劉鑫，張亞紅，袁苗，黨仕卓，周娟

‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組分析

1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，銀川 750021

【目的】葡萄是我國(guó)重要的果樹(shù)樹(shù)種，花芽分化直接影響葡萄的質(zhì)量和數(shù)量。對(duì)‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中的花芽進(jìn)行比較分析，探索‘紅地球’葡萄花芽分化機(jī)制，挖掘關(guān)鍵基因，為了解‘紅地球’葡萄花芽分化提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā繉?duì)‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中4個(gè)發(fā)育階段：S1（未分化期）、S2（花原始體發(fā)育期）、S3（花序主軸發(fā)育期）和S4（花序二級(jí)軸發(fā)育期）的芽進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和植物激素測(cè)定，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中共發(fā)現(xiàn)13 729個(gè)差異基因，其中S1-S2、S2-S3、S3-S4和S1-S4分別有4 158、2 050、3 425和7 652個(gè)差異基因。在S1-S4差異基因的富集調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)差異基因在激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脫落酸代謝過(guò)程、對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)和植物細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生等通路富集。在激素介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)大量與生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸等相關(guān)基因，測(cè)定表明，生長(zhǎng)素在S2時(shí)期含量最高，而在S3和S4時(shí)期含量最低；赤霉素含量在花芽分化過(guò)程中不斷降低，在S4時(shí)期為S1時(shí)期的80%；脫落酸含量在S1和S4時(shí)期較高，而在S2時(shí)期最低。此外，S1-S4差異基因來(lái)自轉(zhuǎn)錄因子家族（MYB、ERF、bHLH和MADS-box等），表明這些轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與了‘紅地球’葡萄花芽分化。對(duì)差異表達(dá)的13個(gè)MADS-box家族基因進(jìn)一步分析表明，、、、和在花芽分化進(jìn)程中表達(dá)上調(diào)，而、、、和表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些MADS-box基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，基因表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致且相關(guān)系數(shù)較高，表明數(shù)據(jù)分析結(jié)果可靠?！窘Y(jié)論】‘紅地球’葡萄花芽分化是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，其中，植物激素介導(dǎo)的信號(hào)通路以及MADS-box家族基因在花芽分化中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果提供了一個(gè)關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子、基因和激素的信息，有助于揭開(kāi)這一復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，并為‘紅地球’葡萄花芽分化綜合模型的建立提供理論基礎(chǔ)。

‘紅地球’葡萄；花芽分化；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；植物激素；MADs-box

0 引言

【研究意義】葡萄是多年生藤本果樹(shù)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是我國(guó)重要的果樹(shù)樹(shù)種。在溫帶地區(qū)，‘紅地球’葡萄表現(xiàn)出季節(jié)性開(kāi)花，在第一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，夏季和秋季發(fā)生花芽分化，冬季休眠，于翌春后進(jìn)入花器官發(fā)育并開(kāi)花[1]。良好的花芽分化是實(shí)現(xiàn)可觀產(chǎn)量的前提，研究花芽分化基因表達(dá)特性并合理利用，對(duì)了解‘紅地球’葡萄花芽分化以及解決‘紅地球’花芽分化相關(guān)問(wèn)題具有重要指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花芽分化是對(duì)來(lái)自外部環(huán)境和內(nèi)部因素的信號(hào)整合做出的復(fù)雜反應(yīng)過(guò)程[2]，在模式植物擬南芥中，鑒定出多個(gè)基因調(diào)控成花轉(zhuǎn)變，主要涉及6種調(diào)控途徑：春化、光周期、赤霉素、糖代謝、自主和衰老途徑[3]。這些途徑介導(dǎo)和整合開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)，如FLOWER LOCUS T（）、CONSTANS（）、FLOWERING LOCUS C（）、SUPPRESSOR OF CO1（）、LEAFY（）、APETALA1（）、AGAMOUS（）、APETALA2（）和APETALA3（），不可逆地誘導(dǎo)植物從營(yíng)養(yǎng)分生組織轉(zhuǎn)變到花分生組織，在葡萄花芽分化調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用[4]。是成花抑制因子，介導(dǎo)春化和自主途徑，而是活化劑并介導(dǎo)光周期途徑，兩個(gè)基因都調(diào)節(jié)下游、和的表達(dá)[5]。FT蛋白質(zhì)復(fù)合物激活分生組織特征基因和調(diào)控植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變[6-7]，、和等花器官特征基因在MADS-box轉(zhuǎn)錄因子控制下誘導(dǎo)花器官發(fā)育[8]。此外，植物激素響應(yīng)環(huán)境變化，調(diào)控內(nèi)部養(yǎng)分分配，甚至直接調(diào)控成花基因的表達(dá)[9]，與果樹(shù)花芽分化密切相關(guān)。生長(zhǎng)素通過(guò)調(diào)節(jié)參與花序原基分化[10]，IAA含量較低時(shí)促進(jìn)‘巨峰’葡萄花芽分化[11]，卻導(dǎo)致‘夏黑’葡萄不能形成良好的花芽[12]。GAs參與植物各種發(fā)育過(guò)程，包括開(kāi)花轉(zhuǎn)換的啟動(dòng)、花原基和花器官發(fā)育[13]。在擬南芥中，GAs通過(guò)調(diào)控花整合基因和以及花分生組織特征基因誘導(dǎo)開(kāi)花[14]，而在葡萄樹(shù)中，促進(jìn)側(cè)生分生組織分化，抑制花序發(fā)育[15]。ABA是啟動(dòng)果實(shí)成熟的激素信號(hào)，在花芽分化過(guò)程中也具有重要作用[16]。ABA主要影響轉(zhuǎn)錄激活下游的表達(dá)[17]，高濃度時(shí)有利于葡萄[18]和荔枝[19]孕育花芽?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然一些研究報(bào)道了‘紅地球’葡萄花芽分化，但僅對(duì)花芽分化進(jìn)行形態(tài)和生理信息的研究，而花芽分化過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尚沒(méi)有得到充分的解析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以前期試驗(yàn)為基礎(chǔ)，對(duì)‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中4個(gè)發(fā)育階段進(jìn)行形態(tài)學(xué)、植物激素以及高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以發(fā)現(xiàn)可能參與花芽分化的基因，為‘紅地球’葡萄花芽分化調(diào)控以及栽培管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年在銀川市賀蘭縣園藝產(chǎn)業(yè)園（106°16′E，38°20′ N）15號(hào)陰陽(yáng)結(jié)合型日光溫室的陰棚內(nèi)進(jìn)行，屬中溫帶大陸性氣候。試驗(yàn)材料為10年生‘紅地球’（cv. Red Globe）葡萄，株行距為0.8 m×1.5 m。分4個(gè)采樣日期（S1：4月30日；S2：6月15日；S3：7月30日；S4：9月15日），用無(wú)菌手術(shù)刀取下第5節(jié)芽。一部分樣品放在FAA固定液中固定；另一部分立即在液氮中冷凍，然后儲(chǔ)存在-80℃冰箱。選擇固定的上午9:00進(jìn)行采樣以減少由于晝夜節(jié)律而導(dǎo)致基因表達(dá)差異的可能性。

1.2 花芽石蠟切片

花芽樣品固定在FAA溶液（甲醛-乙酸-乙醇）中，并在乙醇系列中脫水（70%、80%、95%、95%、100%梯度酒精進(jìn)行脫水，每梯度30 min）。隨后在脫水機(jī)中經(jīng)二甲苯透明15 min。然后將組織在脫水機(jī)中于60℃液態(tài)石蠟中浸蠟90 min。將浸蠟后的組織從脫水機(jī)中取出，置于組織包埋機(jī)（Leica EG1150H）中。用尖頭鑷夾取包埋盒中的組織，在組織包埋機(jī)工作臺(tái)面上修塊后，將組織平面朝下進(jìn)行包埋。含有花芽的石蠟塊用半自動(dòng)切片機(jī)（Leica RM2245）切片，番紅固綠染色，中性樹(shù)膠封片[20]。在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX53）下觀察，使用SC180型圖像分析系統(tǒng)獲得圖像。

1.3 測(cè)定植物激素水平

花芽加入1 mmol?L-1的二叔丁基甲苯酚（BHT）和80%的甲醇及少量的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）研磨提取后，在4℃冰箱內(nèi)提取4 h。8 000 r/min離心15 min，將殘?jiān)糜陔x心機(jī)中離心1 h，合并上清液用C膠柱除去色素，移入離心管，然后在40—50℃下N吹干并定容。選用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫試劑盒，使用酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS-352）測(cè)定花芽中生長(zhǎng)素、赤霉素和細(xì)胞分裂素含量[21]。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序原始數(shù)據(jù)（raw reads）加工處理后得到高質(zhì)量純凈數(shù)據(jù)（clean reads），使用HISAT2軟件與參考基因組（http://plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Info/ Index）進(jìn)行比對(duì)，獲得mapped reads并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估供后續(xù)分析。使用DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析，F(xiàn)PKM（Fragments Per Kilobases per Millionreads）值以|log2fold changes|≥1，-adjust≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出各樣本間的差異表達(dá)基因。將得到的差異基因和Nr（NCBI non-redundant protein）數(shù)據(jù)庫(kù)、Swiss-Prot（swiss-Prot proteinsequence）數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)、COG（clusters of orthologousgroups of proteins）數(shù)據(jù)庫(kù)、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（The Pfam protein families database）和GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)其蛋白功能注釋和分類統(tǒng)計(jì)。

1.5 MADS-box基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR分析

對(duì)13個(gè)差異MADS-box基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析，（GenBank：XP_008654957.1）為內(nèi)參基因，引物由Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)（表1），生物工程（上海）股份有限公司合成。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品與RNA樣品為同一批，qRT-PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）。反應(yīng)體系共20 μL：onestep RT-qPCR Master Mix 10 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL，Template （RNA）1 μL，RT enzyme Mix 0.65 μL，ddH2O 7.55 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸30 s，40次循環(huán)，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)水平[22]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 不同階段的花芽發(fā)育

對(duì)花芽的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行形態(tài)特征分析（圖1）。S1階段（未分化期）：芽體扁小，綠色，生長(zhǎng)點(diǎn)呈錐形，細(xì)胞排列緊密有序，細(xì)胞大小均一，芽鱗未木質(zhì)化，無(wú)絨毛出現(xiàn)。S2階段（花原始體發(fā)育期）：芽體膨大，綠色，此時(shí)花芽開(kāi)始分化，生長(zhǎng)點(diǎn)趨于平坦，芽體增大，無(wú)絨毛。S3階段（花序主軸發(fā)育期）：芽體變得豐滿，轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?，花芽進(jìn)一步分化，生長(zhǎng)錐側(cè)面形成花序原基，鱗片內(nèi)出現(xiàn)少量絨毛。S4階段（花序二級(jí)軸發(fā)育期）：芽體堅(jiān)硬，深褐色，鱗片半木質(zhì)化，花芽進(jìn)入花序二級(jí)軸發(fā)育期，花序原基增大，花芽?jī)?nèi)絨毛增多。因此，基于形態(tài)學(xué)，將4個(gè)花芽分化階段（S1—S4階段）用于高通量RNA-seq研究。

2.2 RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析及序列比對(duì)

原始數(shù)據(jù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)是堿基的質(zhì)量以及堿基的分布。利用Illumina平臺(tái)，對(duì)12個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共得到93.27 Gb clean reads，各樣品clean reads均在6.19 Gb以上，GC堿基占比在45.42%—46.42%，Q30堿基占比在93.5%及以上，測(cè)序數(shù)據(jù)良好，可進(jìn)行后續(xù)的比對(duì)分析。本高通量測(cè)序得到total reads在43 004 638—57 000 078，比對(duì)到參考基因組reads在33 306 442—52 283 600，各樣品的序列標(biāo)簽與參考基因組的比對(duì)效率在77.45%—93.2%。

對(duì)組裝獲得的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布進(jìn)行分析，所占比例最大的是601—1 200 bp，占22.34%（13 513條），其次為 1 201—1 800 bp和0—600 bp，分別占21.16%（12 800條）和18.13%（10 969條）。序列組裝并與參考基因組比對(duì)后，獲得已知基因25 844個(gè)，新基因3 245個(gè)。獲得的25 844條Unigene與6個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列比對(duì)分析，93.56%能夠注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)，98.55%能夠注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)，78.87%能夠注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，79.35%能夠注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)，而注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的基因只有44.46%。將這些基因進(jìn)行GO富集分析，GO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋的共有23 264條Unigene（90.02%）。

A：生長(zhǎng)點(diǎn)；LP：葉原基；IP：花序原基；BR：苞片；BP：分枝原基

表2 質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.3 不同分化階段基因差異表達(dá)

為了探究樣品在不同時(shí)間段內(nèi)的基因表達(dá)模式，將表達(dá)數(shù)據(jù)基于短時(shí)間序列表達(dá)挖掘器（STEM），采用Kmeans時(shí)序聚類算法分析，總共13 729個(gè)基因被聚為10個(gè)profile（圖2-A）。屬于profile1、9和10的共9 508個(gè)基因差異顯著（＜0.001），而屬于profile2—8的4 221個(gè)基因沒(méi)有顯著差異（＞0.05）。基于maSigPro對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)行時(shí)序差異分析（圖2-b），采用hclust時(shí)序聚類算法，結(jié)果表明花芽分化不同階段基因表達(dá)水平逐步上升，S4時(shí)期表達(dá)水平最高。

圖2 基因差異表達(dá)模式

以|log2fold changes|≥1、-adjust＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3-a）。其中S1-S2之間共有4 158個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因2 262個(gè)，下調(diào)基因1 896個(gè)；S2-S3之間共有2 050個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因919個(gè)，下調(diào)基因1 131個(gè)；S3-S4之間共有3 425個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因 1 004個(gè)，下調(diào)基因2 421個(gè)；而S1-S4之間差異基因最多，共有7 652個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因3 342個(gè)，下調(diào)基因4 310個(gè)。此外，通過(guò)維恩圖（圖3-b）對(duì)差異基因進(jìn)行成對(duì)比較。S1-S2、S2-S3和S3-S4之間發(fā)現(xiàn)77個(gè)共有差異基因，4個(gè)對(duì)比中發(fā)現(xiàn)210個(gè)共有差異基因。

圖3 差異基因?qū)Ρ?/p>

2.4 差異表達(dá)基因GO功能分析

為深入了解不同組之間的基因功能差異，GO注釋分析這些差異基因并展示生物過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）前20的GO富集條目（圖4）。S1—S4中共有6 943個(gè)差異基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)，在生物過(guò)程中，差異基因集中在細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和生物調(diào)節(jié)，數(shù)目分別為3 430、3 378和1 485；在細(xì)胞組分中，差異基因集中在細(xì)胞部分、膜部分、細(xì)胞器和膜，數(shù)目分別為4 098、2 784、2 533和2 369；在分子功能中，差異基因集中在結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性，數(shù)目分別為4 043、3 572和471。

圖4 差異基因功能

2.5 花芽發(fā)育過(guò)程的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了揭示‘紅地球’葡萄花芽發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組特征，對(duì)S1—S4表達(dá)差異基因構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)（圖5），并進(jìn)行了GO富集分析，從生物過(guò)程上了解發(fā)現(xiàn)的基因簇是否與花芽分化功能相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異基因在激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脫落酸代謝過(guò)程、對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)和植物細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生等通路富集。在激素介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)大量與生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸等相關(guān)基因，表明這些激素在‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在生長(zhǎng)素相關(guān)基因中，、、、、、以及在S1和S2期間高表達(dá)，而在S3和S4時(shí)期表達(dá)較低，S3時(shí)期、、、表達(dá)較高，S4時(shí)期、、、、、、、表達(dá)較高。在GAs相關(guān)基因中，和在S1和S2時(shí)期較高表達(dá)，、和在S3和S4時(shí)期表達(dá)較高。在ABA相關(guān)基因中，在S1時(shí)期表達(dá)較高，在S3時(shí)期表達(dá)較高，在S4時(shí)期表達(dá)較高。此外，富集分析表明，較大的富集通路還包括磷代謝過(guò)程、氧化還原過(guò)程、蛋白質(zhì)磷酸化和陽(yáng)離子跨膜運(yùn)輸?shù)取?/p>

圖5 差異基因的GO富集網(wǎng)絡(luò)互作（S1—S4）

2.6 花芽分化過(guò)程中的激素變化

在GO富集網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)大量生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸等激素介導(dǎo)的信號(hào)，因此，對(duì)不同分化階段芽中的生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸進(jìn)行了測(cè)定（圖6）?？梢钥闯觯琒2時(shí)期的花芽中生長(zhǎng)素含量最高，顯著高于其他時(shí)期，而在S3和S4時(shí)期含量最低。赤霉素含量在花芽分化過(guò)程中不斷降低，S1時(shí)期最高，但與S2、S3無(wú)顯著差異，在S4時(shí)期最低，為S1的80%?；ㄑ恐忻撀渌岷吭赟1時(shí)期較高，S2時(shí)期迅速降低，在花芽分化后期逐漸上升。

豎線是平均值±SD（n=3），不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

2.7 花芽分化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于發(fā)育調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要，因此，對(duì)S1—S4差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)了來(lái)自43個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族編碼的378個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因。其中，MYB家族異基因43個(gè)，ERF家族差異基因40個(gè)，bHLH家族基因33個(gè)，以及MADs-box家族基因13個(gè)。在植物中，MADS-box基因是花發(fā)育過(guò)程的主要調(diào)節(jié)因子，13個(gè)MADS-box基因在花芽發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)，表明這些轉(zhuǎn)錄因子在‘紅地球’葡萄花芽發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。根據(jù)是否包含K結(jié)構(gòu)域?qū)?3個(gè)MADS-box家族基因歸類為I型（包括Mα、Mβ、Mγ和Mδ）或II型（MIKC型）（表3）。

表3 花芽分化中差異MADS-box基因

2.8 花芽中表達(dá)差異的MADS-box基因

利用MEGA 11.0對(duì)獲得的MADS-box基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析參數(shù)使用Neighbor- Joining（NJ）法則模型構(gòu)建，并進(jìn)行1 000次Bootstrap重復(fù)。引入擬南芥MADS-box家族蛋白信息對(duì)‘紅地球’葡萄MADS-box蛋白進(jìn)行亞家族分類。擬南芥MADS-box蛋白序列下載于植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）。黑色和紅色的圓點(diǎn)表示葡萄MADS-box蛋白，紅點(diǎn)表示‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中差異表達(dá)的基因。

‘紅地球’葡萄I型MADS-box基因包括來(lái)自Mα、Mβ、Mγ和Mδ亞類的成員（圖7）。其中14個(gè)基因?qū)儆贛α，1個(gè)基因?qū)儆贛γ，3個(gè)基因?qū)儆贛δ。‘紅地球’葡萄中存在7個(gè)I型亞家族，在S1—S4花芽發(fā)育過(guò)程中，差異表達(dá)的3個(gè)I型MADS-box轉(zhuǎn)錄因子屬于Mα亞類中的AGL24亞家族和Mδ亞類中的AGL33亞家族?！t地球’葡萄II型MADS-box基因包含14個(gè)亞家族，有7個(gè)在擬南芥和‘紅地球’葡萄具有相同數(shù)量的基因（圖8）。在SVP和AGL32亞家族中，擬南芥只包含1個(gè)基因，而‘紅地球’葡萄則分別有5個(gè)和3個(gè)。在S1—S4花芽發(fā)育過(guò)程中，差異表達(dá)的10個(gè)II型MADS-box轉(zhuǎn)錄因子來(lái)自于8個(gè)亞家族，其中，AGL17和SEP各有2個(gè)差異基因，AGL15、SVP、AGL32、SOC1、AGL12和AGL6各有1個(gè)差異基因。

2.9 MADS-box基因的表達(dá)與定量PCR驗(yàn)證

為了研究差異MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因在‘紅地球’葡萄花芽分化中的作用，通過(guò)qRT-PCR分析時(shí)空表達(dá)模式，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，兩者表達(dá)趨勢(shì)一致且相關(guān)系數(shù)較高，表明數(shù)據(jù)分析結(jié)果可靠（圖9）。II型MADS-box基因8在未分化期表達(dá)量較低，進(jìn)入花芽分化后表達(dá)量提高2.5倍；表達(dá)量在花芽分化過(guò)程中持續(xù)上升；在未分化期表達(dá)量較高，在S2時(shí)期僅為S1的1/4，S4時(shí)期不表達(dá)。兩個(gè)基因（VIT_00s0211g00180和VIT_18s0001g07900）表達(dá)趨勢(shì)不同，VIT_ 00s0211g00180在花芽分化各個(gè)階段表達(dá)量都保持較高水平，而VIT_18s0001g07900僅在S3時(shí)期表達(dá)量較高。在花芽分化過(guò)程中表達(dá)量迅速上升，在S4時(shí)期提升12倍；在未分化期表達(dá)量較高，在花芽分化時(shí)表達(dá)量降低50%；在未分化時(shí)表達(dá)量較高，而在S2時(shí)期表達(dá)量迅速降低為1/9，并在花芽分化后期不斷降低；在S1—S3時(shí)期迅速上升，隨后在S4時(shí)期降低；和I型MADS-box基因表達(dá)趨勢(shì)基本相同，在花芽分化期間表達(dá)量持續(xù)降低；此外，兩個(gè)（VIT_17s0000g05000和VIT_14s0083g01050）在花芽分化期表達(dá)量顯著高于未分化期，VIT_17s0000g05000在未分化期表達(dá)量低，在S2—S4時(shí)期提高了30倍，在S3時(shí)期達(dá)到最高；VIT_14s0083g01050在未分化期低表達(dá)，在S2時(shí)期提升40倍，隨后在S3—S4時(shí)期逐漸降低。

圖7 ‘紅地球’葡萄I型MADS-box蛋白之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖8 ‘紅地球’葡萄II型MADS-box蛋白之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

3 討論

葡萄花芽分化是一種復(fù)雜的生理和形態(tài)變化，在其生命周期中起著關(guān)鍵作用[23]?！t地球’葡萄花芽分化歷經(jīng)夏秋季，通過(guò)切片圖顯示，花芽原基在分化時(shí)生長(zhǎng)點(diǎn)趨于平坦，出現(xiàn)一個(gè)隆起，芽體增大產(chǎn)生葉原基，之后在生長(zhǎng)點(diǎn)側(cè)面分化出梗原基，隨著花序原基伸長(zhǎng)，形成多個(gè)分枝原基和苞片原基。對(duì)花芽分化4個(gè)階段的花芽進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到total reads最低為43 004 638，最高達(dá)到57 000 078，平均有90.86%的reads比對(duì)到參考基因組（表2），表明花芽分化受大量基因調(diào)節(jié)。

柱形和折線分別表示qRT-PCR和RNA-seq；r：Pearson相關(guān)系數(shù)；*：P＜0.05

3.1 生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸介導(dǎo)花芽分化

內(nèi)源激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控植物的許多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，參與花芽分化[24-25]、花期[26]和性別分化[27]等過(guò)程。‘紅地球’葡萄花芽分化4個(gè)階段的差異基因GO注釋主要集中在生物過(guò)程，GO富集分析顯示差異基因在生物過(guò)程中富集到激素介導(dǎo)的信號(hào)通路，脫落酸代謝過(guò)程，對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)，植物細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生等通路。在激素介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)大量與生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸等信號(hào)通路的相關(guān)基因，表明這些激素與花芽分化密切相關(guān)。

‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中，生長(zhǎng)素含量先上升后下降，在S2時(shí)期花序原基分化時(shí)含量最高，與駿棗[28]和蘋果[29]花芽分化中變化趨勢(shì)相同。ARF是與生長(zhǎng)素反應(yīng)啟動(dòng)子元件（AuxRE）結(jié)合的蛋白質(zhì)，在將局部生長(zhǎng)素濃度轉(zhuǎn)化為特定基因表達(dá)和成花方面發(fā)揮著核心作用[30]，和調(diào)控花器官大小[31]，和調(diào)控花器官發(fā)育[32]，作用于促進(jìn)花原基形成[33]。此外，與ARF蛋白形成異源二聚體可能會(huì)改變它們調(diào)節(jié)早期生長(zhǎng)素反應(yīng)基因表達(dá)的能力。本研究結(jié)果表明，花芽中在S1和S2時(shí)期表達(dá)量較高，S3和S4低表達(dá)，與生長(zhǎng)素含量趨勢(shì)一致，而在S2和S4時(shí)期表達(dá)量較高，并促進(jìn)其靶基因共表達(dá)，在花芽分化的關(guān)鍵階段發(fā)揮著重要作用。因此，花芽分化過(guò)程中差異表達(dá)的（、、、和）和（、、、、和）可能參與了‘紅地球’葡萄花芽分化。

赤霉素途徑調(diào)控成花是最早被發(fā)現(xiàn)的4條成花途徑之一，GAs激活成花基因表達(dá)，對(duì)多年生木本植物成花具有作用[34]。作為可溶性赤霉素受體與特定的DELLA蛋白相互作用，控制花發(fā)育[35]。本研究中，花芽中赤霉素含量隨著花芽分化進(jìn)程不斷降低，和在S2花芽中上調(diào)表達(dá)，而和在S3花芽中上調(diào)表達(dá)。ABA參與多種非生物脅迫應(yīng)答、植物蛋白質(zhì)合成和成花等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[36]。ABA可磷酸化激活A(yù)BA反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ABA responsive element binding protein，AREB）來(lái)促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄[37]，還調(diào)控MYC轉(zhuǎn)錄因子抑制FT蛋白表達(dá)，而GAs也存在MYC-FT機(jī)制，因此，ABA和GAs可以通過(guò)MYC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)和[38]。此外，ABA可以上調(diào)AP2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)激活轉(zhuǎn)錄，抑制表達(dá)[39]，而GAs對(duì)作用相反[40]，因此，ABA與GAs在調(diào)控影響花芽分化過(guò)程中起拮抗作用?！t地球’葡萄花序原基階段ABA含量最低，在分化后期含量上升，在S1—S2時(shí)期上調(diào)表達(dá)，和在S3—S4時(shí)期上調(diào)表達(dá)?；ㄑ恐泻捅磉_(dá)趨勢(shì)相同，在S1—S4階段持續(xù)上調(diào)表達(dá)，同源基因（）在分化過(guò)程中表達(dá)不斷下調(diào)。綜上，這些ABA和GAs基因在‘紅地球’葡萄花芽分化中通過(guò)調(diào)節(jié)、和等開(kāi)花相關(guān)基因，對(duì)花芽分化具有重要意義。

3.2 MADS-box基因家族在花芽分化過(guò)程中起重要作用

MADS-box基因是植物發(fā)育過(guò)程的主要調(diào)節(jié)器，在花芽發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[41]。葡萄中共有54個(gè)MADS-box家族蛋白，其中，I型（Mα、Mβ、Mγ和Mδ）MADS-box家族蛋白18個(gè)，分為7個(gè)亞家族，II型（MIKC型）MADS-box家族蛋白36個(gè)，分為14個(gè)亞家族，‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)3個(gè)I型和10個(gè)II型MADS-box家族蛋白基因差異表達(dá)。

、和是擬南芥成花的中心啟動(dòng)子[42]，是花分生組織決定基因，在花原基發(fā)育早期階段起作用，同時(shí)又是一個(gè)同源異型基因，決定花器官起始和發(fā)育[43]；和通過(guò)在相同的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合其啟動(dòng)子來(lái)直接調(diào)節(jié)，但它們對(duì)表達(dá)有相反的作用。本研究中，同源基因（）在花芽分化前期低表達(dá)，在花芽分化后期表達(dá)量顯著提高，與（）和同源基因（）表達(dá)模式相反。表明過(guò)表達(dá)促進(jìn)開(kāi)花并將花分生組織轉(zhuǎn)化為花序分生組織，對(duì)和有抑制作用，特異性地促進(jìn)了花序分化[44]；另一方面，花分生組織中適當(dāng)水平的和表達(dá)也是調(diào)控花芽分化所必需的[45]。和作為花抑制因子發(fā)揮冗余作用，有助于控制從營(yíng)養(yǎng)階段到生殖階段的過(guò)渡[46]，SEP亞家族通常發(fā)揮促進(jìn)花芽萌發(fā)的作用[47]。AGL15亞家族的基因，連同和，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段抑制過(guò)早活化[48]。AGL15和SEP亞家族基因（VIT_14s0068g01800和VIT_ 04s0008g01980）在‘紅地球’進(jìn)入花序原基后表達(dá)量開(kāi)始急劇增加，表明模塊也在‘紅地球’葡萄花芽分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。E類開(kāi)花特征基因除外，與AGL6亞家族也密切相關(guān)[49]，本研究中差異表達(dá)的同源基因也證明了這一點(diǎn)。

和分別與或形成異二聚體復(fù)合物，是促進(jìn)花粉成熟的重要調(diào)節(jié)劑復(fù)合物[46]，在甜櫻桃[50]和桉樹(shù)[51]花芽分化的中后期表達(dá)，在雄蕊的早期發(fā)育中發(fā)揮作用?！t地球’葡萄花芽分化過(guò)程中，和表達(dá)模式相反，與前人研究結(jié)果一致，在花芽分化中后期表達(dá)量提高，而主要參與花粉發(fā)育和花粉管生長(zhǎng)后期花粉成熟的調(diào)節(jié)，可能參與形成的異二聚體與花芽分化負(fù)相關(guān)。據(jù)報(bào)道，主要在根中表達(dá)，隨著研究發(fā)現(xiàn)在各種植物組織中都可以檢測(cè)到，甚至參與成花[52]。‘紅地球’花芽分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)同源基因（VIT_00s0211g00180和VIT_18s0001g07900）參與。此外，發(fā)現(xiàn)AGL12和AGL32亞家族也參與到花芽分化中，其中，AGL32同源基因表達(dá)量在花芽分化進(jìn)程中不斷降低，與山櫻花一致[53]；而在先前的研究中，[54]似乎只在根中表達(dá)，推測(cè)在‘紅地球’葡萄花芽分化中具有獨(dú)特作用。

4 結(jié)論

‘紅地球’葡萄花芽分化是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，差異基因在GO網(wǎng)絡(luò)中富集到激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、脫落酸代謝過(guò)程、對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)和植物細(xì)胞壁組織或生物發(fā)生等通路。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，生長(zhǎng)素、赤霉素和脫落酸等激素介導(dǎo)的信號(hào)以及MADS-box家族基因在花芽分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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Transcriptome Analysis During Flower Bud Differentiation of Red Globe Grape

1College of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021;2School of Food & Wine, Ningxia University, Yinchuan 750021

【Objective】Grape is an important fruit tree species of China, and the flower bud differentiation directly affects the quality and quantity of this grape. In this study, Red Globe grape developmental stages during flower bud differentiation under natural growth conditions were compared and analyzed, the mechanism of flower bud differentiation of this grape variant was evaluated, and the essential genes were mined, so as to provide a theoretical basis for understanding the flower bud differentiation of this grape species. 【Method】During flower bud differentiation of the Red Globe grape, the morphological observation, phytohormone determination, and transcriptome sequencing analysis were performed on the buds of four developmental stages, including S1 (undifferentiated), S2 (flower anlagen development), S3 (formation of the main cob of inflorescence), and S4 (formation of the second cob of inflorescence). 【Result】A total of 13 729 differentially expressed genes were determined during the flower bud differentiation process of the ‘Red Globe’ grape, which included 4 158, 2 050, 3 425, and 7 652 genes in S1-S2, S2-S3, S3-S4, and S1-S4, respectively. In the enrichment-regulation network of the S1-S4 differential genes, those differential genes were found to be enriched in the hormone-mediated signaling pathways, abscisic acid metabolism, acid chemical reactions, plant cell wall tissues, or biogenesis. Several genes related to auxin, gibberellin, and abscisic acid were detected in the hormone-mediated signaling pathway. The results revealed that the content of auxin was the highest in S2 and the lowest in S3 and S4. The gibberellin content decreased continuously during flower bud differentiation, 80% of that at S4 in S1; the abscisic acid content was higher in S1 and S4 and the lowest in S2. In addition, the S1-S4 differential genes belonged to the transcription factor families (MYB, ERF, bHLH, and MADS-box), indicating that these family genes were involved in the flower bud differentiation of the Red Globe grape. The further analysis of the 13 differentially expressed MADS-box genes revealed upregulated expressions of,,,, andduring flower bud differentiation. In contrast, the expressions of,,,, andwere downregulated. These MADS-box genes were verified via quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, and the expression trend was found to be consistent with the corresponding transcriptome. 【Conclusion】The flower bud differentiation of the Red Globe grape was a complex biological process. The plant hormone-mediated signaling pathways and the MADS-box family genes played essential roles in flower bud differentiation. These results provided information about transcription factors, genes, and hormones to help understand this complex developmental process and provided a theoretical basis for establishing a comprehensive model for flower bud differentiation in the Red Globe grape.

Red Globe grapes; flower bud differentiation; transcriptome sequencing; plant hormone; MADs-box

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.20.013

2022-01-19；

2022-06-06

寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021BEF02016）、寧夏大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（GIP2020-09）

劉鑫，E-mail：lxinanhao@163.com。通信作者張亞紅，E-mail：zhyhcau@sina.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）