張亦，王亮*，呂自力，鞏小芬，鄧凱文，吳濤，顧雅純,梁采瑩

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212000）（2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院/附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川成都 610000）

開菲爾最初由高加索地區(qū)的牧民將牛羊乳置于羊皮袋中發(fā)酵制得。經(jīng)過不斷補(bǔ)加底物，最終在羊皮袋壁上形成的許多的膠狀顆粒，即開菲爾粒[1]。開菲爾粒呈乳白色，形似花椰菜，直徑范圍為0.3～3 cm[2]，主要由水、蛋白質(zhì)及多糖等物質(zhì)構(gòu)成[3]。作為一種天然菌種發(fā)酵劑，開菲爾粒中定植多種微生物，且開菲爾粒的來源不同，其內(nèi)部的微生物構(gòu)成差異也較為明顯。因此，開菲爾粒菌群構(gòu)成呈多樣化、不固定等特點(diǎn)。開菲爾具有降解乳糖、降低膽固醇和血壓、修復(fù)肝臟功能和增加免疫力等功能[4]。經(jīng)過開菲爾粒的發(fā)酵作用，牛乳中的各種營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生了不同程度的降解，并進(jìn)一步生成醇、醛、酸、酮、酯等揮發(fā)性香氣物質(zhì)[5]。

開菲爾粒直接生產(chǎn)開菲爾，其增殖速度有一定限制，菌種組成易變，使發(fā)酵后產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定性無法保證。乳酸菌在開菲爾粒中數(shù)量最多，可以顯著改善發(fā)酵乳的酸度和粘度。酵母菌經(jīng)過發(fā)酵會(huì)生成乙醇和CO2，豐富產(chǎn)品風(fēng)味，其存在是開菲爾粒與酸乳發(fā)酵劑的最大差異，但酵母菌含量過高，會(huì)產(chǎn)生酵母異味[6]。為解決開菲爾大規(guī)模生產(chǎn)存在的問題，研究者們開展大量研究。Gadaga 等[7]利用分離得到的酵母菌和乳酸菌復(fù)配發(fā)酵牛乳后，與自然發(fā)酵乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相比較，發(fā)現(xiàn)前者的風(fēng)味和口感更好。Agat[8]等對比分析不同菌種發(fā)酵過程中的pH 值、乙醇含量、質(zhì)地等指標(biāo)，最終發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactissubsp.cremoris和Saccharomycesfragilis發(fā)酵制得的山羊酸奶整體質(zhì)量最佳。

本研究通過對10 種開菲爾粒中分離菌種進(jìn)行篩選，將獲得的菌種按一定比例復(fù)配，研制出最接近開菲爾粒發(fā)酵效果的發(fā)酵劑，對探究和生產(chǎn)具有開菲爾風(fēng)味的發(fā)酵劑具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

開菲爾粒采集于新疆地區(qū)，分別命名為B、D、F、K、M、N、S、T、X、Y；純牛乳購自內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；De Man Rogosa Sharpe（MRS）培養(yǎng)基、Yeast extract Peptone Dextrose（YPD）培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司；2,3,5-Triphenyte-trazoliumchloride（TTC）平板培養(yǎng)基：TTC 0.5 g/L，葡糖糖5 g/L，瓊脂50 g/L。

1.2 主要儀器設(shè)備

5418R 高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Bio-rad T100 梯度PCR 儀、瓊脂糖凝膠電泳儀，美國Bio-rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene 有限公司；HP6890/5973 氣相色譜-質(zhì)譜、SPME-57328 頂空固相微萃取、7890B 氣相色譜儀，美國Agilent 公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systerm 公司。

1.3 開菲爾粒的采集與活化

將采集的開菲爾粒存放于100 mL 離心管中，并添加60 mL 純牛乳，保存于4 ℃。收集結(jié)束后濾去牛乳，用滅菌后0.85wt% NaCl 溶液沖洗開菲爾粒，5%（m/V）重新活化于純牛乳中，140 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h。循環(huán)培養(yǎng)6 次至pH 值穩(wěn)定。

1.4 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

取新鮮活化出的開菲爾液1 mL及充分研磨的開菲爾粒（約1 cm3）共同稀釋于9 mL 0.85wt% NaCl（m/m）溶液中。經(jīng)過梯度稀釋后，將上述接種液分別涂布于MRS 培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)48 h 和YPD 培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)48 h。挑取不同菌落在相應(yīng)的培養(yǎng)基上分離純化3次。然后，對不同菌落的DNA 進(jìn)行提取并PCR 擴(kuò)增，所用引物為通用引物27F（agagtttgatcctggctcag）和1492R（tacggctaccttgttacgactt）[9]。采用1.0wt%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 反應(yīng)效果，選擇條帶明顯的待測菌株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測序。在Genbank 檢索系統(tǒng)，將待測菌株的測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對和同源性分析，從而確定所分離的菌種信息。

1.5 乳酸菌的篩選

1.5.1 產(chǎn)香能力及蛋白分解能力測定

分別測定不同單菌發(fā)酵乳中乙醛、雙乙酰[10]及氨基氮的含量[11]，獲得優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株。

1.5.2 全質(zhì)構(gòu)分析

參照Domaga?a 等[12]的方法，測定不同乳酸菌單菌發(fā)酵乳的全質(zhì)構(gòu)指標(biāo)包括硬度、稠度、凝聚性和粘性。

1.6 酵母菌的篩選

1.6.1 產(chǎn)乙醇能力測定

參照如意[13]的方法，測定22株酵母菌的產(chǎn)香能力。酵母菌菌液稀釋涂布于YPD 培養(yǎng)基中，于28 ℃倒置培養(yǎng)2 d 后，選擇菌落數(shù)約為100～300 的平板，往上倒入冷卻至室溫的15 mL TTC 培養(yǎng)基，于28 ℃條件下培養(yǎng)。記錄4 h 內(nèi)，每小時(shí)培養(yǎng)基中菌落周圍顏色的變化，一般認(rèn)為，顏色與產(chǎn)乙醇能力成正相關(guān)，從而初步判斷不同菌株產(chǎn)生乙醇能力。

1.6.2 遺傳穩(wěn)定性及乳糖分解能力測定

將初步篩選獲得酵母菌連續(xù)傳代30 次，按照一定比例稀釋后，測定OD600的大小。同時(shí)參照劉曜綜等[14]的方法，測定酵母菌菌株代謝乳糖能力。

1.7 復(fù)合菌種發(fā)酵劑的研制

1.7.1 三種乳酸菌比例的優(yōu)化

分別取3 株30 mL 活化后的乳酸菌菌液于50 mL離心管中，4 ℃，6 000 r/min 離心15 min 后棄上清，并用純牛乳等體積重懸菌泥，忽略離心條件對活菌數(shù)的影響。按照表1中設(shè)置的27 組比例（NLM2:MLK5:SLC1）制作發(fā)酵乳。37 ℃培養(yǎng)至凝乳，于4 ℃冷藏1 d。邀請具有專業(yè)經(jīng)驗(yàn)的20 名人員對不同比例乳酸菌發(fā)酵乳的外觀、質(zhì)地、風(fēng)味和可接受性進(jìn)行評估。根據(jù)文獻(xiàn)方法并稍作修改[15]。感官評分包括：極致喜歡=10；非常喜歡～不喜歡也不討厭=9～5；些許不喜歡～非常不喜歡=4～2；極致不喜歡=1。根據(jù)感官評分，從而確定最佳比例。

表1 3 株乳酸菌間比例的優(yōu)化Table 1 Optimization of the ratio of three LAB strains

1.7.2 乳酸菌與酵母菌比例的優(yōu)化

設(shè)定乳酸菌與酵母菌的比例分別為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1，其中，三株乳酸菌間的比例依據(jù)表1所優(yōu)化出的結(jié)果。按1×106CFU/mL 活菌數(shù)接種于100 mL 純牛乳中，34 ℃培養(yǎng)至凝乳，于4 ℃冷藏1 d。邀請20 個(gè)具有經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行感官評定，評定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 復(fù)合發(fā)酵乳的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The standard for sensory evaluation index of fermented milk

1.7.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

由于不同菌種的生長溫度變化，可能導(dǎo)致菌種活力改變，進(jìn)而影響發(fā)酵乳的品質(zhì)。因此，對復(fù)合發(fā)酵劑的培養(yǎng)溫度作進(jìn)一步的優(yōu)化具有重要意義。根據(jù)1.7.2 優(yōu)化出乳酸菌與酵母菌比例，按1×106CFU/mL活菌數(shù)接種于100 mL 純牛乳中，設(shè)置發(fā)酵溫度為28、30、32、34、36、38、40 ℃，培養(yǎng)至凝乳后，于4 ℃冷藏1 d 后，參照表2進(jìn)行感官評價(jià)。

1.7.4 凝乳時(shí)間、活菌數(shù)、酸度、持水力及乙醇含量測定

純牛乳從接種菌種至完全凝固的時(shí)間為凝乳時(shí)間。參照文獻(xiàn)[16-18]，分別測定活菌數(shù)、酸度、持水力和乙醇含量。

1.7.5 GC-MS 分析

參照李海燕等[19]的方法，采用GC-MS 試驗(yàn)測定不同發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2020 對數(shù)據(jù)初步處理，每個(gè)樣品試驗(yàn)重復(fù)三次，最終結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析（ANOVA）；Origin 2018 軟件用于繪圖；R Studio 軟件用于繪制熱圖，分析不同樣品的揮發(fā)性代謝物的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢菌種分析

本研究從10 種開菲爾粒中，共分離獲得51 株乳酸菌、22 株酵母菌，不同開菲爾粒中菌種構(gòu)成如表1所示，分析發(fā)現(xiàn)不同開菲爾粒中微生物組成差異較大，易受地理、氣候等自然因素以及發(fā)酵工藝等人為因素的影響。以10 種開菲爾粒為例，乳酸菌中優(yōu)勢菌種為開菲爾乳桿菌、干酪乳桿菌，分別占分離菌種的28.77%和20.55%；酵母菌中優(yōu)勢菌種為馬克思克魯維酵母、單孢釀酒酵母，分別占分離菌種的12.33%和6.85%。

表3 10 種開菲爾粒中菌種組成及其占比Table 3 Composition and proportion of bacteria in 10 kinds of kefir grains

2.2 乳酸菌的篩選

2.2.1 產(chǎn)香能力測定

乳酸菌產(chǎn)香能力主要呈現(xiàn)為發(fā)酵乳中乙醛、雙乙酰濃度。文獻(xiàn)認(rèn)為，乙醛和雙乙酰的濃度分別達(dá)到5 mg/L、1 mg/L 時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品具有特征風(fēng)味，而乙醛質(zhì)量濃度大于30 mg/L 時(shí)會(huì)生成不愉快的風(fēng)味[20]。因此，在適度范圍內(nèi)，隨著乙醛質(zhì)量濃度的升高，發(fā)酵乳的風(fēng)味愈佳[21]。乙醛質(zhì)量濃度最高的菌株MLC1 為28.82 mg/L，其次菌株FLC2 濃度為28.65 mg/L，兩者無顯著性差異（p＞0.05）。雙乙酰質(zhì)量濃度過高也將造成產(chǎn)品風(fēng)味欠缺[20]。雙乙酰質(zhì)量濃度最高的菌株YLP3 濃度為8.97 mg/L，與其他菌株具有顯著性差異（p＜0.05），其次為菌株DLP3 和TLP5，質(zhì)量濃度分別為6.39 mg/L、6.34 mg/L，兩者無顯著性差異（p＞0.05）。當(dāng)乙醛與雙乙酰均在最適質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，且兩者間比例高于3 時(shí)，發(fā)酵乳風(fēng)味與比例成正相關(guān)[22]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建的雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y=0.098 1x+0.032，R2=0.99。

如表4，為28 株乳酸菌單菌發(fā)酵乳的乙醛、雙乙酰濃度，其余23 株乳酸菌發(fā)酵乳經(jīng)單菌發(fā)酵后有異味、顏色異常等，故不計(jì)入。表4中，乙醛與雙乙酰質(zhì)量濃度比例大于3 的乳酸菌有22 株，其中，14 株乳酸菌（BLK3、BLK4、KLC1、KLC2、KLK4、MLK3、MLK5、NLM2、NLK3、SLC1、XLC2、XLK4、YLK4、YEF5）發(fā)酵乳中乙醛質(zhì)量濃度在5～30 mg/L 范圍內(nèi)，說明這14 株乳酸菌的產(chǎn)香能力更強(qiáng)。

表4 28 株乳酸菌發(fā)酵乳的乙醛、雙乙酰質(zhì)量濃度Table 4 Acetaldehyde and diacetyl concentrations of fermented milk of 28 LAB strains

2.2.2 蛋白分解能力測定

蛋白分解能力測定以發(fā)酵乳中氨基氮質(zhì)量濃度為重要指標(biāo)，其濃度大小反映了乳中短肽和游離氨基酸的含量，其值越高，說明蛋白類物質(zhì)越易被人體吸收，同時(shí)對發(fā)酵乳的感官評價(jià)也有一定影響[11]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出氨基氮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y=0.002x+0.011 6，R2=0.99。

表5為28 株乳酸菌發(fā)酵乳中氨基氮質(zhì)量濃度。其中 9 株乳酸菌發(fā)酵乳的氨基氮質(zhì)量濃度為570.98～684.92 mg/L，具有顯著性差異（p＜0.05），且遠(yuǎn)大于商業(yè)發(fā)酵劑制備發(fā)酵乳中氨基氮質(zhì)量濃度409.50 mg/L[23]，也大于干酪乳桿菌與商業(yè)發(fā)酵劑共同發(fā)酵后發(fā)酵乳中的氨基氮質(zhì)量濃度500.88 mg/L[24]。剩余19 株乳酸菌發(fā)酵乳的氨基氮質(zhì)量濃度范圍為333.19～505.33 mg/L，除菌株SLP3 與XLK4，菌株FLC2與TLP5 無顯著性差異外（p＞0.05），其余菌株間均具有顯著性差異（p＜0.05）。不同菌株間的蛋白降解能力的不同，可能由于菌株及生長環(huán)境不同，造成蛋白酶活力的差異。

表5 28 株乳酸菌發(fā)酵乳的氨基氮質(zhì)量濃度Table 5 Amino nitrogen concentration of fermented milk of 28 LAB strains

綜合乙醛、雙乙酰及氨基氮質(zhì)量濃度，菌株BLK3、KLC1、KLC2、MLK5、NLM2、NLK3、SLC1、XLC2及YLK4 表現(xiàn)較優(yōu)，故測定這9 株乳酸菌發(fā)酵乳的全質(zhì)構(gòu)特性的差異。

2.2.3 全質(zhì)構(gòu)分析

物性儀可以用于測量食品質(zhì)構(gòu)特性，靈敏度高，能夠量化待測樣品的硬度、稠度、凝聚性及粘性等指標(biāo)，使結(jié)果具備客觀性和可比性[25]。如表6所示，9 株乳酸菌發(fā)酵乳的硬度均處于適宜范圍33.90～39.90 g，此硬度范圍的發(fā)酵乳更容易為消費(fèi)者接受。發(fā)酵乳稠度與菌株的胞外多糖產(chǎn)量成負(fù)相關(guān)，稠度越大，則均一性和流暢度越差[26]。菌株MLK5、SLC1、NLM2 的發(fā)酵乳稠度顯著小于其余菌株（p＜0.05），說明這三種發(fā)酵乳的均一性和流暢度較好。菌株KLC1、MLK5、SLC1、NLM2 發(fā)酵乳的凝聚性和粘性都顯著大于其余菌株（p＜0.05），表明菌株KLC1、MLK5、NLM2、SLC1 發(fā)酵過程中產(chǎn)胞外多糖多、微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更好。綜合全質(zhì)構(gòu)特性的四個(gè)指標(biāo)，判定乳酸菌菌株MLK5、NLM2、SLC1 的表現(xiàn)最優(yōu)。因此，選擇乳酸菌MLK5、NLM2、SLC1 作為開菲爾風(fēng)味復(fù)合發(fā)酵劑的復(fù)配菌種。

表6 9 株乳酸菌發(fā)酵乳的全質(zhì)構(gòu)分析Table 6 Texture profile analysis of fermented milk of 9 LAB strains

2.3 酵母菌的篩選

2.3.1 產(chǎn)乙醇能力測定

通過TTC 平板的顯色反應(yīng)，可分辨出不同酵母菌產(chǎn)乙醇能力的差異，即顏色越深則產(chǎn)乙醇能力越強(qiáng)。根據(jù)結(jié)果，1 株酵母菌不顯色，6 株酵母菌呈微粉色，12 株酵母菌呈粉紅色，3 株酵母菌呈深紅色。為避免產(chǎn)乙醇能力過強(qiáng)或不足而影響復(fù)合發(fā)酵乳的品質(zhì)，因此，初步選擇產(chǎn)乙醇能力適中的酵母菌，即BY1、BY2、DY2、FY1、KY1、MY1、MY3、NY1、NY2、SY2、TY1、XY1，并對其進(jìn)行后續(xù)的篩選試驗(yàn)。

2.3.2 遺傳穩(wěn)定性及乳糖利用率

菌種在連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)退化現(xiàn)象，表現(xiàn)為生長速度放緩，代謝特征減弱等，故測定遺傳穩(wěn)定性是篩選優(yōu)異菌種的重要標(biāo)準(zhǔn)。其由表7可知，在多次傳代后，菌株MY3、NY1、NY2 于600 nm 處的吸光度為0.145～0.32，低于剩余9 株吸光度0.487～0.777。其中，F(xiàn)Y1 的吸光值最大，并與其余菌株具有顯著性差異（p＜0.05）。酵母菌通過代謝乳糖，實(shí)現(xiàn)更好的發(fā)酵。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，乳糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

表7 12 株酵母菌的遺傳穩(wěn)定性及乳糖利用率Table 7 Genetic stability and utilization rate of lactose of 12 yeast strains

y=0.224 1x-0.005 6，R2=0.99。

測得純牛奶中乳糖含量為1.465 mg/mL，并以此為對照，分析不同酵母菌的乳糖利用率。由表7可知，12 株酵母菌在一定程度上均可利用乳糖，并且利用率高于15%。由于長期生長于乳品中，酵母菌從而逐步進(jìn)化為能夠代謝乳糖的菌株。

通過對12 株酵母菌的乳糖代謝能力比較，發(fā)現(xiàn)菌株FY1 的乳糖利用率最高，乳糖含量顯著低于其余菌株（p＜0.05），結(jié)合遺傳穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其最適于發(fā)酵牛乳，因此選取酵母菌FY1 為開菲爾風(fēng)味復(fù)合發(fā)酵劑的復(fù)配菌株之一。

2.4 復(fù)合菌種發(fā)酵劑的研制

2.4.1 三株乳酸菌比例的優(yōu)化

經(jīng)活化后，開菲爾乳桿菌MLK5、干酪乳桿菌SLC1、腸膜明串珠NLM2 的活菌數(shù)分別達(dá)5.86×108、3.15×108、1.98×109CFU/mL，3 株乳酸菌根據(jù)不同比例制備27 組發(fā)酵乳的感官評價(jià)結(jié)果如表8。外觀方面，27 組發(fā)酵乳均呈乳白色，并無顯著差異（p＞0.05）。質(zhì)地方面，1 號(hào)發(fā)酵乳的組織結(jié)構(gòu)最佳，且無氣泡及乳清析出等現(xiàn)象，評分為8.33 分，其次為4 號(hào)與13 號(hào)發(fā)酵乳，均為8.29 分，與1 號(hào)發(fā)酵乳差異不顯著（p＞0.05），其余22 組發(fā)酵乳與之差異顯著（p＜0.05）。風(fēng)味方面，主要涉及酸甜、爽口兩個(gè)指標(biāo)，4 號(hào)和6 號(hào)發(fā)酵乳風(fēng)味較好，其次為19 號(hào)發(fā)酵乳，三者差異不顯著（p＞0.05），其他組發(fā)酵乳與上述三組差異顯著（p＜0.05）?？山邮苄苑矫妫? 號(hào)發(fā)酵乳的評分最高，其次為24 號(hào)和8 號(hào)，該三組發(fā)酵乳與1 號(hào)發(fā)酵乳差異不顯著（p＞0.05），與其余組發(fā)酵乳差異顯著（p＜0.05）。綜合外觀、質(zhì)地、風(fēng)味、可接受性4 個(gè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)4 號(hào)發(fā)酵乳的整體感官評價(jià)較為突出，因此，3 株乳酸菌間的最佳比例確定為NLM2: MLK5: SLC1=1:2:1。

表8 不同比例發(fā)酵乳的感官評價(jià)結(jié)果Table 8 Sensory evaluation results of different ratios of fermented milk

2.4.2 乳酸菌與酵母菌比例的優(yōu)化

圖1 接種比例的變化對發(fā)酵乳感官評分的影響Fig.1 The influence of the change in inoculation proportion on sensory score of fermented milk

開菲爾乳桿菌MLK5、干酪乳桿菌SLC1、腸膜明串珠NLM2、馬克思克魯維酵母菌FY1 的重新活化后，活菌數(shù)分別為5.23×108、3.25×108、2.03×109、1.13×107CFU/mL。當(dāng)乳酸菌與酵母菌的比例設(shè)置為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1（其中三種乳酸菌比例腸膜明串珠菌:開菲爾乳桿菌:干酪乳桿菌=1:2:1）時(shí)，發(fā)酵乳的感官評分先升高再降低。當(dāng)兩者比例為5:1時(shí)，感官評分達(dá)到最高，因此確定開菲爾風(fēng)味復(fù)合發(fā)酵劑中乳酸菌與酵母菌的比例為5:1。

2.4.3 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

由圖2可知，在接種量為1×106CFU/mL，乳酸菌:酵母菌為5:1 時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，感官評分先升高在降低，于34 ℃時(shí)，感官評分達(dá)到最高。因此，確定復(fù)合發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵溫度為34 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度的變化對發(fā)酵乳感官評分的影響Fig.2 The influence of the changes in fermentation temperature on sensory scores of fermented milk

2.4.4 發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間、酸度、活菌數(shù)、乙醇含量及感官評價(jià)

為驗(yàn)證復(fù)合發(fā)酵劑的可行性，挑選性狀穩(wěn)定的開菲爾粒C、H、M、N 作為對照，比較分析不同發(fā)酵乳間質(zhì)量差異。表9為5 種不同發(fā)酵乳的指標(biāo)測定結(jié)果。比較發(fā)現(xiàn)，復(fù)合發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間最短，并低于開菲爾粒凝乳所需時(shí)間。復(fù)合發(fā)酵乳的酸度為84.66 oT，4 種開菲爾粒發(fā)酵乳的酸度范圍為73.27～84.21 oT，都滿足國標(biāo)要求。復(fù)合發(fā)酵乳的持水力顯著大于與開菲爾粒發(fā)酵乳（p<0.05）。四種開菲爾粒發(fā)酵乳的乙醇含量范圍為0.37%～0.56%（V/V），復(fù)合發(fā)酵乳中乙醇含量介于之中，說明復(fù)合發(fā)酵劑中酵母菌產(chǎn)乙醇能力尚可。而且，不同發(fā)酵乳中酵母菌與乳酸菌的活菌數(shù)均達(dá)到106CFU/mL 與109CFU/mL，符合國標(biāo)要求。

表9 不同發(fā)酵乳指標(biāo)測定結(jié)果Table 9 Determination results of different fermented milk indexes

2.4.5 發(fā)酵乳的主成分分析

主成分分析是一種多元統(tǒng)計(jì)工具，主要應(yīng)用于降維數(shù)據(jù)處理[27]。根據(jù)上述表9測得指標(biāo)，對復(fù)合發(fā)酵乳及開菲爾粒發(fā)酵乳主成分分析。前三個(gè)主成分特征值累計(jì)貢獻(xiàn)量達(dá)99.50%（分別為50.90%、34.10%和14.50%，圖3a）。PC1 方向與凝乳時(shí)間、酸度、持水力、及感官評價(jià)相關(guān)性較大，其載荷絕對值均大于4。PC2方向與乙醇含量、乳酸菌活菌量、及酵母菌活菌量有較大的相關(guān)性，載荷絕對值均大于4.4。PC3 方向與持水力、乙醇含量、乳酸菌活菌量有較大相關(guān)性，載荷絕對值大于4。

圖3 不同發(fā)酵乳理化特性的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of the physical and chemical properties of different fermented milks

圖3b 中的得分圖顯示出5 種發(fā)酵乳的分布情況，不同發(fā)酵乳間有明顯區(qū)分。PC1 得分越高，凝乳時(shí)間、酸度、持水力、及感官評價(jià)指標(biāo)值就越高，開菲爾粒C、開菲爾粒M 及復(fù)合發(fā)酵乳的PC1 得分為正值。PC2 得分越高，乙醇含量、乳酸菌活菌量、及酵母菌活菌量指標(biāo)值越高，PC2 方向上的開菲爾粒C、開菲爾粒N及復(fù)合發(fā)酵乳得分為正值。PC3 得分越高，持水力、乙醇含量、乳酸菌活菌量指標(biāo)值越高，只有開菲爾粒N的PC3 得分為正值。進(jìn)一步說明，復(fù)合發(fā)酵乳與開菲爾粒C 各項(xiàng)指標(biāo)較為接近，整體質(zhì)量表現(xiàn)接近開菲爾粒發(fā)酵乳。

2.4.6 不同發(fā)酵乳的揮發(fā)性香味物質(zhì)比較

采用GC-MS，測定不同發(fā)酵乳中揮發(fā)性香氣成分，共檢測到風(fēng)味物質(zhì)35 種。5 種發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)均包括醇、醛、酮、酯、酸類。醇類物質(zhì)相對含量最為豐富，占25%～50%，主要為酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生，為開菲爾風(fēng)味發(fā)酵乳的風(fēng)味物質(zhì)的主要構(gòu)成成分。復(fù)合發(fā)酵乳中醇類物質(zhì)檢測到6 種，含量高于其他發(fā)酵乳的醇類分別為苯乙醇和異丁醇。苯乙醇作為一種令人愉悅的具有花香味的芳香醇，廣泛存在于植物精油中，也是葡萄酒等發(fā)酵食品中天然的風(fēng)味物質(zhì)，是決定發(fā)酵食品品質(zhì)關(guān)鍵因素之一[28]。異丁醇主要由支鏈氨類基酸分解途徑產(chǎn)生，不僅能起到呈味的作用，還是構(gòu)成酯類的前體物質(zhì)[29]。醛類物質(zhì)閾值低，主要產(chǎn)生各種氧化風(fēng)味。復(fù)合發(fā)酵乳共檢測到醛類物質(zhì)4 種，其中二甲基丁醛為優(yōu)勢風(fēng)味物質(zhì)，具有青草香氣，由氨基酸與羰基化合物通過Strecker 降解反應(yīng)生成，使發(fā)酵后的產(chǎn)品具有清新自然風(fēng)味[30]。酮類物質(zhì)具有濃郁的奶香味，使發(fā)酵乳風(fēng)味更馥郁。復(fù)合發(fā)酵乳檢測到酮類有6種，但總含量低于開菲爾粒發(fā)酵乳。酯類物質(zhì)閾值較低，且大部分呈現(xiàn)出果香味，為乳制品中重要的風(fēng)味成分之一。復(fù)合發(fā)酵乳中共檢測到7 種酯類物質(zhì)，其中，丁酸乙酯、己酸乙酯、和乙酸異丁酯為優(yōu)勢風(fēng)味成分。丁酸乙酯具有濃烈的水果香甜味；己酸乙酯具有酒香、菠蘿香型的香氣，工業(yè)上常用在香精調(diào)制及酒類調(diào)香；乙酸異丁酯有貯藏的鮮果香氣[31]。酸類物質(zhì)影響發(fā)酵乳的爽口感，一般控制酸類物質(zhì)產(chǎn)生于發(fā)酵前期，避免后期發(fā)酵過度產(chǎn)生后酸化現(xiàn)象。復(fù)合發(fā)酵乳檢測到6 種酸類物質(zhì)，丁酸、已酸、辛酸含量最高。丁酸具有刺激性氣味，已酸的氣味表現(xiàn)為辛辣、腐臭、花香等氣；辛酸呈淡淡脂肪和肥皂氣味[32]。由圖4可知，與開菲爾粒發(fā)酵乳相比，復(fù)合發(fā)酵乳的香氣物質(zhì)種類數(shù)最多，各種物質(zhì)間構(gòu)成和諧。可能由于純菌種發(fā)酵并且各菌種最大限度的發(fā)揮了作用，一定程度上降低了醋酸菌等其他菌種對發(fā)酵過程產(chǎn)生的消極影響。

圖4 不同發(fā)酵乳揮發(fā)性化合物的熱圖及聚類分析Fig.4 Heatmap and cluster analysis of volatile compounds in different fermented milks

3 結(jié)論

為研制一種新型開菲爾風(fēng)味復(fù)合發(fā)酵劑，本研究對10 種開菲爾粒中優(yōu)勢菌種進(jìn)行了分離，篩選出性能穩(wěn)定的開菲爾乳桿菌MLK5、干酪乳桿菌SLC1、腸膜明串珠菌NLM2 和馬克思克魯維酵母菌FY1。最終確定發(fā)酵劑中最佳的菌種配比為乳酸菌:酵母菌=5:1（乳酸菌之間配比為NLM2:SLC1:MLK5=1:2:1）。經(jīng)過對比分析，復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)品的凝乳時(shí)間、酸度、持水力、乙醇含量、活菌數(shù)及感官評價(jià)指標(biāo)與開菲爾粒發(fā)酵產(chǎn)品類似，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成協(xié)調(diào)、穩(wěn)定。故本研究可為開菲爾風(fēng)味復(fù)合發(fā)酵劑的研制及不同風(fēng)味酸奶的規(guī)模化生產(chǎn)奠定理論及實(shí)際應(yīng)用基礎(chǔ)。