黃亮，任志強(qiáng),2，鄧杰,2，黃治國(guó),2，衛(wèi)春會(huì),2*

（1.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）（2.中國(guó)輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

白酒是以大曲、小曲或麩曲等為糖化發(fā)酵劑，利用谷物原料（高粱、糯米、大米、小麥和玉米等），經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌等工藝制成的蒸餾酒[1,2]。白酒丟糟是傳統(tǒng)固態(tài)法白酒生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，白酒與丟糟的產(chǎn)量比約為1:3[3]。白酒丟糟中含有較高的粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪和粗纖維等，此外還含有多種氨基酸等[4-6]。近年來(lái)，隨著白酒產(chǎn)量持續(xù)增加，丟糟產(chǎn)量也在不斷增加。丟糟的有效處理一直是白酒行業(yè)的難題。目前丟糟的利用主要是生產(chǎn)飼料[7-9]、丟糟酒[10,11]和有機(jī)肥[12,13]；此外還有生產(chǎn)有機(jī)酸[14]、燃料乙醇[15]、沼氣[16,17]、氫氣[18]等。

丟糟酒是以傳統(tǒng)白酒丟糟為原料，普遍通過(guò)添加酵母、糖化酶等一種或多種發(fā)酵劑[19,20]，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、蒸餾獲得的白酒。丟糟的特點(diǎn)為酸度高，其中的淀粉經(jīng)過(guò)反復(fù)蒸煮、多次返生，不利于糖化發(fā)酵。因此，在厭氧狀態(tài)下丟糟中老化的淀粉難以被酵母利用。酸性環(huán)境還妨礙了酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，不利于產(chǎn)酒。因此，相比于常規(guī)的白酒生產(chǎn)，丟糟酒生產(chǎn)過(guò)程中需要的糖化發(fā)酵劑用量更大，提高了丟糟酒生產(chǎn)成本。目前丟糟酒生產(chǎn)存在的主要問(wèn)題有以下三點(diǎn)：（1）丟糟酒的發(fā)酵條件不利于微生物的生長(zhǎng)代謝；（2）用曲量大，成本高；（3）丟糟中的淀粉利用率和資源的利用率低。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室釀造模型[21]，以米根霉制備霉菌麩曲；以商品小曲為酵母菌源，用糧食糊化料液作為基質(zhì)，對(duì)酵母菌進(jìn)行復(fù)蘇增殖制備出酒母醪液；再將麩曲與酒母醪液混合發(fā)酵濃香型丟糟釀造丟糟酒，以期為白酒行業(yè)生產(chǎn)丟糟酒提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與藥品

某品牌小曲、高粱、玉米、大米、糯米、小麥、土豆、麩皮均為市售；丟糟由宜賓市某濃香型酒廠提供；米根霉（編號(hào)為R.oryzaeJQ-1），由釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。麥芽汁培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；乙酸正丁酯（色譜純），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F 超凈化工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LRH-100-MS 微生物培養(yǎng)箱，廣東泰宏科學(xué)儀器股份有限公司；GI54DS 立式自動(dòng)壓力蒸汽壓滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；DZKW-4 電熱恒溫水浴鍋，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；DW-25W388 醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；7890A-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糧食糊化料液與培養(yǎng)基的制備

（1）糧食糊化料液：粉碎高粱、小麥、大米、糯米、玉米、五糧混合物（高粱36wt%、小麥16wt%、大米22wt%、糯米18wt%、玉米8wt%），過(guò)100 目篩，各稱取100 g，分別加入200 mL 去離子水，攪拌均勻后，加入到800 mL 沸水中加熱至微沸狀態(tài)，保持15 min，冷卻至室溫，定容至1 000 mL，即單糧糊化料液和五糧糊化料液。

（2）麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：稱取麥芽汁培養(yǎng)基130.10 g，加入去離子水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

（3）PDA 培養(yǎng)基：200 g 土豆丁煮沸，過(guò)濾，濾液加20 g 葡萄糖、20 g 瓊脂，加入去離子水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 酒母醪液的制備

稱取10 g 某市售小曲加入至冷卻后的1 000 mL不同的糧食糊化料液中，攪拌均勻，28 ℃培養(yǎng)48 h，制得酵母擴(kuò)培液，即酒母醪液。

1.2.3 商品小曲中酵母數(shù)量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.00 g 小曲，加入到裝有99 mL 無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶?jī)?nèi)，用封口膜封口，置于搖床，28 ℃、200 r/min 下震蕩30 min，吸取菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，依次稀釋至10-6。分別取10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液進(jìn)行涂布，每個(gè)梯度做3 個(gè)平行，一組空白對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)48 h 后，對(duì)酵母菌菌落計(jì)數(shù)。

1.2.4 酒母醪液中酵母數(shù)量的測(cè)定

平板菌落計(jì)數(shù)法：在發(fā)酵48 h 后，取10 mL 均勻樣液加入含90 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，混合均勻，靜止后制得菌懸液，靜至后取上清液進(jìn)行梯度稀釋，分別取10-4、10-5、10-6菌懸液各0.1 mL 涂布于PDA 平板培養(yǎng)基上，并做空白對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)48 h 后，對(duì)酵母菌菌落計(jì)數(shù)。

血球計(jì)數(shù)板法：取不同稀釋倍數(shù)的菌懸液0.10 mL 于血球計(jì)數(shù)板，分別數(shù)五個(gè)中格的酵母菌數(shù)，取平均值計(jì)算出酵母醪液中的酵母菌數(shù)。

1.2.5 麩曲制備工藝

參照文獻(xiàn)[22]的麩曲制備工藝，將根霉菌R.oryzaeJQ-1 制備成麩曲JQ-1。

1.2.6 麩曲和酒母接種量對(duì)丟糟酒的影響

（1）為了考察麩曲接種量對(duì)丟糟酒釀造的影響，限定的酵母的接種量為每千克丟槽1.00×1010個(gè)，以麩曲的添加量為0.20wt%、0.40wt%、0.60wt%、0.80wt%、1.00wt%設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1.2.7 丟糟酒的釀造試驗(yàn)

（1）試驗(yàn)組：取丟糟6.00 kg，酒母醪液和霉菌麩曲的接種量分別為1.2.6 所得到的最佳接種量，均勻混合，裝入發(fā)酵罐，30 ℃密閉發(fā)酵15 d。

（2）對(duì)照組：取丟糟6.00 kg，加入熱水，使對(duì)照組和試驗(yàn)組的質(zhì)量相同，小曲接種量為0.80wt%，均勻混合，裝入發(fā)酵罐，30 ℃密閉發(fā)酵15 d。

1.2.8 理化指標(biāo)的測(cè)定

糖化酶活力的測(cè)定：參考釀酒曲行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257-2011[23]。

出酒量的測(cè)定：取5.00 kg 酒醅進(jìn)行蒸餾，得到的酒樣充分混合，測(cè)量酒樣度數(shù)和體積（以60% vol 計(jì)），即實(shí)際出酒量。

酒醅粗淀粉測(cè)定：采用酸水解法[24]測(cè)定酒醅中的淀粉含量。

淀粉出酒率：根據(jù)淀粉消耗量計(jì)算出5.00 kg 酒醅中理論出酒量（以60% vol 計(jì)），再用公式（1）計(jì)算淀粉出酒率。

式中：

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A——淀粉出酒率，%；

V1——實(shí)際出酒量，mL；

V0——理論出酒量，mL。

1.2.9 丟糟酒風(fēng)味檢測(cè)

（1）樣品前處理：復(fù)蒸酒樣，調(diào)整度數(shù)為60% vol，取1 mL 進(jìn)行分析，加入50 μL 乙酸正丁酯溶液（70 mg/100 mL），混勻。

（2）GC條件：DB-WAX（60.00 m×250 μm×0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱；載氣為99.999%氦氣；進(jìn)樣口溫度230℃；升溫程序?yàn)椋撼鯗?0 ℃，以8 ℃/min 升至100 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min 升至170 ℃，保持3 min，最后以15 ℃/min 升至230 ℃，保持4 min，總運(yùn)行時(shí)間29.25 min；載氣體積流量為1 mL/min；不分流，進(jìn)樣量1 μL。

（3）MS 條件：電子電離源（Electron Ionization，EI），電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍35～400 u。

（4）定性定量分析：采用NIST05a.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索、比對(duì)，進(jìn)行定性分析；利用內(nèi)標(biāo)峰面積對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 9.1軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩曲和商品小曲的糖化酶活力比較

分別測(cè)定麩曲JQ-1 和商品小曲的糖化酶活力，其中商品小曲的糖化酶活力較高，達(dá)到1 707.63 U/g；JQ-1 的糖化酶活力為1 507.91 U/g，兩種曲的糖化酶活力具有顯著差異（p＜0.05）。霉菌麩曲JQ-1 的糖化酶的活力略低于商品小曲，與其他霉菌麩曲相比，酶活力處于較高水平[23]，霉菌麩曲制作成功，可作為丟糟酒釀造的糖化劑使用。

2.2 商品小曲和酒母醪液中酵母數(shù)目的比較

按1.2.3 方法對(duì)所使用的小曲中的酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，小曲中酵母數(shù)目為3.47×107CFU/g。不同原料制備的酒母醪液中酵母數(shù)目的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，五糧酒母醪液中的酵母數(shù)量顯著（p＜0.05）高于單糧酒母醪液。酵母菌在以五糧糊化料液上的擴(kuò)增效果最佳，酵母菌數(shù)達(dá)到了2.40×108CFU/mL，與培養(yǎng)前相比，酵母菌增殖近700 倍，表明酵母的擴(kuò)培效果良好，可以為丟糟酒發(fā)酵提供充足的酵母菌源。原因可能是五糧糊化料液的營(yíng)養(yǎng)豐富，更有利于酵母菌的增殖。從不同種類單糧的糊化料液增殖結(jié)果來(lái)看，高粱糊化料液擴(kuò)培效果最佳。這符合單糧釀酒常選用高粱作為原料的實(shí)際情況。五種糧食中，以大米和糯米的總淀粉含量較高，高粱和糯米的支鏈淀粉含量較高[25]，但糯米糊化料液中的酵母數(shù)量并不高，可能是因?yàn)楦吡恢杏心承┏煞指欣诮湍傅纳L(zhǎng)繁殖。不同糧食對(duì)酵母菌生長(zhǎng)繁殖的影響還需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖1 不同酒母醪液中的酵母菌數(shù)量Fig.1 Quantity of yeast in different barm mash

由此可見，在選用不同種類糧食對(duì)酵母進(jìn)行擴(kuò)配時(shí)，可以選擇高粱或五糧，都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)酵母菌的高效擴(kuò)培。考慮到酵母將進(jìn)入丟糟中發(fā)揮作用，不同原料擴(kuò)培酵母可能存在適應(yīng)上的差異性，在生產(chǎn)實(shí)踐中可根據(jù)丟糟的原料成分來(lái)進(jìn)行具體選擇。本研究采用五糧型丟糟，因此選用五糧糊化料液進(jìn)行酵母擴(kuò)培。

2.3 麩曲和酒母接種量對(duì)丟糟產(chǎn)酒的影響

2.3.1 麩曲接種量對(duì)丟糟產(chǎn)酒的影響

麩曲主要提供糖化酶，將酒醅的淀粉分解為糖。酒醅的糖化過(guò)程是白酒釀造的重要環(huán)節(jié)，因此對(duì)麩曲的接種量進(jìn)行探討。按照0.20wt%、0.40wt%、0.60wt%、0.80wt%、1.00wt%的比例接種米根霉麩曲，30 ℃發(fā)酵15 d。由如圖2可知，與酵母接種量對(duì)酒醅的影響進(jìn)行比較，麩曲主要影響酒醅的淀粉含量，隨接種量的增加，酒醅的淀粉含量逐漸降低，接種量為0.20%的淀粉含量顯著高于其他接種量（p＜0.05）。當(dāng)接種量達(dá)到0.40%后，在增加接種量對(duì)酒醅的含量變化影響不顯著（p＞0.05）。可能是因?yàn)榫契械牡矸墼诜磸?fù)蒸煮、發(fā)酵過(guò)程中，使淀粉老化，淀粉被纖維素包裹或連結(jié)，難以利用，酒醅中淀粉利用達(dá)到了一個(gè)極限值[21]。由如圖2可知，不同的麩曲接種量對(duì)淀粉出酒率影響不顯著（p＞0.05），可能是因?yàn)辂熐饕绊懙矸鄣奶腔^(guò)程，而酵母主要影響酒醅的產(chǎn)酒過(guò)程，因此應(yīng)再對(duì)酵母接種量進(jìn)行優(yōu)化。綜上所述，確定麩曲的接種量為0.40%。

圖2 不同麩曲接種量對(duì)丟糟淀粉含量和淀粉出酒率的影響Fig.2 Effect of different amount of Fuqu on starch content and conversion rate of starch to ethanol of distiller's grains

2.3.2 酒母接種量對(duì)丟糟產(chǎn)酒的影響

酒母的接種量直接影響酒醅的出酒量和出酒率，因此對(duì)酒母接種量進(jìn)行了探討。選用五糧糊化料液對(duì)酵母進(jìn)行擴(kuò)培，分別按照每千克丟槽0.60×1010、0.80×1010、1.00×1010、1.20×1010、1.40×1010個(gè)接種，30 ℃發(fā)酵15 d。由如圖3可知，隨著酒母接種量的增加，酒醅的淀粉含量逐漸下降。接種量為每千克丟槽1.00×1010個(gè)時(shí)，酒醅淀粉含量顯著低于接種量為每千克丟槽6.00×109個(gè)和每千克丟槽8.00×109個(gè)（p＜0.05）。當(dāng)再增加酒母接種量，酒醅的淀粉含量下降不顯著（p＞0.05）。由如圖3可知，淀粉到酒的轉(zhuǎn)化率隨著接種量的增加逐漸增加，當(dāng)接種量達(dá)到每千克丟槽 8.00×109個(gè)后，轉(zhuǎn)化率增長(zhǎng)不顯著（p＞0.05）。酒母醪液為丟糟發(fā)酵提供酵母菌，酵母屬于兼性厭氧型微生物，在有氧條件和無(wú)氧條件下均可以生存，但是其呼吸方式不一樣。有氧條件下，酵母通過(guò)TCA 循環(huán)途徑，將糖類分解為水和二氧化碳，酵母大量生長(zhǎng)繁殖，屬于酵母的擴(kuò)培階段；在無(wú)氧條件下，酵母將糖發(fā)酵為乙醇和二氧化碳，屬于乙醇發(fā)酵階段[26]。隨著乙醇的大量積累，乙醇對(duì)酵母有一定的毒害作用，會(huì)抑制了酵母的生長(zhǎng)代謝。因此，將兩階段分開，先進(jìn)行有氧繁殖，再進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，可能更利于酵母生產(chǎn)乙醇。綜上，酒母的接種量確定為每千克丟槽1.00×1010個(gè)，此條件下，丟糟的淀粉消耗和淀粉出酒率均達(dá)到較高水平。

圖3 不同酒母接種量對(duì)丟糟的淀粉含量和淀粉出酒率的影響Fig.3 Effect of different barm mash inoculum amount on starch content and conversion rate of starch to ethanol of distiller's grains

2.4 “麩曲+酵母”模式對(duì)丟糟淀粉的利用效果

由2.3 分別探討了酵母和麩曲的接種量對(duì)丟糟酒釀造的影響，分別得到酵母和麩曲的最佳接種量為每千克丟槽1.00×1010個(gè)和0.40%。在此條件下在進(jìn)行丟糟酒的釀造，以小曲做對(duì)照。釀造試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，發(fā)酵前酒醅的淀粉含量為10.69%，對(duì)照組酒醅的殘余淀粉為7.23%，發(fā)酵過(guò)程消耗的淀粉量為3.46%；試驗(yàn)組酒醅的殘余淀粉為5.20%，消耗了5.49%的淀粉。試驗(yàn)組發(fā)酵后的酒醅淀粉含量顯著（p＜0.05）低于對(duì)照組。結(jié)果表明，采用麩曲和酒母共同發(fā)酵能夠更好的利用丟糟中的淀粉，發(fā)酵丟糟酒的效果較好，提高了淀粉的利用率。可能是由于酵母的加入方式為液態(tài)，可以更好將酵母、麩曲和酒醅混合，促進(jìn)了淀粉的利用[21]。

圖4 丟糟發(fā)酵前后淀粉含量的比較Fig.4 Comparison of starch content before and after distiller's grains fermentation

2.5 酒醅出酒量的比較

根據(jù)2.3.3 發(fā)酵前后酒醅中淀粉含量的消耗，分別計(jì)算出5.00 kg 酒醅理論出酒量，得到試驗(yàn)組和對(duì)照組的理論出酒量分別為257.00 mL 和162.00 mL；試驗(yàn)組和對(duì)照組5.00 kg酒醅實(shí)際蒸餾得到60% vol酒的量分別為238.00 mL 和134.00 mL，試驗(yàn)組出酒量高出對(duì)照組104.00 mL，約為對(duì)照組的1.78 倍。結(jié)果見表1，可知試驗(yàn)組和對(duì)照組的淀粉出酒率分別為92.66%、82.75%。由此可見，相比于對(duì)照組，試驗(yàn)組不僅更多的利用了丟糟中的淀粉，而且還增加了淀粉出酒率。這是由于麩曲和酵母醪液均勻混合，作用于酒醅的各個(gè)部位，能夠?qū)⒏嗟牡矸坜D(zhuǎn)化為葡萄糖，利于酵母菌的產(chǎn)酒；在發(fā)酵前進(jìn)行了酵母的復(fù)蘇增殖，避免了由于丟糟內(nèi)部酸度大[4]等不利因素對(duì)酵母復(fù)蘇增殖的影響，尤其是乳酸會(huì)抑制釀酒酵母的活性[12,27]。大量活化后的酵母在接觸丟糟后可快速開始酒精發(fā)酵。試驗(yàn)組采用“麩曲接種0.40%+酵母接種量每千克丟槽1.00×1010個(gè)”的模式與對(duì)照組小曲的接種量0.80%相比，查詢了市售麩皮、小曲和糧食的價(jià)格，通過(guò)計(jì)算得到試驗(yàn)組處理1 t丟糟用曲費(fèi)用約為150元，出酒47.60 L；對(duì)照組處理1 t 丟糟用曲費(fèi)用約為260 元，出酒26.80 L。表明“麩曲+酵母”的模式較用商品小曲的傳統(tǒng)模式，更加節(jié)約成本，提高出酒量。

表1 試驗(yàn)組和對(duì)照組的出酒量對(duì)比Table 1 Comparison of alcohol output between the test group and the control group

2.6 丟糟酒風(fēng)味分析

通過(guò)GC-MS 法分析試驗(yàn)組和對(duì)照組酒樣的風(fēng)味物質(zhì)。試驗(yàn)組和對(duì)照組丟糟酒中的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量，如表2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組有32 種風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)照組有29 種風(fēng)味物質(zhì)，兩組試驗(yàn)的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量相差不大。且試驗(yàn)組的己酸和己酸乙酯含量分別為265.25、443.69 mg/L；對(duì)照組的己酸和己酸乙酯含量分別為272.65、436.81 mg/L。說(shuō)明“麩曲+酒母”新模式釀造的丟糟酒與商品小曲釀造的丟糟酒在風(fēng)味物質(zhì)方面幾乎無(wú)差異，新模式釀造的丟糟酒與商品小曲釀造的丟糟酒的風(fēng)格相近。

表2 試驗(yàn)組和對(duì)照組白酒中的風(fēng)味成分種類及質(zhì)量濃度(mg/L)Table 2 Types and contents of flavor components in liquor of experimental group and control group (mg/L)

以濃香型白酒丟糟為原料，試驗(yàn)組和對(duì)照組釀造的丟糟酒依然具備濃香型風(fēng)味特點(diǎn)?？赡苁且?yàn)榫契袣埩舻臐庀阈桶拙频娘L(fēng)味物質(zhì)，例如非揮發(fā)性有機(jī)酸等，在發(fā)酵過(guò)程與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)；酒醅中可能還存有梭狀芽孢桿菌，丟糟酒發(fā)酵過(guò)程為其提供了生長(zhǎng)繁殖條件，梭狀芽孢桿菌代謝產(chǎn)生了相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)，其原因還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

高糖化力JQ-1 麩曲的制備，糖化酶活力為1 507.91 U/g，滿足丟糟酒的釀造需求。酵母在不同糧食糊化料液中進(jìn)行復(fù)蘇增殖，五糧糊化料液和高粱糊化料液的酵母生長(zhǎng)最好，酵母數(shù)量在原基礎(chǔ)上分別提高了近700 倍、450 倍。

分別探討了酵母接種量和麩曲接種量對(duì)丟糟酒釀造的影響，分別得到酵母的最佳接種量為每千克丟槽1.00×1010個(gè)，麩曲的接種量為0.40wt%，在此條件下釀造丟糟酒，淀粉消耗、淀粉出酒率和出酒量均比較高。以商品小曲作為對(duì)照，試驗(yàn)組的淀粉消耗量和淀粉出酒率均高于對(duì)照組。采用“麩曲+酵母”新模式釀造丟糟酒，淀粉消耗能力和產(chǎn)酒能力均高于商品小曲。

通過(guò)比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的風(fēng)味物質(zhì)，兩組丟糟酒的風(fēng)味物質(zhì)種類和含量均相差不大，且具有濃香型白酒的特征。

本研究基于實(shí)驗(yàn)室建立的釀造模型，采用 “麩曲+酵母”新模式釀造丟糟酒，降低了丟糟用曲的使用量和丟糟酒的生產(chǎn)成本。為白酒行業(yè)處理丟糟或其他難利用淀粉提供了一種新方法和理論指導(dǎo)。