譚秋嬋，魏文靜，陳珣珣，張晨晨，趙雨川，巫株華

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的慢性傳染病。在新型冠狀病毒出現(xiàn)之前，結(jié)核病是單一感染源導(dǎo)致死亡的主要原因[1]。根據(jù)世衛(wèi)組織最新統(tǒng)計，2020年約有150萬人死于結(jié)核病[2]。隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病的治療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因此，研究調(diào)控結(jié)核分枝桿菌生長過程的關(guān)鍵基因和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)將有助于揭示其生長調(diào)節(jié)機制, 同時為深入研究基因的調(diào)控機制以及篩選新的細(xì)胞壁作用藥物靶點提供重要的理論依據(jù)。

結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁主要由糖類和脂質(zhì)組成，是分枝桿菌抵御外界環(huán)境壓力及逃逸宿主免疫攻擊的重要屏障[3]。相關(guān)組分的生物合成過程、轉(zhuǎn)運過程以及代謝或信號調(diào)控通路等是尋找新的藥物靶點的潛在對象[4]。恥垢分枝桿菌(Mycolicibacteriumsmegmatis, Msm)作為一種模式生物，在研究分枝桿菌尤其是結(jié)核分枝桿菌的致病性、毒力、潛伏和耐藥等分子機制方面有著其獨特的優(yōu)勢[5]。MSMEG_6171是恥垢分枝桿菌中一個功能未知的蛋白，是結(jié)核分枝桿菌Rv3660c同源蛋白，具有61%的同源性。2011年England K的一項研究表明Rv3660c過表達(dá)時可抑制隔膜生成而引起菌體纖絲化，該研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)該蛋白可以引起一些休眠調(diào)節(jié)子和在適應(yīng)性代謝中發(fā)揮作用的sigma因子的mRNA表達(dá)量發(fā)生顯著變化[6]。過表達(dá)MSMEG_6171可以改變恥垢分枝桿菌的脂質(zhì)代謝，從而改變恥垢分枝桿菌胞膜的結(jié)構(gòu)并增強恥垢分枝桿菌對抗生素的耐藥性[7]，但是并未對其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和候選關(guān)鍵基因進(jìn)行深入篩選、分析和驗證。因此，本實驗構(gòu)建了重組恥垢分枝桿菌Msm::6171，通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的對比分析, 深入挖掘了MSMEG_6171調(diào)控恥垢分枝桿菌生長過程中下游信號網(wǎng)絡(luò), 找到了一批受MSMEG_6171特異調(diào)控的已知和未知功能的基因并進(jìn)行了初步驗證, 為深入研究MSMEG_6171的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的認(rèn)識和重要參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 質(zhì)粒pMV261、E.coilTop10和恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsegmatismc2155, Msm) 由本實驗室保存。T4 DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶(NEB)，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑(Omega)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量 PCR試劑盒(諾維贊)，PCR引物由廣州天一輝遠(yuǎn)公司合成，prestained protein ladder(Fermentas)，卡那霉素(Axygen)。

1.2 方 法

1.2.1 重組恥垢分枝桿菌的構(gòu)建 利用引物設(shè)計軟件Premier 5.0，根據(jù)NCBI GenBank (基因序列號NC_008596.1)中恥垢分枝桿菌MSMEG_6171基因序列設(shè)計引物，以恥垢分枝桿菌的基因組為模板，擴增MSMEG_6171基因，引物序列見表1。PCR純化產(chǎn)物和質(zhì)粒pMV261進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切，將回收純化的雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(30 μg/mL 卡那霉素)，挑取單菌落培養(yǎng)并進(jìn)行菌落PCR檢測陽性克隆并測序驗證。將構(gòu)建成功的pMV261-MSMEG_6171重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)(電壓2.5 kV，電阻1 000 Ω，電容25 μf)進(jìn)入恥垢分枝桿菌感受態(tài)中，以空載質(zhì)粒作對照。均勻涂布于含30 μg/mL卡那霉素的7H10固體平板上，培養(yǎng)2～3 d，菌落PCR檢測陽性克隆。

1.2.2 總RNA的提取和RNA-seqMsm::6171和WT菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，F(xiàn)astprep 24裂解菌體，用Trizol法提取總RNA，通過Nanodrop檢測RNA純度，6% Urea PAGE鑒定總RNA完整性。將RNA樣本保存于干冰中，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和生物信息學(xué)分析。通過 Illumina 二代高通量測序平臺進(jìn)行測序，每組 3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 real-time RT-PCR 在NCBI GenBank 中查找基因序列，通過NCBI Primer-BLAST在線軟件設(shè)計實時定量引物，PCR的引物序列見附表1。cDNA合成采用HiScript○RIII RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒。以cDNA為模板擴增目的基因片段。使用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行qPCR反應(yīng)，qPCR反應(yīng)采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，擴增體系和擴增條件參照試劑盒說明書。根據(jù)反應(yīng)得到的 CT 值，經(jīng)2-△△CT方法計算基因表達(dá)變化。

1.2.4 基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和定量分析 滅活的恥垢分枝桿菌用Fastprep-24TM裂解細(xì)菌(頻率6.5，時間30 s，裂解2次)，離心取上清，用0.22 μm過濾器過濾上清即為菌體蛋白樣品，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。SDS-PAGE 檢測總蛋白提取質(zhì)量，采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(Merck)進(jìn)行定量。每個樣品取 100 μg 蛋白，補齊至相同體積后加入3.3 μg 胰蛋白酶消化24 h。按照試劑盒的操作步驟對得到的肽段溶液進(jìn)行iTRAQ 6-plex kits標(biāo)記，對照組分別標(biāo)記為iTRAQ reagent 114、115、116的iTRAQ同位素標(biāo)簽。Msm::6171過表達(dá)組分別標(biāo)記為117、118、121的iTRAQ同位素標(biāo)簽，室溫反應(yīng)2 h。將標(biāo)記后的樣品混合，真空冷凍離心干燥。將干燥后的混合樣品采用反相高 pH液相的方法進(jìn)行脫鹽和分級處理，真空干燥后，通過Dionex Ultimate3000高效液相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫分離。使用Thermo Q-Exactiver對樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 生物信息學(xué)分析 RNA-seq的下機數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾后，采用Bowtie2 比對軟件進(jìn)行分析。根據(jù)readcount數(shù)據(jù)來進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，對顯著差異表達(dá)基因篩選的閾值設(shè)置為|log2(FoldChange)| > 1 且qvalue < 0.05。運用 ProteinPilot 4.5對蛋白進(jìn)行定量分析和差異蛋白質(zhì)的篩選，設(shè)置蛋白可信度在95%以上，/CV/≥0.5去除重復(fù)性不好的蛋白，在P≤0.05基礎(chǔ)上選取fold change≥2為上調(diào)蛋白，fold change≤0.50為下調(diào)蛋白。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，進(jìn)行一直表達(dá)的下調(diào)和上調(diào)基因的篩選。使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行Gene Ontology和KEGG富集分析[8]。以person相關(guān)系數(shù)為評價指標(biāo)計算基因mRNA水平和蛋白質(zhì)水平表達(dá)的遺傳相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建MSMEG_6171 基因過表達(dá)菌株 以恥垢分枝桿菌mc2155的基因組DNA為模板，擴增得到968 bp特異性PCR產(chǎn)物，與預(yù)期的MSMEG_6171片段大小一致(圖1A)。進(jìn)一步成功構(gòu)建pMV261-MSMEG_6171 表達(dá)載體，并挑取重組載體轉(zhuǎn)化后的單克隆進(jìn)行菌液PCR驗證(圖1B)。pMV261-MSMEG_6171 電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌后，提取野生型恥垢分枝桿菌(WT)和過表達(dá)MSMEG_6171 的恥垢分枝桿菌(Msm::6171)總RNA進(jìn)行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示，與WT相比，Msm::6171菌株中MSMEG_6171的表達(dá)水平顯著提高(圖1C)。

注：A為MSMEG_6171全長的PCR擴增產(chǎn)物；B為MSMEG_6171過表達(dá)恥垢分枝桿菌菌液PCR驗證，1,2,3泳道均為驗證陽性的菌株；C為Msm::6171和WT菌株中MSMEG_6171基因 real-time RT-PCR表達(dá)分析。圖1 成功構(gòu)建了MSMEG_6171 基因過表達(dá)菌株Msm::6171Fig.1 Construction of MSMEG_6171 overexpressionstrain (Msm::6171)

2.2 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的比較分析 為了深入揭示MSMEG_6171在恥垢分枝桿菌生長過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們收取了WT和Msm::6171菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示(圖2A)，與野生型相比,Msm::6171菌株有819個基因的表達(dá)水平顯著上調(diào), 775個基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。對照蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，與野生型相比,Msm::6171菌株有286個蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào), 222個蛋白的表達(dá)水平出現(xiàn)顯著下調(diào)(圖2B)。兩組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)有38個基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平都顯著上調(diào), 有31個基因都顯著下調(diào)(圖2C)。Person相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，篩選的差異表達(dá)基因在轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)(r=0.857，P<0.05)(圖2D)。

注：A為DESs火山圖；B為DEPs火山圖；C為DEGs和DEPs的Venn圖，篩選獲得表達(dá)趨勢一致的基因，藍(lán)色圈和紅色圈分別代表DEGs和DEPs；D為pearson相關(guān)性分析。圖2 Msm::6171菌株轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)分析Fig.2 Transcriptomic and proteomic analysis of the Msm::6171strain

對這些表達(dá)趨勢一致的基因進(jìn)行GO和KEGG分析，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)的38個基因, 生物過程(biological process, BP)主要富集在甘油分解過程和3磷酸甘油代謝過程和CO2固定過程，分子功能(molecular function, MF)主要富集在ATP結(jié)合和酶活性；通過KEGG分析(FDR<0.05)，顯著富集的通路主要有代謝通路、不同環(huán)境下的微生物代謝以及甘油酯代謝等(圖3)。轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平均下調(diào)的31個基因，生物過程主要富集在翻譯過程，分子功能顯著富集在核糖體的結(jié)構(gòu)組成部分以及核糖體RNA 結(jié)合，細(xì)胞組分(cellular component, CC)顯著富集在核糖體和核糖體亞基；KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)下調(diào)的差異表達(dá)基因集中于核糖體和代謝通路。

注：A為GO富集分析(BP：生物過程；MF：分子功能；CC：細(xì)胞組分)；B為KEGG通路富集分析。圖3 表達(dá)趨勢一致基因的GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of genes with consistent expression

2.3 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證 38個顯著上調(diào)基因中，選取顯著富集到KEGG通路上的基因(10個)為候選基因，31個顯著下調(diào)基因中有16個為核糖體蛋白編碼基因，從中選取5個表達(dá)差異倍數(shù)大的基因作為候選基因，用qRT-PCR對選取的15個候選基因進(jìn)行實時熒光定量 PCR 的驗證，結(jié)果顯示，通過 qRT-PCR 測定的基因表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測序結(jié)果保持一致(圖4)。

圖4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證Fig.4 qRT-PCR validation of differentially expressed genes

3 討 論

基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MSMEG_6171的同源蛋白Rv3660c在細(xì)胞形態(tài)和適應(yīng)性代謝中發(fā)揮著重要作用。在我們之前的研究中從代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)的角度報道了MSMEG_6171過表達(dá)可以通過誘導(dǎo)甘油酯和磷脂的改變來調(diào)節(jié)脂質(zhì)的合成和代謝，從而改變分枝桿菌胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，并增強對抗生素的耐藥性。本實驗利用構(gòu)建的MSMEG_6171過表達(dá)的恥垢分枝桿菌，通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的對比分析, 深入挖掘了MSMEG_6171的下游信號網(wǎng)絡(luò), 并篩選了一批受MSMEG_6171特異調(diào)控的關(guān)鍵靶向基因并進(jìn)行驗證，為深入研究MSMGE_6171的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和相互作用蛋白提供了新的認(rèn)識和重要參考。

近年來, 多組學(xué)聯(lián)合分析已逐漸成為生命科學(xué)研究的新熱點，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合分析, 可以深入理解基因和蛋白質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系[9-10]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析, 挖掘MSMEG_6171可能調(diào)控的相關(guān)候選基因, 發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)到69個差異基因顯著差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)38個，下調(diào)表達(dá)31個, 通路富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要集中在代謝通路、不同環(huán)境下的微生物代謝，甘油酯代謝以及脂肪酸合成與代謝等，生物過程主要富集在甘油分解過程和3磷酸甘油代謝。參與代謝過程的MSMEG_4757，MSMEG_4329，glpK，hybA，hybC，MSMEG_0685，MSMEG_1986，MSMEG_3464，MSMEG_4263的表達(dá)量在MSMEG_6171過表達(dá)時表現(xiàn)出上調(diào)，這些基因可能作為研究恥垢分枝桿菌代謝分子機制的關(guān)鍵候選基因。其中MSMEG_4757(脂肪酸合成酶)和MSMEG_4329(丙酰輔酶A羧化酶)參與脂肪酸生物合成與代謝途徑；glpK是一種甘油激酶，研究顯示甘油激酶在分枝桿菌的生長和新陳代謝過程中發(fā)揮重要的作用[11]。在下調(diào)的基因中，16個核糖體蛋白基因，且主要富集在發(fā)揮核糖體的裝配以及核糖體RNA 結(jié)合。核糖體蛋白除了在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮著重要作用外，還具有其他的生物學(xué)功能。2015年，有研究人員發(fā)現(xiàn)一種抗生素先導(dǎo)物，它可調(diào)控通過核糖開關(guān)抑制細(xì)菌生長[12]。最新的一篇綜述報道顯示，在不利環(huán)境的誘導(dǎo)下，細(xì)菌核糖體下調(diào)其活性，并表現(xiàn)出翻譯不活躍[13]，而本研究中，下調(diào)基因的生物過程主要富集在翻譯過程。我們之前研究結(jié)果顯示MSMEG_6171過表達(dá)導(dǎo)致恥垢分枝桿菌生長緩慢，引起這一變化的原因可能是隨著生長的進(jìn)行，菌體內(nèi)活性氧水平逐漸升高，但菌體中的氧化應(yīng)激引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，在核糖體蛋白基因的表達(dá)上表現(xiàn)出效應(yīng)，因而使得在表達(dá)的核糖體蛋白基因減少[14]。

基于以上的分析結(jié)果, 我們推測在MSMEG_6171過表達(dá)后，一方面會影響核糖體蛋白基因的表達(dá)導(dǎo)致恥垢分枝桿菌生長緩慢; 另一方面在代謝過程中, 與脂類物質(zhì)的合成和代謝相關(guān)的MSMEG_4757，MSMEG_4329，glpK等成員, 它們的蛋白表達(dá)水平也很可能受到MSMEG_6171的調(diào)控, 同時還可能激活包括MSMEG_1986在內(nèi)的乙醛酸和二羧酸代謝的表達(dá)，這些蛋白很可能就是受到MSMEG_6171的正向調(diào)控。除了這些已知功能的基因, 我們還挖掘了一些受MSMEG_6171調(diào)控的蛋白, 比如MSMEG_1244、MSMEG_1246、MSMEG_1887、MSMEG_2267、MSMEG_2268等, 為后續(xù)選擇候選基因深入研究各層次的修飾及功能調(diào)控提供了參考。

利益沖突：無

引用本文格式：譚秋嬋，魏文靜，陳珣珣，等. MSMEG_6171在恥垢分枝桿菌中的表達(dá)及多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(11)：982-987. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.141