王雪芹 楊曉宇

作者單位： 475000 河南開(kāi)封 開(kāi)封市兒童醫(yī)院新生兒科

新生兒呼吸窘迫綜合征(respiratory distress syndrome of newborn，NRDS)主要是因患兒肺發(fā)育不全、肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)缺乏等因素造成肺泡病理改變而引起[1]。PS缺乏可加重肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致肺泡塌陷和肺液集聚，而誘發(fā)NRDS[2-3]。有研究[4-5]顯示，基因遺傳因素也是影響PS結(jié)構(gòu)功能，引起PS代謝循環(huán)障礙，導(dǎo)致NRDS發(fā)病的重要因素。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A3(ATP binding cassette transporter A3，ABCA3)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子的亞科，可協(xié)助脂類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而影響PS的合成。ABCA3基因外顯子10位點(diǎn)位于α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域，可利于不同底物結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)，該位點(diǎn)基因多態(tài)性可改變信使RNA穩(wěn)定性，而影響擴(kuò)膜結(jié)構(gòu)域的完整性，導(dǎo)致脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常[6]。而目前對(duì)于該基因變異位點(diǎn)與NRDS的關(guān)系報(bào)道較少。故本研究通過(guò)分析新生兒ABCA3外顯子10多態(tài)性與NRDS發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)系，旨在為探尋NRDS發(fā)病的分子遺傳性機(jī)制及為該疾病的臨床防治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取73例2020年1月至2022年2月開(kāi)封市兒童醫(yī)院住院/門診診療的NRDS患兒為NRDS組，選取同期58例健康新生兒為對(duì)照組。兩組研究對(duì)象性別、胎齡等一般資料對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NRDS組與對(duì)照組的一般資料比較

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①NRDS組對(duì)象均符合NRDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，出生后數(shù)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促，達(dá)60次/分以上，伴呼氣性呻吟，吸氣時(shí)三凹征，病情進(jìn)行性加重，繼而出現(xiàn)呼吸不規(guī)則、呼吸暫停、青紫、呼吸衰竭。體檢兩肺呼吸音減低，血?dú)夥治鎏崾径趸挤謮荷?，氧分壓下降等；②臨床資料完整者；③單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①敗血癥患兒；②合并嚴(yán)重先天性疾病患兒；③有胎糞吸入史者；④多胎妊娠；⑤肺氣漏、先天性肺發(fā)育不良等肺部疾病患兒。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2021KW037-12)。

1.3 方法

1.3.1 ABCA3外顯子10多態(tài)性檢測(cè) 采集NRDS組及對(duì)照組對(duì)象外周靜脈血500 μL，應(yīng)用血液基因組DNA提取試劑盒(上海生工生物)提取總DNA，采用PCR法對(duì)所提取的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物由上海生工生物設(shè)計(jì)完成，應(yīng)用Verity96well型PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行檢測(cè)，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)引物序列為SC745-F：5’-CTGTCAATGTCCCACTCCTCTC-3’，SC745-R：5’-TTCTCCCTAAATTACGCTGACTT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為413 bp。應(yīng)用DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)，使用1%的瓊脂糖電泳進(jìn)行電泳處理。應(yīng)用3730XL型測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank基因庫(kù)正常序列進(jìn)行比對(duì)判讀。

1.3.2 肺表面活性物質(zhì)表達(dá) 采集NRDS組患兒外周靜脈血2 mL，在4℃環(huán)境下，應(yīng)用上海醫(yī)療器械有限公司TGL-14G臺(tái)式高速離心機(jī)以3 500 r/min的速率進(jìn)行離心處理，離心半徑為10 cm，離心時(shí)間為5 min。取上清液，應(yīng)用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)患兒血清中肺表面活性相關(guān)蛋白A(pulmonary surfatcant-associated protein-A，SP-A)、肺表面活性相關(guān)蛋白B(pulmonary surfatcant-associated protein-B，SP-B)、肺表面活性相關(guān)蛋白C(pulmonary surfatcant-associated protein-C，SP-C)水平，試劑盒由武漢伊艾博科技有限公司提供。取患兒支氣管灌洗液3 mL，單層無(wú)菌紗布過(guò)濾后以800 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，以氨萘磺酸法測(cè)定患兒BALF中總磷脂(total phospholipids，TPL)水平，四氧化鋨反應(yīng)后中性鋁粉柱層析法測(cè)定患兒BALF中飽和卵磷脂(saturated phosphatidylcholine，SatPC)水平；采用改良Folin酚試劑法測(cè)定患兒BALF中總蛋白(total protein，TP)水平。

1.4 觀察指標(biāo)比較 NRDS組及對(duì)照組ABCA3基因外顯子10多態(tài)性差異。根據(jù)嚴(yán)重程度將NRDS組分為4級(jí)[7]，參照文獻(xiàn)[8]，以Ⅰ、Ⅱ級(jí)為輕度組，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為重度組，比較不同嚴(yán)重程度及不同胎齡患兒的ABCA3外顯子10多態(tài)性差異。

2 結(jié)果

2.1 NRDS組及對(duì)照組ABCA3基因外顯子10多態(tài)性的Hardy-Weinberg平衡分析 NRDS組及對(duì)照組ABCA3基因外顯子10 rs13332514位點(diǎn)基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，兩組該位點(diǎn)GG、GT、TT型實(shí)際頻率與理論頻數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 NRDS組及對(duì)照組ABCA3基因外顯子10多態(tài)性的Hardy-Weinberg平衡分析

2.2ABCA3基因外顯子10多態(tài)性與NRDS發(fā)病的logistic回歸分析 NRDS組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT型檢出率高于對(duì)照組，GG型檢出率低于對(duì)照組(P<0.05)。進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析時(shí)，以研究對(duì)象是否出現(xiàn)NRDS為因變量(NRDS發(fā)病為1，無(wú)NRDS為0)，將ABCA3基因外顯子10基因型(GG、GT、TT)作為自變量，采用似然法納入logistic回歸分析進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT型為NRDS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，GG型為保護(hù)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 NRDS組及對(duì)照組ABCA3基因外顯子10多態(tài)性比較[(例)%]

表4 ABCA3基因外顯子10多態(tài)性與NRDS發(fā)病的logistic回歸分析

2.3 不同NRDS嚴(yán)重程度患兒的ABCA3基因外顯子10多態(tài)性比較 重度組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT型檢出率高于輕中度組，GG型檢出率低于輕中度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同NRDS嚴(yán)重程度患兒的ABCA3基因外顯子10多態(tài)性比較[例(%)]

2.4 不同胎齡NRDS患兒的ABCA3基因外顯子10多態(tài)性比較 早產(chǎn)兒及足月兒的ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)GG、GT、TT型檢出率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6。

表6 不同胎齡NRDS患兒的ABCA3基因外顯子10多態(tài)性比較[例(%)]

2.5 不同ABCA3基因外顯子10基因型患者的肺表面活性物質(zhì)表達(dá)比較 不同基因型患兒SP-A、SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TT型患兒SP-A水平高于GT、GG型，SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平低于GT、GG型(P<0.05)；GT型SP-A水平高于GG型，SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平低于GG型(P<0.05)。見(jiàn)表7。

表7 不同ABCA3基因外顯子10基因型患者的肺表面活性物質(zhì)表達(dá)比較

3 討論

NRDS主要是因PS缺乏造成的肺泡張力下降，肺泡擴(kuò)張受限，患兒多表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的呼吸異常癥狀[9]。目前認(rèn)為，基因突變引起PS合成分泌減少，是引起NRDS發(fā)生的重要因素[10]。ABCA3蛋白在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、維持PS中磷脂動(dòng)態(tài)平衡及其合成有著極為重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，部分小鼠敲除ABCA3基因后可出現(xiàn)肺間質(zhì)增厚現(xiàn)象，提示該基因突變或與肺疾病的發(fā)生有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[12-13]，ABCA3基因突變可導(dǎo)致肺間質(zhì)疾病的發(fā)生，該基因突變可使幼兒表現(xiàn)為肺上皮細(xì)胞增生，年長(zhǎng)兒出現(xiàn)肺小葉重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，NRDS組及對(duì)照組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)基因型符合Hardy-Weinberg平衡，表明納入的研究對(duì)象中不存在近親、化學(xué)環(huán)境等因素導(dǎo)致的突變率升高、遷移等,樣本具有代表性。本研究結(jié)果顯示，NRDS組ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)GT、TT型檢出率高于對(duì)照組，表明NRDS患者ABCA3基因外顯子10基因突變率較高。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT型為NRDS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，GG型為保護(hù)因素，與張鈺恒等[14]研究結(jié)果一致。其原因可能在于，ABCA3基因外顯子10突變可引起肺泡內(nèi)蛋白沉積，肺間質(zhì)及膠原纖維增生，最終導(dǎo)致NRDS的發(fā)生[15]。

臨床研究[16-17]顯示，NRDS的發(fā)病率與胎齡有關(guān)，胎齡較小新生兒因肺部發(fā)育較差，PS產(chǎn)生較少，呼吸、儲(chǔ)備功能較低，導(dǎo)致NRDS發(fā)病率較足月兒高。本研究發(fā)現(xiàn)，不同胎齡NRDS患兒該位點(diǎn)GG、GT、TT型檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ABCA3基因多態(tài)性或與胎齡無(wú)顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，重度NRDS患兒ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT型檢出率較高，這主要是因?yàn)锳BCA3基因可將磷脂等脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至板層小體，影響PS的加工過(guò)程，進(jìn)而影響患兒肺功能[18-19]。

國(guó)內(nèi)外均有研究[20-23]顯示，ABCA3蛋白在PS脂類轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中具重要的作用。SP是PS的主要活性成分，存在于支氣管和肺泡表面氣液界面，當(dāng)肺部出現(xiàn)上皮組織損傷時(shí)，肺泡毛細(xì)血管屏障被破壞，肺微血管通透性增加，導(dǎo)致SP入血，使得其外周血水平升高[24]。本研究結(jié)果顯示，ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT、GT型患兒的SP-A水平高于GG型，與相關(guān)研究[25-26]結(jié)果相符，這主要與ABCA3基因外顯子10突變型患兒肺部損傷較嚴(yán)重有關(guān)。ABCA3基因突變可導(dǎo)致該蛋白分泌異常，而繼發(fā)性影響SP的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過(guò)程[27-28]。但尚不知該基因外顯子10突變是否與SP-B、SP-C表達(dá)相關(guān)。為此，本研究對(duì)不同ABCA3基因外顯子10基因型患者的SP-B、SP-C表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ABCA3基因外顯子10rs13332514位點(diǎn)TT型患兒SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP均較GT型和GG型低，提示該位點(diǎn)基因突變可影響SP-B、SP-C等蛋白表達(dá)，本研究認(rèn)為，這或?yàn)樵摶蛲蛔兛稍黾覰RDS易感性的重要原因。

綜上所述，ABCA3基因外顯子10基因TT型是NRDS發(fā)生的危險(xiǎn)因素，并該基因多態(tài)性可影響患兒SP表達(dá)。本研究尚存在不足之處，納入例數(shù)有限，可能導(dǎo)致研究結(jié)果出現(xiàn)偏倚，故具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究證實(shí)。