷。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2020年1月在咸寧市中心醫(yī)院就診的60例CRC患者作為研究對象，所有患者均需按照中華醫(yī)學會腫瘤學分會“中國結直腸癌診療規(guī)范（2015版）”的診斷標準明確診斷，并進行分型［9］。入選標準：（1）患者可明確診斷并進行準確分型，臨床治療資料完整；（2）在我院進行規(guī)范化治療4 ～ 8周期；（3）配合隨訪；（4）治療期間無嚴重不良事件發(fā)生。排除標準：（1）存在CRC以外的惡性腫瘤；（2）腦轉(zhuǎn)移患者。本研究獲我院倫理委員會批準同意（倫理號：20180808-011），所有患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 CRC患者臨床病理學特征 （1）年齡、性別從患者住院病歷中的人口統(tǒng)計學信息中收集。（2）原發(fā)部位及病理分型從患者病理報告中收集。（3）T分期：T1為腫瘤侵及黏膜下層；T2為腫瘤侵及腸壁固有肌層；T3為腫瘤侵透固有肌層并達漿膜處；T4為腫瘤已穿透腹膜或侵入其他器官。（4）N分期：N0為區(qū)域內(nèi)無淋巴結轉(zhuǎn)移；N1為區(qū)域內(nèi)有1～3個淋巴結轉(zhuǎn)移；N2為區(qū)域內(nèi)有4個及以上淋巴結轉(zhuǎn)移。（5）腫瘤大?。涸谥委熐斑M行影像學檢查，由研究醫(yī)生及影像科醫(yī)生共同測量。（6）治療方案：①FOLFOX+Bev方案為：D1奧沙利鉑85 mg/m2；D1亞葉酸鈣400 mg/m2；D1貝伐珠單抗5 mg/kg，每2周重復使用；D1氟尿嘧啶400 mg/m2，D2～3氟尿嘧啶1 200 mg/m2；②XELOX+Bev方案為：D1奧沙利鉑130 mg/m2；D1～D14 卡培他濱1 000 mg/m2，休息7 d；D1貝伐珠單抗7.5 mg/kg，每3周重復使用；③FOLFIRI+Bev方案為D1伊立替康180 mg/m2；D1亞葉酸鈣400 mg/m2；D1貝伐珠單抗5 mg/kg，每2周重復使用；D1氟尿嘧啶400 mg/m2，D2～3氟尿嘧啶1 200 mg/m2。

1.3 治療療效判定 （1）完全緩解：所有靶病灶消失，無新發(fā)靶病灶，且持續(xù)4周以上；（2）部分緩解：腫瘤靶病灶的最大徑之和減少30%以上，且持續(xù)4周以上；（3）疾病穩(wěn)定：腫瘤靶病灶無明顯變化；（4）腫瘤靶病灶的最大徑之和增加20%以上，或出現(xiàn)新發(fā)病灶。客觀緩解率=（完全緩解+部分緩解）例數(shù)/總例數(shù)×100%，疾病控制率=（完全緩解+部分緩解+疾病穩(wěn)定）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 患者隨訪 患者出院后均進行電話或門診隨訪，隨訪截止時間為2021年12月1日?？偵嫫冢╫verall survival，OS）為患者從明確診斷為CRC至患者死亡或隨訪終止的時間；無進展生存期（progression free survival，PFS）為患者從明確診斷為CRC至患者疾病進展或死亡的總時間。

1.5 NGS檢測基因突變

1.5.1 基因組DNA提取 準備5片厚度為5 μm的石蠟切塊，切取臘卷至離心管中，加入1 mL的二甲苯，震蕩混勻后8 000 rpm離心1 min棄上清，重復2遍；加入1 mL乙醇，震蕩混勻后8 000 rpm離心1 min棄上清，重復2遍，低溫烘干后再離心管中中加入180 μL ATL緩沖液和20 μL蛋白酶K，混勻后56℃孵育12 h至完全消化，8 000 rpm離心1 min棄上清，加入200 μL ATL緩沖液，震蕩混勻后70℃孵育10min。8000rpm離心1min棄上清，再加入200μL乙醇，混勻后，將其轉(zhuǎn)移至QIAamp Mini spin column中，8 000 rpm，1 min離心，依次加入500 μL緩沖液Awl，8 000 rpm，1 min離心，加入500 μL緩沖液AW2，再次14 000 rpm，3 min離心，最后將QIAamp Mini spin column放入1.5 mL的離心管中，加入100 μL緩沖液AE，室溫靜置40 min，8 000 rpm，1 min離心。使用紫外分光光度儀測量提取的DNA的濃度及純度。

1.5.2 NGS基因突變檢測 使用NextDaySeq結腸癌panel進行NGS，抽取10 ng基因組DNA作為PCR模板，加入4 μL的5 x AmpliSeq HiFi Master Mix及10 μL的2 x NextDaySeq Primer Pool進行PCR雜交反應，使用FuPa酶去除雜交后無用的引物序列，PCR擴增子加入接頭及標簽，對連接后的產(chǎn)物使用AMPure XP磁珠進行純化定量，各樣本稀釋至100 pmol后，取3 μL混合后即得到文庫。將緩沖液、酶及ISP磁珠按照比例混合后進行單克隆PCR，對模板進行富集，加入測序引物及引物酶至芯片中，上機檢測。

1.5.3 結果判定 （1）突變型（mutant type，MT）：NGS檢測出任一基因突變?yōu)橥蛔冃?；?）野生型（wild type，WT）：未檢測出任何基因突變?yōu)橐吧汀?/p>

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗。單因素及多因素Cox風險回歸模型分析影響CRC患者OS的因素，Kaplan-Meier法分析CRC患者的OS及PFS，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KRAS和BRAF基因不同外顯子突變情況 60例結直腸癌患者的KRAS基因突變率為41.7%（25/60），其中第2外顯子的突變率為35.0%（21/60），第3外顯子的突變率為1.7%（1/60），第4外顯子的突變率為5.0%（3/60）。BRAF基因突變率為8.3%（5/60），全部為15外顯子突變。

表1 KRAS和BRAF基因不同外顯子突變發(fā)生率Tab.1 Incidence of mutations in different exons of KRAS and BRAF genes

2.2 CRC組織中KRAS及BRAF基因突變與患者臨床病理特征的相關性 KRAS突變與患者的性別、年齡、原發(fā)部位、T分期、腫瘤大小、治療方案及遠處轉(zhuǎn)移無關，與病理分型及N分期明顯相關，KRAS突變在中/高分化患者中的比例明顯高于低/未分化患者，且在N2患者中KRAS突變比例較少。BRAF基因突變主要與病理分型及遠處轉(zhuǎn)移有關，在中/高分化患者及有遠處轉(zhuǎn)移患者中占比較高。

表2 CRC組織中KRAS及BRAF基因突變與患者臨床病理特征的相關性Tab.2 Correlation between KRAS and BRAF gene mutations in CRC and clinicopathological features of patients 例

2.3 CRC患者OS影響因素的Cox風險回歸模型 單因素分析結果顯示疾病的病理分型、T分期、N分期、腫瘤大小、KRAS及BRAF突變與CRC患者的OS有關（P＜0.05）。以上因素建立多因素Cox風險回歸模型，結果顯示病理分型、T分期、N分期、BRAF突變是影響患者OS的獨立影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 CRC患者OS影響因素的Cox風險回歸模型Tab.3 COX risk regression model for influencing factors of OS in CRC patients

2.4 KRAS及BARF突變及野生型患者的總體療效 60例CRC患者中完全緩解5例，部分緩解13例，疾病穩(wěn)定26例，疾病進展16例。KRAS基因突變患者的疾病進展例數(shù)及疾病控制率明顯低于野生型患者（P＜0.05），BARF突變或野生患者的疾病總體療效差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 KRAS及BARF突變及野生型患者的總體療效Tab.4 Overall outcomes in KRAS and BARF mutations and wild-type patients 例（%）

2.5 KRAS及BRAF基因不同表達情況下患者的OS及PFS KRAS突變患者的OS及PFS與野生型患者相比差異均無統(tǒng)計學意義（χ2=0.458，P=0.498）、（χ2=3.126，P=0.077），BRAF突變患者的OS及PFS均明顯低于野生型患者（χ2=10.3，P=0.001）、（χ2=8.416，P=0.004），見圖1。

圖1 KRAS及BRAF基因不同表達狀態(tài)下患者的OS及PFSFig.1 OS and PFS of patients with different expressions of KRAS and BRAF genes

3 討論

CRC作為最常見的消化道惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病機制尚未完全明確［10］。除手術治療之外，針對基因的分子靶向藥物及生物制劑的應用也顯著提高了CRC的預后。KRAS基因作為一種致癌基因，當KRAS突變后，自身處于活化狀態(tài)，無法阻斷EFGR上游信號，影響血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抑制劑的治療效果［11］。KRAS的基因突變主要表現(xiàn)為點突變及基因擴增，點突變主要以第2外顯子上的11及12密碼子為主，占比96%以上［12］。由于KRAS基因突變率在CRC患者中比例較高，約為30%～50%［13］。故眾多針對KRAS突變患者的臨床試驗也在開展，結果顯示KRAS突變抑制劑單用及聯(lián)合使用均有良好的治療效果，進一步提示KRAS基因在CRC治療中的重要性［14］。在本研究中60例CRC患者的KRAS基因突變率為41.7%，其中第2外顯子的突變率為84.0%，與相關報道類似。BRAF負責編碼RAF激酶蛋白，屬于致癌基因的一種［15］。BRAF基因突變主要為第11外顯子及15外顯子上的突變，第15外顯子上的V600E密碼子突變約占突變類型的90%［16］。據(jù)報道在CRC中BRAF的突變率約為4.7%～20%［17］。雖然BRAF突變率較低，但是多數(shù)研究認為BARF突變是西妥昔單抗或帕尼單抗治療CRC失敗的主要原因，且BRAF基因突變可作為西妥昔單抗或帕尼單抗治療療效的獨立預測因素［18］。本研究結果顯示BRAF突變率為8.3%，全部均為第15外顯子上的V600E密碼子突變，與之前的報道基本吻合。在KRAS及BARF突變的檢測中二代測序不僅具有高通量、高敏感度及低成本的優(yōu)點，且已證實與免疫組織化學等檢測結果具有高度的一致性［19］。目前已有研究使用血樣樣本進行二代測序，更有利于不易獲得腫瘤樣本組織的患者，且對于有爭議性的結果可使用其他樣本復核，保證結果的準確性。但是據(jù)報道在原發(fā)及轉(zhuǎn)移性病灶中，二代測序會顯示出不同的基因突變結果，影響藥物的選擇［20］。在今后的研究中可使用不同方法檢測原發(fā)、轉(zhuǎn)移性腫瘤組織及外周血，并進行一致性比較，以供參考選擇。

關于KRAS及BRAF突變與CRC患者的病理體征的關系相關性研究較多，但是結果則不盡相同。ZAHRANI等［21］在阿拉伯地區(qū)的150例CRC患者中研究KRAS突變與疾病分期及發(fā)生部位有關。國內(nèi)的孫耀華等［22］發(fā)現(xiàn)1 205例CRC患者中發(fā)現(xiàn)KRAS突變更易發(fā)生在黏液腺癌及中高分化的患者中。XI等［23］在1 694例CRC患者中發(fā)現(xiàn)BRAF突變與原發(fā)部位為右半結腸、腹膜轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移等相關。劉建化等［24］在281例CRC中發(fā)現(xiàn)BARF突變在女性及右半結腸癌患者中比例較高。不同研究結果可能與納入人群的數(shù)量及遺傳背景不同有關。在本研究中KRAS突變在病理分型及淋巴結轉(zhuǎn)移有關，在中/高分化患者及區(qū)域內(nèi)淋巴結轉(zhuǎn)移較少的患者中占比較高，BRAF基因突變主要與病理分型及遠處轉(zhuǎn)移有關，在中/高分化患者及有遠處轉(zhuǎn)移患者中占比較高。

目前KRAS突變對CRC患者接受抗VEGF治療效果仍存在爭議，CHIDA等［25］在1 632例CRC患者發(fā)現(xiàn)KRAS G12C突變型患者的一線OS及PFS均低于非突變組（PFS中位數(shù)：9.4個月vs.10.8個月；OS中位數(shù)：21.1個月vs.27.3個月）組與非G12C組患者特征無明顯差異，多因素分析也顯示KRAS G12C突變預示了患者較短的PFS及OS。在另一項研究中，223例轉(zhuǎn)移性結直腸癌中，KRAS突變降低患者OS，可作為預后預測的獨立因素，但是不影響患者的PFS［26］。本研究結果顯示KRAS突變或野生狀態(tài)不影響患者的OS及PFS，且不影響患者的OS，不能作為預測患者預后的不良因素，可能與納入樣本量有關。BRAF基因突變與患者的預后明顯相關，AHN等［27］報道BRAF突變患者的5年生存率顯著降低。一項對26例結直腸癌患者的薈萃分析發(fā)現(xiàn)BRAF突變使死亡風險增加了一倍多（HR=2.25，95%CI：1.82 ～ 2.83），BRAF突變是影響結直腸癌患者生存的絕對危險因素［28］。本研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與患者的OS無相關性，與BRAF基因突變呈負相關，提示BRAF基因突變可作為CRC預后指標及獨立風險因素。

綜上所述，在CRC中，KRAS與BRAF突變與患者的臨床病理特征關系密切，且一定程度影響患者預后，但是本研究仍有一定的局限性，如在不同分期的腫瘤患者中基因突變對藥物選擇及預后等的指導意義不一，在以后的研究中更應進行分層研究，為臨床治療提供參考。