馬雅美，張少紅，趙均良，劉斌

FCS-Like鋅指蛋白OsFLZ18在調(diào)控水稻抽穗期中的作用

馬雅美，張少紅，趙均良，劉斌

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水稻工程實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

【目的】抽穗期是水稻重要的農(nóng)藝性狀，適時(shí)抽穗是確保水稻產(chǎn)量和區(qū)域適應(yīng)性的關(guān)鍵因素。然而，水稻抽穗期調(diào)控的基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)一步研究。已知FCS-like鋅指蛋白是植物特有且在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白家族，但其調(diào)控植物開(kāi)花的功能未知。研究OsFLZs在調(diào)控水稻抽穗期中的功能，有助于完善水稻抽穗期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)為抽穗期遺傳育種提供新的理論基礎(chǔ)和基因資源?！痉椒ā扛鶕?jù)RGAP數(shù)據(jù)庫(kù)公布的基因序列，構(gòu)建的過(guò)量表達(dá)載體和CRISPR-Cas9敲除載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化日本晴愈傷組織，從而獲得相應(yīng)的水稻轉(zhuǎn)基因植株；利用PCR技術(shù)篩選并鑒定敲除純合株系；在水稻生長(zhǎng)過(guò)程中，調(diào)查過(guò)量表達(dá)、敲除植株和日本晴植株的抽穗時(shí)間；采用qRT-PCR方法分析的時(shí)空表達(dá)模式，晝夜節(jié)律性以及對(duì)抽穗期調(diào)控基因表達(dá)的影響；通過(guò)酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證OsFLZ18與調(diào)控水稻抽穗期關(guān)鍵因子的相互作用?！窘Y(jié)果】的表達(dá)無(wú)明顯組織特異性，在14 d的幼苗中表達(dá)量最高，其次是分蘗期的葉鞘和葉片，以及生殖生長(zhǎng)階段的莖和幼穗；成功構(gòu)建了-CRISPR載體，并轉(zhuǎn)入粳稻日本晴中，篩選并鑒定獲得2個(gè)CRISPR敲除純合突變體。采用表達(dá)量較高的2個(gè)OE植株（OE-2和OE-3）以及純合的敲除植株（CRISPR-21和CRISPR-25）進(jìn)行抽穗期表型觀(guān)察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在廣州自然短日照和自然長(zhǎng)日照條件下，OE植株均出現(xiàn)明顯的晚花表型，但是CRISPR敲除植株的抽穗時(shí)間較野生型無(wú)明顯差異。qRT-PCR結(jié)果表明，在人工短日照條件下，與野生型相比，OE-2植株中、、的表達(dá)量明顯被抑制，但的表達(dá)量沒(méi)有明顯的變化。酵母雙雜交試驗(yàn)表明OsFLZ18和正向調(diào)控水稻抽穗期的轉(zhuǎn)錄因子OsMADS51存在互作。同時(shí)，的表達(dá)量存在晝夜節(jié)律性，在白天表達(dá)量低，夜晚表達(dá)量高，并在半夜達(dá)到最高值?！窘Y(jié)論】過(guò)量表達(dá)可以導(dǎo)致水稻延遲抽穗。

水稻；抽穗期；FLZ；OsMADS51

0 引言

【研究意義】水稻作為一種兼性短日照植物，適宜的抽穗期對(duì)于維持水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)有著重要意義。中國(guó)水稻種植面積遼闊，南北氣候差異大，由于對(duì)光溫等條件需求的不同，導(dǎo)致南北水稻品種差異顯著。通過(guò)選育和馴化不同光敏性的水稻品種有利于突破地域限制并提高產(chǎn)量，而解析水稻抽穗期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是培育水稻新品種的基礎(chǔ)。但是，水稻抽穗期的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。因此，鑒定并克隆調(diào)控水稻抽穗期的基因，探索它們之間相互作用關(guān)系，對(duì)于深入了解水稻抽穗期分子調(diào)控機(jī)制和分子育種有著重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】抽穗期是重要的農(nóng)藝性狀，是水稻從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的重要過(guò)程，由內(nèi)部的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和外部的環(huán)境因素共同決定[1-4]。水稻作為兼性短日照植物，葉片通過(guò)感知外界光周期信號(hào)，誘導(dǎo)成花素合成，成花素隨后被轉(zhuǎn)移至頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM），最終激活花器官?zèng)Q定基因表達(dá)而開(kāi)始成花轉(zhuǎn)換。水稻體內(nèi)含有2條重要的光周期調(diào)控途徑。其一是保守于擬南芥的GI-CO-FT途徑的OsGI-Hd1-Hd3a途徑[5]；其二是水稻特有的Ehd1途徑[6]。這兩條途徑最終都將信號(hào)傳遞給成花素。水稻中有2個(gè)成花素基因，它們分別為（）和（）。研究表明，在OsGI-Hd1-Hd3a途徑中，Hd1為核心調(diào)控因子。是擬南芥在水稻中的同源基因，編碼的蛋白含有CX2CX16CX2C鋅指結(jié)構(gòu)域。Hd1具有雙重功能，它在短日照條件下通過(guò)提高成花素基因的表達(dá)而促進(jìn)水稻抽穗，在長(zhǎng)日照條件下則抑制水稻開(kāi)花[7-13]。研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)日照條件下，Hd1可以與Ghd7互作形成蛋白復(fù)合體，特異結(jié)合的啟動(dòng)子，抑制的表達(dá)[11]。進(jìn)一步的研究表明，Hd1、Ghd7和DTH8存在復(fù)雜的遺傳和分子互作關(guān)系。長(zhǎng)日照條件下，Hd1可以與NF-YB型轉(zhuǎn)錄因子DTH8互作形成蛋白復(fù)合物，DTH8-Hd1蛋白復(fù)合物通過(guò)提高Hd3a染色質(zhì)區(qū)域的H3K27me3水平而抑制Hd3a的表達(dá)[12]。此外，長(zhǎng)日照條件下，Hd1、Ghd7和DTH8可以通過(guò)兩兩互作或者3個(gè)蛋白同時(shí)互作，形成不同的蛋白復(fù)合體，部分或者完全抑制Ehd1-Hd3a/RFT1通路，從而延遲水稻抽穗。但在短日照條件下，由于的表達(dá)水平很低，Hd1則可單獨(dú)競(jìng)爭(zhēng)性地促進(jìn)的表達(dá)，從而促進(jìn)水稻開(kāi)花[13]。在Ehd1途徑中，是核心的調(diào)控基因，其編碼一個(gè)水稻中特有的B型響應(yīng)因子[6]。與不同，不受長(zhǎng)短日照的影響，均促進(jìn)水稻抽穗[6, 14]。的精細(xì)調(diào)控對(duì)于水稻抽穗期具有重要意義，目前，已經(jīng)鑒定到多個(gè)基因參與調(diào)控的表達(dá)，比如、、、、、、等[13, 15-20]。其中，編碼一個(gè)Ⅰ型MADS-BOX轉(zhuǎn)錄因子，在短日照條件下，與野生型相比，突變體抽穗時(shí)間延遲2周左右，而過(guò)量表達(dá)植株則提前1周左右抽穗。研究表明，突變體中、和的表達(dá)量下降，過(guò)量表達(dá)植株中、和的表達(dá)量上升，但是的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在突變體和過(guò)量表達(dá)植株中均無(wú)明顯變化。以上研究表明，可能位于的下游，并將的信號(hào)傳遞給[21]。但是，OsMADS51對(duì)下游靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍需要深入研究。FLZ（FCS-Like Zinc-finger protein）是植物所特有的一類(lèi)鋅指蛋白，其含有保守的FLZ（FCS-Like Zinc-finger）結(jié)構(gòu)域[22]。目前，關(guān)于FLZ的研究主要集中在家族鑒定和分析，對(duì)于其具體功能的研究?jī)H有少量報(bào)道。擬南芥中共鑒定19個(gè)FLZ家族基因，大部分AtFLZ基因的表達(dá)受糖、細(xì)胞內(nèi)能量水平和非生物脅迫的調(diào)控，表明FLZ家族基因可能在植物的能量感知和脅迫應(yīng)答等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23-24]。比如，過(guò)量表達(dá)擬南芥/可以增強(qiáng)其對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性[25]，異位表達(dá)小麥FLZ家族基因可以增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性[26]。擬南芥/介導(dǎo)脫落酸調(diào)控的種子休眠與萌發(fā)[27]。Chen等[28]在玉米中鑒定得到37個(gè)ZmFLZ基因，在擬南芥中異位表達(dá)可以增強(qiáng)植株對(duì)ABA的敏感性。最近，筆者研究發(fā)現(xiàn)水稻中多個(gè)OsFLZ基因參與水稻淹水脅迫響應(yīng)，其中，過(guò)量表達(dá)抑制淹水條件下水稻胚芽鞘的伸長(zhǎng)[29]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】FLZs是植物特有且在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮重要作用的蛋白，但是其調(diào)控植物開(kāi)花的功能仍鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)構(gòu)建基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化至日本晴中，并得到轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)植株和敲除轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定、抽穗期表型觀(guān)察、基因定量和相互作用蛋白篩選，明確對(duì)水稻抽穗期的影響，為深入了解水稻抽穗期分子調(diào)控機(jī)制和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻（L.）品種為日本晴（Nipponbare），由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所分子育種研究室保存，大腸桿菌（）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，基因敲除突變體和過(guò)表達(dá)株系的遺傳轉(zhuǎn)化工作交由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司完成，遺傳材料的擴(kuò)繁和表型分析工作在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所的試驗(yàn)田完成。

1.2 敲除載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株的獲得

根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Rice Genome Annotation Project（http://rice.uga.edu/），下載（LOC_ Os06g03520）的CDS序列，利用CRISPR/Cas9基因編輯方法，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)引物（表1），構(gòu)建基因敲除載體。構(gòu)建好的載體交由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，最終獲得敲除轉(zhuǎn)基因植株。

1.3 敲除轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司交付的敲除轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。提取T0代轉(zhuǎn)基因植株的DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，并和野生型基因組DNA進(jìn)行比對(duì)，最后得到編輯突變的轉(zhuǎn)基因苗。將轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行擴(kuò)繁，最終篩選得到純合突變的轉(zhuǎn)基因材料。

1.4 抽穗期表型觀(guān)察

所有的轉(zhuǎn)基因材料種植在位于廣州的廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所實(shí)驗(yàn)基地（113.27°E，23.13°N），其中，4—7月作為天然長(zhǎng)日照處理，8—10月作為天然短日照處理。正季抽穗時(shí)間的調(diào)查每天一次，以單株最先抽出1—2 cm穗子的時(shí)間為抽穗日期，從播種到抽穗日期之間的天數(shù)作為該單株的抽穗期。統(tǒng)計(jì)每個(gè)材料的抽穗期并拍照。

1.5 OsFLZ18的晝夜節(jié)律表達(dá)檢測(cè)

為了檢測(cè)是否存在晝夜節(jié)律表達(dá)，將日本晴播種于人工短日照條件下（光照10 h 28℃/黑暗14 h 26℃）生長(zhǎng)14 d，光照條件下，每隔5 h取樣一次，黑暗條件下，每隔7 h取樣一次，完成連續(xù)48 h取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)均取3個(gè)單株的頂上第一片完全葉。具體試驗(yàn)方法參考Hori等[30]。根據(jù)公式2-ΔΔCT方法計(jì)算在人工短日照條件下的節(jié)律表達(dá)[31]。引物見(jiàn)表1。

1.6 抽穗期重要基因的qRT-PCR檢測(cè)

將轉(zhuǎn)基因材料播種置于光照培養(yǎng)箱中（光照10 h 28℃/黑暗14 h 26℃）生長(zhǎng)14 d，光照條件下，每隔5 h取樣一次，黑暗條件下，每隔7 h取樣一次，連續(xù)完成24 h的取樣，共取樣5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)均取3個(gè)單株的頂上第一片完全葉。將上述取得的樣品用液氮研磨，使用植物RNA提取試劑盒（Magen）提取總RNA，然后使用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用qRT-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因材料中抽穗期調(diào)控基因的表達(dá)量變化。

1.7 酵母雙雜交試驗(yàn)

擴(kuò)增的CDS全長(zhǎng)，連接至pGADT7（AD）載體上，同時(shí)擴(kuò)增的CDS全長(zhǎng)連接至pGBKT7（BD）載體上。將OsFLZ18-AD和BD質(zhì)粒組合，OsMADS51-BD和AD質(zhì)粒組合，以及OsFLZ18-AD和OsMADS51-BD質(zhì)粒組合分別轉(zhuǎn)至酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞中，并分別涂布于酵母二缺（-Trp、-Leu）培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)生長(zhǎng)3 d。挑選酵母單克隆，并稀釋成3個(gè)不同的濃度，點(diǎn)于酵母二缺和四缺（-Trp、-Leu、-His、-Ade）培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)生長(zhǎng)4 d后，觀(guān)察酵母細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照記錄。具體試驗(yàn)操作參考Clonetech試驗(yàn)手冊(cè)。

2 結(jié)果

2.1 OsFLZ18的時(shí)空表達(dá)模式

基因的時(shí)空表達(dá)模式和基因功能密切相關(guān)。為了研究的功能，首先采用qRT-PCR方法分析的時(shí)空表達(dá)模式。以日本晴為研究對(duì)象，收集不同生長(zhǎng)階段以及不同部位的組織或器官，提取RNA后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)的表達(dá)量。結(jié)果表明，的表達(dá)無(wú)明顯時(shí)空特異性，在不同的生長(zhǎng)階段、不同的組織部位均有表達(dá)，但其表達(dá)水平差異較大（圖1）。在14 d苗齡的幼葉中表達(dá)水平最高，其次是分蘗期的葉鞘和葉片、生殖生長(zhǎng)階段的莖和幼穗，而在莖中表達(dá)量最低。

2.2 轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證OsFLZ18在調(diào)控水稻抽穗期中的功能

前期研究中，已構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體（圖2-A），并獲得的過(guò)量表達(dá)植株[29]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證的功能，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的敲除載體并獲得敲除轉(zhuǎn)基因植株。為了鑒定-CRISPR轉(zhuǎn)基因植株是否產(chǎn)生敲除的效果，提取水稻幼苗總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定（圖2-B）。測(cè)序結(jié)果表明，CRISPR-21和CRISPR-25株系為純合且具有基因編輯的植株。其中，CRISPR-21株系的每個(gè)靶點(diǎn)均插入1個(gè)T，CRISPR-25株系在第一個(gè)靶點(diǎn)處插入1個(gè)A，在第二個(gè)靶點(diǎn)處缺失21 bp，從而導(dǎo)致移碼突變。因此，使用CRISPR-21和CRISPR-25株系進(jìn)行表型觀(guān)察。

圖1 qRT-PCR分析OsFLZ18的時(shí)空表達(dá)模式

A：pUBQ10:OsFLZ18:GFP過(guò)表達(dá)載體示意圖；B：基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的敲除植株DNA測(cè)序結(jié)果。下劃線(xiàn)表示PAM位點(diǎn)，紅色字體表示插入的堿基，---表示缺失的堿基序列

在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，與野生型植株相比，的轉(zhuǎn)基因植株無(wú)明顯的表型差異。進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后，CRISPR植株的抽穗時(shí)間也沒(méi)有明顯的差異，但是OE植株延遲抽穗（圖3-A）。在天然的短日照（廣州8—11月）條件下，47 d左右苗齡的CRISPR植株和野生型植株開(kāi)始抽穗，而OE植株的抽穗時(shí)間延遲1周左右（54 d苗齡左右）（圖3-B）。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在自然長(zhǎng)日照條件下（廣州4—7月），OE植株也出現(xiàn)延遲抽穗的表型。結(jié)果表明，負(fù)向調(diào)控水稻抽穗時(shí)間，且有可能不依賴(lài)于光周期。

A：自然短日照條件下（廣州8—11月），OsFLZ18轉(zhuǎn)基因植株抽穗表型分析；B：抽穗時(shí)間統(tǒng)計(jì)。**：P<0.01

2.3 OsFLZ18-OE植株中水稻抽穗期調(diào)控基因的qRT- PCR檢測(cè)

為了進(jìn)一步探討調(diào)控水稻抽穗期的分子機(jī)理，以短日照條件為例，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中一些重要抽穗期調(diào)控基因的表達(dá)量。由于CRISPR植株和野生型相比并沒(méi)有明顯表型差異（圖3），因此，只檢測(cè)OE植株和野生型植株中抽穗期調(diào)控基因的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果表明，在OE-2植株中，的表達(dá)量和野生型相比無(wú)明顯的差異（圖4）。但是，與野生型相比，、和的表達(dá)在OE-2植株中明顯被抑制（圖4）。以上結(jié)果暗示可能通過(guò)調(diào)控、和等基因的表達(dá)而影響水稻抽穗時(shí)間，同時(shí)對(duì)水稻抽穗時(shí)間的調(diào)控可能不依賴(lài)于OsGI-Hd1- Hd3a途徑。

2.4 OsFLZ18與OsMADS51的相互作用

為了深入研究OsFLZ18調(diào)控水稻抽穗期的分子機(jī)制，通過(guò)酵母雙雜試驗(yàn)篩選OsFLZ18與已知的抽穗期調(diào)控蛋白之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsFLZ18和調(diào)控水稻抽穗期的重要轉(zhuǎn)錄因子OsMADS51相互作用（圖5）。

2.5 OsFLZ18的晝夜節(jié)律表達(dá)分析

由于影響水稻抽穗的基因往往都有晝夜節(jié)律性，因此，以人工短日照條件為例，檢測(cè)的晝夜節(jié)律表達(dá)。將日本晴的種子消毒，無(wú)菌播種于1/2MS培養(yǎng)基上，放置于光照培養(yǎng)箱中（光照10 h 28℃/黑暗14 h 26℃）生長(zhǎng)14 d。通過(guò)連續(xù)48 h的取樣并檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有明顯的晝夜節(jié)律性，在白天表達(dá)量較低，在半夜表達(dá)量最高（圖6-A）。同時(shí)，根據(jù)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Rice Expression Profile Database）結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在自然長(zhǎng)日照條件下，的晝夜節(jié)律和人工短日照條件的結(jié)果類(lèi)似，均是在白天表達(dá)量偏低，半夜表達(dá)量較高（圖6-B）。

白色和黑色矩形分別表示24 h內(nèi)的光照和黑暗時(shí)段；ZT：人為設(shè)定的試驗(yàn)時(shí)間；Nip：日本晴；OE-2：OsFLZ18過(guò)表達(dá)植株

圖5 OsFLZ18和OsMADS51互作的酵母雙雜交試驗(yàn)

3 討論

FLZ蛋白是植物特有的一類(lèi)鋅指蛋白，但是，目前FLZ蛋白調(diào)控植物開(kāi)花的機(jī)制仍未見(jiàn)研究報(bào)道。水稻作為重要的糧食作物，抽穗期是極其重要的農(nóng)藝性狀，它對(duì)于水稻產(chǎn)量的維持至關(guān)重要。水稻基因組中含有29個(gè)OsFLZ基因，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)水稻OsFLZ基因參與調(diào)控淹水脅迫響應(yīng)，過(guò)量表達(dá)可以抑制水稻幼苗生長(zhǎng)以及淹水條件下胚芽鞘的伸長(zhǎng)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控水稻抽穗期，首次發(fā)現(xiàn)FLZ基因家族成員具有調(diào)控植物開(kāi)花的功能，同時(shí)也表明在水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的多重調(diào)控功能。

3.1 OsFLZ18負(fù)向調(diào)控水稻抽穗期

本研究發(fā)現(xiàn)，的表達(dá)沒(méi)有嚴(yán)格的組織特異性，在水稻不同的組織和不同的生長(zhǎng)階段皆有表達(dá)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在14 d的幼葉中表達(dá)量最高（圖1）。前人研究結(jié)果表明，在短日照條件下，14 d的日本晴幼苗開(kāi)始進(jìn)入光周期敏感階段[30]，這可能暗示在水稻響應(yīng)光周期調(diào)控以及成花轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮作用。抽穗期的表型觀(guān)察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，與野生型相比，OE和CRISPR植株均無(wú)明顯的表型差異。但是在抽穗期，不論長(zhǎng)短日光照條件，與野生型相比，OE植株均表現(xiàn)出較為明顯的晚花表型，而CRISPR植株無(wú)明顯的表型差異（圖3）。以上結(jié)果表明，負(fù)向調(diào)控水稻抽穗期，同時(shí)OsFLZs之間可能存在功能冗余。近期研究結(jié)果顯示[29]，與、和同源性很高，因此，推測(cè)它們的功能可能存在冗余，協(xié)同調(diào)控水稻開(kāi)花。

A：人工短日照條件下，OsFLZ18的節(jié)律表達(dá)分析；B：自然長(zhǎng)日照條件下，OsFLZ18的節(jié)律表達(dá)分析。數(shù)據(jù)來(lái)源于Rice Expression Profile Database（https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/）。D：白天；N：黑夜

為了進(jìn)一步研究調(diào)控水稻抽穗期的機(jī)制，首先通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)了抽穗期重要調(diào)控基因的表達(dá)情況。在人工短日照條件下，與野生型相比，OE植株中的表達(dá)具有類(lèi)似的表達(dá)模式和強(qiáng)度。但是OE植株中、、的表達(dá)明顯受到抑制（圖4），表明可能通過(guò)Ehd1途徑調(diào)控水稻抽穗期，而并不依賴(lài)于OsGI-Hd1-Hd3a途徑。此外，通過(guò)連續(xù)48 h的取樣和檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)具有明顯的晝夜節(jié)律性，在白天表達(dá)量較低，在半夜表達(dá)量最高（圖6-A）。表明具有晝夜節(jié)律表達(dá)，這可能和它調(diào)控水稻抽穗期的功能密切相關(guān)。

3.2 OsFLZ18和OsMADS51互作共同調(diào)控水稻抽穗期

為了明確OsFLZ18調(diào)控水稻抽穗期的分子機(jī)制，通過(guò)酵母雙雜試驗(yàn)篩選了OsFLZ18和調(diào)控水稻抽穗期的重要因子之間的互作，并發(fā)現(xiàn)OsFLZ18和轉(zhuǎn)錄因子OsMADS51存在互作（圖5）。前人的研究發(fā)現(xiàn)，編碼一個(gè)Ⅰ型MADS-BOX轉(zhuǎn)錄因子，在短日照條件下促進(jìn)水稻抽穗。過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)、和的表達(dá)。但是，在突變體中，、和的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)[21]。進(jìn)一步研究表明位于下游，以及、和上游，它可能將來(lái)自于的信號(hào)傳遞給[21]。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)可以明顯抑制和的表達(dá)（圖4），因此，推測(cè)OsFLZ18可能通過(guò)與OsMADS51蛋白互作，抑制OsMADS51對(duì)于的激活，從而調(diào)控水稻抽穗期，但是該結(jié)論還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

過(guò)表達(dá)可以延遲水稻抽穗，可能參與了OsMADS51-Ehd1-Hd3a模塊介導(dǎo)的抽穗期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

[1] SONG H Y, TRO S, IMAIZUMI T. Flowering time regulation: Photoperiod- and temperature-sensing in leaves. Trends in Plant Science, 2013, 18: 575-583.

[2] 徐銓, 奧本裕, 王曉雪. 水稻開(kāi)花期調(diào)控分子機(jī)理研究進(jìn)展. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2014, 15(1): 129-136.

XU Q, OKUMOTO Y, WANG X X. Research progress on regulatory molecular mechanisms of flowering time in rice. Journal of Plant Genetic Resources, 2014, 15(1): 129-136. (in Chinese)

[3] 王詩(shī)宇, 王志興, 隋亞云, 黃河, 宋曉波, 郭素華. 光周期調(diào)控水稻開(kāi)花期的分子機(jī)制研究進(jìn)展. 北方水稻, 2020, 50(3): 49-52.

WANG S Y, WANG Z X, SUI Y Y, HUANG H, SONG X B, GUO S H. Research progress of the molecular mechanism of photoperiod control rice flowering. North Rice, 2020, 50(3): 49-52. (in Chinese)

[4] 王玉博, 王悅, 劉雄, 唐文幫. 水稻光周期調(diào)控開(kāi)花的研究進(jìn)展. 中國(guó)水稻科學(xué), 2021, 35(3): 207-224.

WANG Y B, WANG Y, LIU X, TANG W B. Research progress of photoperiod regulation in rice flowering. Chinese Journal of Rice Science, 2021, 35(3): 207-224. (in Chinese)

[5] SHRESTHA R, GOMEZ-ARIZA J, BRAMBILLA V, FORNARA F. Molecular control of seasonal flowering in rice,and temperate cereals. Annals Botany, 2014, 114(7): 1445-1458.

[6] DOI K, IZAWA T, FUSE T, YAMANOUCHI U, KUBO T, SHIMATANI Z, YANO M, YOSHIMURA A., a B-type response regulator in rice, confers short-day promotion of flowering and controlsgene expression independently of. Genes & Development, 2004, 18(8): 926-936.

[7] LIN H X, YAMAMOTO T, SASAKI T. Characterization and detection of epistatic interactions of three QTLs, Hd1, Hd2 and Hd3, controlling heading date in rice using nearly isogenic lines. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 101(7): 1021-1028.

[8] YANO M, KATAYOSE Y, ASHIKARI M, YAMANOUCHI U, MONNA L, FUSE T, BABA T, YAMAMOTO K, UMEHARA Y, NAGAMURA Y, SASAKI T., a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to theflowering time gene. The Plant Cell, 2000, 12(12): 2473-2483.

[9] ISHIKAWA R, TAMAKI S, YOKOI S, INAGAKI N, SHINOMURA T, TAKANO M, SHIMAMOTO K. Suppression of the floral activator geneis the principal cause of the night break effect in rice. The Plant Cell, 2005, 17(12): 3326-3336.

[10] KOMIYA R, IKEGAMI A, TAMAKI S, YOKOI S, SHIMAMOTO K.andare essential for flowering in rice. Development, 2008, 135(4): 767-774.

[11] NEMOTO Y, NONOUE Y, YANO M, IZAWA T., aortholog in rice, functions as anrepressor through interaction with monocot-specific CCT-domain protein Ghd7. The Plant Journal, 2016, 86(3): 221-233.

[12] Du A, Tian W, Wei M, Yan W, He H, Zhou D, Huang X, Li S, Ouyang X. The DTH8-Hd1 module mediates day-length-dependent regulation of rice flowering. Molecular Plant, 2017, 10: 948-961.

[13] ZONG W B, Ren D, Huang M H, SUN K L, FENG J L, ZHAO J, XIAO D D, XIE W B, LIU S Q, ZHANG H, QIU R, TANG W J, YANG R Q, CHEN H Y, XIE X R, CHEN L T, LIU Y G, GUO J X. Strong photoperiod sensitivity is controlled by cooperation and competition among Hd1, Ghd7 and DTH8 in rice heading. New Phytologist, 2021, 229(3): 1635-1649.

[14] ZHAO J, CHEN H Y, REN D, TANG H W, QIU R, FENG J L, LONG Y M, NIU B X, CHEN D P, ZHONG T Y, LIU Y G, GUO J X. Genetic interactions between diverged alleles of() and()/() control differential heading and contribute to regional adaptation in rice (). New Phytologist, 2015, 208(3): 936-948.

[15] XUE W Y, XING Y Z, WENG X Y, TANG W J, WANG L, ZHOU H J, YU S B, XU C G, LI X H, ZHANG Q F. Natural variation inis an important regulator of heading date and yield potential in rice. Nature Genetics, 2008, 40(6): 761-767.

[16] MATSUBARA K, YAMANOUCHI U, WANG Z X, MINOBE Y, IZAWA T, YANO M., a rice ortholog of the maizegene, promotes flowering by up-regulating. Plant Physiology, 2008, 148(3): 1425-1435.

[17] LEE Y S, JEONG D H, LEE D Y, YI J, RYU C H, KIM S L, JEONG H J, CHOI S C, JIN P, YANG J, CHO L H, CHOI H, AN G.is a constitutive flowering repressor upstream ofand downstream of. The Plant Journal, 2010, 63(1): 18-30.

[18] JIANG P F, WANG S L, ZHENG H, LI H, ZHANG F, SU Y H, XU Z T, LIN H Y, QIAN Q, DING Y. SIP1 participates in regulation of flowering time in rice by recruiting OsTrx1 to. New Phytologist, 2018, 219: 422-435.

[19] SHENG P, WU F Q, TAN J J, ZHANG H, MA W W, CHEN L P, WANG J C, WANG J, ZHU S S, GUO X P, WANG J L, ZHANG X, CHANG Z J, BAO Y Q, WU C Y, LIU C M, WAN J M. Atranscriptional activator,, functions as a negative regulator of flowering downstream ofand upstream of.

[20] ZHANG H, ZHU S S, LIU T Z, WANG C M, CHENG Z J, ZHANG X, CHEN L P, SHENG P, CAI M H, LI C N, WANG J C, ZHANG Z, CHAI J T, ZHOU L, LEI C L, GUO X P, WANG J L, WANG J, JIANG L, WU C Y, WAN J M. DELAYED HEADING DATE1 interacts with OsHAP5C/D, delays flowering time and enhances yield in rice. Plant Biotechnology Journal, 2019, 17(2): 531-539.

[21] KIM S L, LEE S, KIM H J, NAM H G, AN G.is a short-day flowering promoter that functions upstream of,, and. Plant Physiology, 2007, 145(4): 1484-1494.

[22] LAITY J H, LEE B M, WRIGHT P E. Zinc finger proteins: new insights into structural and functional diversity. Current Opinion in Structural Biology, 2001, 11(1): 39-46.

[23] MANNULLY C T, GOPAN N, LAXMI A. Comprehensive evolutionary and expression analysis ofgene family yields insights into their origin, expansion and divergence. PloS one, 2015, 10(8): e0134328.

[24] JAMSHEER K, LAXMI A. Expression ofgenes is differentially regulated by sugars, cellular energy level, and abiotic stress. Frontiers in Plant Sciences, 2015, 6: 746.

[25] CHEN X, ZHANG Z, VISSER R G F, BROEKGAARDEN C, VOSMAN B. Overexpression ofenhances resistance to aphids in. PLoS One, 2013, 8(8): e70914.

[26] HOU X N, LIANG Y Z, HE X L, SHEN Y Z, HUANG Z J. A novel ABA-responsivegene from wheat contributes to enhanced resistance to salt stress in. Plant Molecular Biology, 2013, 31(4): 791-801.

[27] HE Y, GAN S. A novel zinc-finger protein with a proline-rich domain mediates ABA-regulated seed dormancy in. Plant Molecular Biology, 2004, 54(1): 1-9.

[28] CHEN X Q, LI X B, YANG C, YAN W, LIU C L, TANG X Y, GAO C J. Genome-wide identification and characterization of FCS-Like Zinc Finger (FLZ) Family Genes in maize () and functional analysis of

[29] MA Y M, ZHAO J L, FU H, YANG T F, DONG J F, YANG W, CHEN L, ZHOU L, WANG J, LIU B, ZHANG S H, EDWARDS D. Genome-wide identification, expression and functional analysis reveal the involvement of FCS-Like Zinc finger gene family in submergence response in rice. Rice, 2021, 14(1): 76.

[30] HORI K, OGISO-TANAKA E, MATSUBARA K, YAMANOUCHI U, EBANA K, YANO M., a gene for casein kinase I, is involved in the control of rice flowering time by modulating the day-length response.The Plant Journal, 2013, 76(1): 36-46.

[31] LIVAK K, SCHMITTGEN T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?△△CTmethod. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

2023年全國(guó)畜牧獸醫(yī)期刊征訂目錄

序號(hào)期刊名稱(chēng)郵發(fā)代號(hào)刊期年定價(jià)/元聯(lián)系人電話(huà)地址郵編E-mail 1中國(guó)畜牧雜志82-147月刊600.00 池艷伶010-82893871北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)院中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所牧6樓一層C06室100193chiyanling@boyar.cn 2畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)82-453月刊600.00 劉 凌010-62815987 北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所100193xmsyxb@caas.cn 3動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)80-591月刊1800.00 景正芳010-62817823北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)大樓153室編輯部100193yyxb@cau.edu.cn 4中國(guó)家禽28-87月刊216.00 汪杏萍0514-87200013江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)倉(cāng)頡路58號(hào)225125dkjqgg@163.com 5中國(guó)禽業(yè)導(dǎo)刊28-153月刊240.00 汪杏萍0514-87200013江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)倉(cāng)頡路58號(hào)225125dkjqgg@163.com 6中國(guó)畜牧獸醫(yī)2-215月刊600.00 白如麗010-62811226 北京市海淀區(qū)圓明園西路2號(hào)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所100193zgxmsy@caas.cn 7畜牧與獸醫(yī)28-42月刊336.00 陳 雯025-84395701江蘇省南京市衛(wèi)崗1號(hào)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)210095muyizz@njau.edu.cn 8中國(guó)獸藥雜志2-924月刊144.00 楊思琦010-62103878北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)100081zgsy@vip.163.com 9河南畜牧獸醫(yī)（上半月）36-193月刊180.00 楊 麗0371-65778792河南省鄭州市經(jīng)三路91號(hào)450008hnxmsygj@163.com 10河南畜牧獸醫(yī)（下半月）36-352月刊180.00 楊 麗0371-65778792河南省鄭州市經(jīng)三路91號(hào)450008hnxmsyscb@163.com 11黑龍江畜牧獸醫(yī)（上半月）14-28半月刊480.00 朱海虹0451-51522883黑龍江省哈爾濱市松北區(qū)創(chuàng)新三路800號(hào)國(guó)際農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心13層1316房間黑龍江畜牧獸醫(yī)編輯部150023hljxmsy@163.com 12黑龍江畜牧獸醫(yī)（下半月）14-138半月刊480.00 朱海虹0451-51522883黑龍江省哈爾濱市松北區(qū)創(chuàng)新三路800號(hào)國(guó)際農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心13層1316房間黑龍江畜牧獸醫(yī)編輯部150023hljxmsy@163.com 13現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)8-75月刊180.00 舒 斐024-23226552遼寧省沈陽(yáng)市皇姑區(qū)金山北路97號(hào)110000ggb23448255@163.com 14飼料工業(yè)8-163半月刊144.00 董 玲024-86391926遼寧省沈陽(yáng)市金沙江街16號(hào)6門(mén)110036347097611@qq.com 15飼料研究2-216半月刊480.00 呂婧儒010-86399469北京市右安門(mén)外東濱河路4號(hào)100069siliaoyanjiu@qq.com

Function of FCS-Like Zinc-finger protein OsFLZ18 in regulating rice flowering time

MA YaMei, ZHANG ShaoHong, ZHAO JunLiang, LIU Bin

Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory of New Technology in Rice Breeding/Guangdong Rice Engineering Laboratory, Guangzhou 510640

【Objective】Flowering time is an important agronomic trait which determines the yield and regional adaptability of rice, but the underlining molecular regulatory mechanism need further study. FCS-like Zinc finger proteins (FLZs) are a class of plant specific regulatory proteins which play essential roles in plant growth and stress response, but their functions in regulating flowering time have not been reported. This study aims to investigate the potential function of FLZ proteins in rice flowering time control. The finding will broaden our understanding on the molecular regulatory mechanism of rice flowering time .and provide new theoretical basis and gene resource for rice breeding. 【Method】Based on the target sequences published in RGAP database,overexpression vector and CRISPR-Cas9 vector were generated and introduced intovariety Nipponbare bymediatedgenetic transformation assay. Homozygous CRISPR knockout mutants were screened by PCR and sequencing analyses. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) assay was used to examine the spatial-temporal expression and diurnal rhythmic expression of, as well as the effects ofon the transcription of several known flowering time-related genes. Yeast two-hybrid assay (Y2H) was used to test the interaction between OsFLZ18 and the flowering time-related regulatory proteins.【Result】was ubiquitously expressed in various rice tissues, with the highest expression level in 14 day-old seedling, followed by leaf sheaths and leaf blades at the tillering stage, and stem and young panicles at reproductive stages. The-CRISPR vector was constructed and transformed into Nipponbare. Two independent homozygous OE lines (OE-2, OE-3) with higherexpression level and two homozygous mutants (CRISPR-21, CRISPR-25) were selected for further study. Phenotypic observation showed that the OE lines flowered later than the wild-type plants under both natural long-day and short-day conditions in Guangzhou, while the CRISPR lines had no obvious differences in heading date when compared to the wild-type plants. The expression levels of,andwere significantly decreased in OE-2 plants compared with those in the wild-type plants under artificial short-day conditions, but no significant difference in the expression level ofwas observed between them. The results of Y2H experiment showed that OsFLZ18 interacted with OsMADS51, a positive regulator of rice flowering time. Furthermore,exhibits a diurnal rhythmic expression profile, showing lower expression levels in the daytime and higher expression levels at night with a peak at midnight. 【Conclusion】Overexpression ofdelays rice flowering time.

rice; flowering time; FLZ; OsMADS51

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.20.001

2022-05-20；

2022-06-23

廣東省自然科學(xué)基金（2022A1515012361，2019A1515010003）、廣州市科技計(jì)劃（202002030375）、科技創(chuàng)新戰(zhàn)略建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（高水平農(nóng)科院建設(shè)）（R2021PY-QF001）、廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系農(nóng)業(yè)種業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（2020KJ106，2021KJ106）、廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行費(fèi)（2020B1212060047）

馬雅美，E-mail：mayamei@gdaas.cn。通信作者趙均良，E-mail：zhao_junliang@gdaas.cn。通信作者劉斌，E-mail：lbgz1009@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）