楊長江，趙龍，林易霖，葉穎江，王杉，申占龍

北京大學人民醫(yī)院胃腸外科/北京大學人民醫(yī)院外科腫瘤研究室/北京市結直腸癌診療研究重點實驗室 北京 100044

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴重危害人類健康的常見消化道惡性腫瘤，目前已成為全球第二大癌癥死亡原因[1]。結直腸癌傳統(tǒng)的治療方式包括手術治療、化療和放療。近年來，通過重新激活宿主免疫系統(tǒng)對惡性腫瘤細胞殺傷能力的免疫治療在腫瘤治療領域取得了令人矚目的成績。其中，程序性細胞死亡蛋白1（programmed death protein-1，PD-1）、程序性細胞死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）以及細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在晚期結直腸癌的治療中已顯示出顯著的益處[2]。目前，納武利尤單抗、帕博利珠單抗等ICIs已獲批用于治療DNA錯配修復缺陷（mismatch repair-deficient，dMMR）及微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）的轉移性結直腸癌[3]。一般來說，無DNA錯配修復缺陷（mismatch repair-proficient，pMMR）及微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）患者的預后比dMMR/MSI-H患者差，且對ICIs治療不敏感[4]。原因為pMMR/MSS患者的細胞毒性淋巴細胞浸潤水平較低，難以產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應。了解結直腸癌免疫微環(huán)境中不同類型免疫細胞的浸潤水平及其功能對于評估結直腸癌患者免疫治療的預后，優(yōu)化結直腸癌免疫治療策略具有重要的意義[5]。本文回顧了結直腸癌免疫微環(huán)境中不同類型的免疫細胞的作用，并討論了針對不同類型免疫細胞的潛在治療方法，旨在更好地了解結直腸癌免疫微環(huán)境的組成及其作用，優(yōu)化當前結直腸癌免疫治療策略，提升免疫治療效果。

1 結直腸癌免疫微環(huán)境的組成及其作用

結直腸癌免疫微環(huán)境的組成成分包括T細胞、B細胞、巨噬細胞及其相關信號分子等，不同類型的免疫細胞在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用。

（1）CD8+T細胞：腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）是結直腸癌免疫微環(huán)境的主要成分，主要包括T細胞和B細胞。T細胞是腫瘤免疫微環(huán)境中含量最豐富和最具特征性的免疫細胞，包括CD8+T細胞和CD4+T細胞。CD8+T細胞即細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），是適應性免疫的關鍵組成部分，同時也是抗腫瘤免疫反應的主要效應細胞。CTLs可識別腫瘤抗原，通過穿孔素、顆粒酶、Fas配體等直接殺傷腫瘤細胞，同時還可以分泌白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）以及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等進一步增強對腫瘤細胞的殺傷作用[6]。然而，不可忽視的是，腫瘤細胞為了逃避免疫攻擊，可以通過表達免疫檢查點分子、分泌白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等抑制性細胞因子等多種方式抑制CTLs對腫瘤細胞的殺傷活性[7]。PD-L1和PD-1是重要的免疫檢查點分子，腫瘤細胞和基質細胞通過高表達PD-L1，與T細胞上的PD-1結合后，可以抑制T細胞活化，使殺傷性T細胞轉變?yōu)楹慕咝訲細胞，失去對腫瘤細胞的殺傷作用，從而促進腫瘤的免疫逃逸[8]。CTLA-4在調(diào)節(jié)T細胞功能方面也發(fā)揮著重要的作用。它是一種跨膜蛋白，主要表達于活化的T細胞細胞膜表面，與B7分子結合后可向T細胞傳遞抑制性信號，誘導T細胞耗竭，靶向抑制CTLA-4可恢復T細胞的殺傷能力[9]。目前PD-1、PD-L1、CTLA-4已成為抗腫瘤免疫治療的重要靶點。

（2）CD4+T細胞：CD4+T細胞可通過分泌多種細胞因子來調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，在激活其他免疫細胞（B細胞、CTLs等）、調(diào)節(jié)免疫反應過程中起關鍵作用。CD4+T細胞可進一步分化為具有廣泛功能的T細胞亞群，包括輔助性T細胞（helper T cells，Th cells）Th1、Th17細胞和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）等。Th1細胞的主要功能在于激活CTLs等免疫細胞的效應功能，輔助殺傷腫瘤細胞，增強抗腫瘤免疫反應[10]。Th17則通過分泌如白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白細胞介素-21（interleukin-21，IL-21）和白細胞介素-22（interleukin-22，IL-22）等細胞因子發(fā)揮免疫抑制功能，促進腫瘤生長和轉移[11]。研究發(fā)現(xiàn)，結直腸癌中較高的Th1細胞浸潤水平與患者更好的無病生存率相關，而Th17細胞的浸潤則與不良預后有關[12]。此外，CD4+T細胞中還包含一類經(jīng)典的免疫細胞——免疫抑制性Tregs，這類細胞表達特征性分子叉頭盒蛋白P3（forkhead box P3，F(xiàn)OXP3），并且可通過抑制IL-2分泌、釋放腺苷和分泌TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子來負調(diào)節(jié)免疫反應，促進腫瘤進展[13]。Katz等[14]通過免疫組化分析表明，較高的FOXP3:CD4和FOXP3:CD8比率與結直腸癌患者較短的5年總生存期（overall survival，OS）相關，是結直腸癌患者預后的獨立預測指標。然而，近年來一些研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌中FOXP3+Tregs較高水平浸潤與較理想的無復發(fā)生存期和疾病特異性存活相關，F(xiàn)OXP3+Tregs較低水平浸潤患者的預后較差[15]。這種矛盾可能來源于腫瘤免疫微環(huán)境中Tregs的異質性。Saito等[16]發(fā)現(xiàn)結直腸癌中Tregs可分為終末分化的免疫抑制亞群和促炎亞群，免疫抑制性Tregs浸潤水平升高與結直腸癌患者較差的預后相關。

（3）B細胞：B細胞是體液免疫的主要效應細胞，可以通過分泌細胞因子、介導腫瘤抗原的呈遞、抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、激活補體等方式影響腫瘤的發(fā)展及其對免疫治療的反應。Edin等[17]研究發(fā)現(xiàn)結直腸癌中較高水平的CD20+B細胞浸潤與較低的病理分期和顯著改善的疾病特異性生存相關，同時CD20+B細胞的浸潤水平與CD8+T細胞的浸潤水平呈高度正相關。此外，B細胞參與三級淋巴結構（tertiary lymphoid structures，TLSs）的形成，TLSs由CD20+B細胞、CD4+濾泡輔助性T細胞（T follicular helpers，Tfhs）和濾泡樹突狀細胞等構成[18]。越來越多的證據(jù)表明TLSs是一種有效的抗腫瘤免疫反應結構[19]。Posch等[20]通過對109例結直腸癌患者的腫瘤組織標本分析發(fā)現(xiàn)大部分患者腫瘤組織中可觀察到TLSs，并且在dMMR/MSI-H結直腸癌腫瘤組織中更常見。此外，Posch等還發(fā)現(xiàn)TLSs的形成與較低的疾病復發(fā)風險和較好的預后相關，這表明TLSs在結直腸癌相關免疫反應及疾病進展中發(fā)揮重要作用。

（4）巨噬細胞：腫瘤免疫微環(huán)境中富含巨噬細胞，巨噬細胞被認為是實體瘤中浸潤最豐富的免疫細胞群之一[21]。巨噬細胞主要通過腫瘤細胞釋放的C-C 趨 化 因 子 （C-C motif chemokine， CCL）CCL2、CCL3、CCL4、CCL5等從外周募集[22]。腫瘤免疫微環(huán)境中巨噬細胞具有高度異質性，可分為具有促炎、免疫活化、抗腫瘤特性的M1型巨噬細胞及具有免疫抑制、促腫瘤特性的M2型巨噬細胞。Lee等[23]通過對232例結直腸癌患者腫瘤組織標本中巨噬細胞的預后預測價值分析發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞浸潤水平較高的患者的無進展生存期（progression free survival，PFS）和OS顯著縮短。CD163是M2型巨噬細胞的特征性分子標志物，Wei等[24]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤侵襲前沿間質組織中CD163的高表達與上皮—間質轉化、間質的循環(huán)腫瘤細胞比例及較差的預后相關。Yang等[25]基于對81例結直腸癌患者腫瘤組織標本的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞浸潤與較高的淋巴血管浸潤、腫瘤侵襲、TNM分期以及較差的OS相關。就功能方面而言，M2型巨噬細胞可通過多種方式促進腫瘤的侵襲和轉移。一方面，M2型巨噬細胞可通過促進細胞外基質重塑[26]、誘導上皮—間質轉化[24]促進腫瘤的侵襲轉移；另一方面，M2型巨噬細胞通過分泌VEGF促進腫瘤血管生成[27]，同時通過分泌免疫抑制性細胞因子IL-10和TGF-β促進腫瘤免疫逃逸[28]，最終促進結直腸癌的進展。

2 結直腸癌免疫治療策略

（1）靶向T細胞的治療策略：ICIs主要通過靶向阻斷T細胞或腫瘤細胞表面的免疫檢查點蛋白或配體來恢復機體免疫功能。目前研究最廣泛的ICIs是靶向PD-1、PD-L1以及CTLA-4的抑制劑。帕博利珠單抗是靶向PD-1的ICIs之一，NCT01876511試驗確定了其對結直腸癌的治療作用。NCT01876511試驗包括11例dMMR結直腸癌患者和21例pMMR結直腸癌患者，其中dMMR患者的免疫治療相關客觀緩解率和無進展生存率分別為40%和78%，pMMR患者分別為0%和11%。dMMR患者的中位PFS和OS未達到，而pMMR患者的中位PFS和OS分別為2.2個月和5.0個月[4]。KEYNOTE-164（NCT02460198）是一項評估帕博利珠單抗治療難治性dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者的Ⅱ期臨床試驗。試驗結束時，A組患者（既往接受≥二線治療）的中位隨訪時間為31.3個月，客觀緩解率為33%，中位PFS為2.3個月。B組患者（既往≥一線治療）中位隨訪時間為24.2個月，客觀緩解率為33%，中位PFS為4.1個月。A組與治療相關的3～4級不良事件的發(fā)生率為16%，B組為13%。該試驗證實了帕博利珠單抗對dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者的療效，使得dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌率先進入免疫治療時代[29]。KEYNOTE-177（NCT02563002）是一項Ⅲ期臨床試驗，評估了帕博利珠單抗單藥一線治療dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者的療效。研究共納入307例既往未接受治療的dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者，并隨機分配至帕博利珠單抗組或化療聯(lián)合靶向治療組。結果表明帕博利珠單抗相較于化療聯(lián)合靶向治療可顯著改善初治型dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者的腫瘤緩解情況和PFS（16.5個月vs.8.2個月）。帕博利珠單抗已于2017年被FDA批準用于治療不可切除或dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者。

另一種PD-1抑制劑是納武利尤單抗。納武利尤單抗在dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者中顯示出良好的治療效果。CheckMate 142試驗旨在評估以納武利尤單抗為基礎的治療對轉移性結直腸癌患者的有效性和安全性。這項研究包含三個隊列，其中一個隊列是研究納武利尤單抗單藥用于標準治療失敗的dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者，在入組的74例患者中23例患者達到客觀緩解，客觀緩解率為31%。68.9%（51/74）的患者獲得了＞12周的疾病控制，12個月無進展生存率和總生存率分別為50%和73%[30]。CheckMate 142試驗的另一個隊列研究內(nèi)容是評估納武利尤單抗和納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗治療對于既往化療失敗的dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者的療效。與納武利尤單抗單藥治療相比，納武利尤單抗聯(lián)合伊匹木單抗免疫治療對于接受過標準治療的dMMR/MSI-H的復發(fā)性或轉移性結直腸癌患者具有較好的安全性和顯著的臨床療效[31]。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，一線使用納武利尤單抗聯(lián)合低劑量伊匹單抗具有強大而持久的臨床益處，并且具有較好的耐受性，有望成為dMMR/MSI-H轉移性結直腸癌患者新的一線治療方法[32]。

（2）靶向巨噬細胞的治療策略：鑒于巨噬細胞對腫瘤免疫調(diào)控的重要作用，靶向巨噬細胞已經(jīng)成為免疫治療的新熱點，目前的研究已嘗試多種靶向巨噬細胞的抗腫瘤治療策略，包括抑制巨噬細胞募集和分化，逆轉巨噬細胞促腫瘤表型和靶向巨噬細胞效應分子等[33]。由于腫瘤免疫微環(huán)境中的巨噬細胞主要表現(xiàn)為M2型，因此誘導巨噬細胞從M2型到M1型的極化被視為一種具有臨床應用前景的治療方法。Georgoudaki等[34]發(fā)現(xiàn)通過靶向抑制巨噬細胞表面受體（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO）可以在結腸癌小鼠模型中將M2型巨噬細胞極化為M1型并誘導抗腫瘤活性。Halama等[35]發(fā)現(xiàn)靶向抑制C-C趨化因子受體5（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）可以調(diào)節(jié)巨噬細胞從M2型向M1型極化發(fā)揮抗腫瘤作用，并在晚期難治性結直腸癌肝轉移患者的Ⅰ期臨床試驗中得到證實。此外巨噬細胞集落刺激因子1（colony stimulating factor-1，CSF-1）在巨噬細胞分化和血管生成中起重要作用，目前以集落刺激因子1受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）抑制劑為代表的靶向巨噬細胞抗腫瘤治療已經(jīng)進入臨床前階段[36]。RG7155（emactuzumab）是一種人源化單克隆抗體，可與CSF1R結合并阻斷其二聚化。在結直腸癌小鼠模型中，使用RG7155治療可減少腫瘤組織中浸潤的M2型巨噬細胞數(shù)量并升高CD8+T細胞浸潤水平，提示使用RG7155治療是一種有希望的靶向巨噬細胞的治療方法[37]。筆者團隊通過對接受CSF1R抑制劑治療的小鼠進行單細胞測序發(fā)現(xiàn)SPP1+腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）可能是導致CSF1R抑制劑耐藥的關鍵因素，抑制SPP1+TAMs活性或減少其數(shù)量可能是提升CSF1R抑制劑療效的有效途徑[38]。

（3）靶向B細胞的治療策略：除T細胞和髓系細胞外，開發(fā)基于B細胞的免疫治療策略對于結直腸癌治療也有較好的臨床應用前景。B細胞通過充當抗原提呈細胞、產(chǎn)生高親和力抗體和分泌抗腫瘤細胞因子來支持抗腫瘤免疫反應并促進免疫治療反應，因此增強腫瘤免疫微環(huán)境中抗腫瘤B細胞的活性可能是靶向B細胞免疫治療的有效途徑。筆者團隊發(fā)現(xiàn)人膜聯(lián)免疫球蛋白IgG1重鏈基因hIgG1-G396R突變可增強B細胞的活性，向結腸癌模型的小鼠體內(nèi)過繼輸注hIgG1-G396R同源體，小鼠體內(nèi)的高反應性B細胞可明顯抑制腫瘤生長[39]。此外，近年有研究發(fā)現(xiàn)了一種在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮抑制作用的B細胞——調(diào)節(jié)性B細胞（regulatory B cells，Bregs）。Bregs已被證明在抑制與腫瘤相關的免疫反應中發(fā)揮著關鍵作用[40]。Yarchoan等[41]發(fā)現(xiàn)使用絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制劑治療可抑制Bregs活性，并減少結直腸癌小鼠模型中腫瘤引流淋巴結中的Bregs數(shù)量，但不影響抗腫瘤B細胞功能，從而增強抗腫瘤免疫力，這提示靶向抑制Bregs細胞功能可能是潛在的結直腸癌免疫治療策略，但是仍需要進一步研究結直腸癌中Bregs細胞相關分子標志物，確定關鍵的Bregs靶點以提升治療效果。

3 小結與展望

越來越多的證據(jù)表明免疫微環(huán)境在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，是影響結直腸癌患者免疫治療生存預后的重要因素。近年來，免疫治療已成為腫瘤治療領域的研究熱點，包含ICIs在內(nèi)的多種靶向免疫微環(huán)境的治療策略已經(jīng)在結直腸癌中取得了一定的成效。然而不可忽視的是，免疫治療在結直腸癌中的療效仍有待進一步提升。深入挖掘結直腸癌免疫微環(huán)境中不同類型免疫細胞的功能特性與關鍵分子，發(fā)現(xiàn)更多具有臨床應用價值的治療靶點，探索更優(yōu)的聯(lián)合治療策略將有助于進一步提升免疫治療的效果，同時指導臨床醫(yī)師對結直腸癌患者進行更加個體化的治療。總之，腫瘤浸潤免疫細胞在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，隨著免疫細胞在結直腸癌中的作用的不斷闡明和更多治療靶點的發(fā)現(xiàn)，將推動結直腸癌的免疫治療向更加個體化、科學化的方向發(fā)展。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關的利益沖突。