陳昕彥 于 萌 李 湘 許靜宜 林奕辰 劉曉丹 王 璐

作者單位： 116000 遼寧大連 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨質(zhì)疏松科

2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus, T2DM)是一種糖代謝紊亂的疾病，可引發(fā)T2DM腎病，若不積極治療，可發(fā)生腎纖維化，導(dǎo)致死亡[1-2]。因此，尋找與T2DM腎病發(fā)病相關(guān)的因素，及時(shí)干預(yù)，改善T2DM腎病患者生存狀況有積極意義。既往研究[3-4]顯示，T2DM腎病發(fā)病與微小RNA(microRNA, miRNA)、氧化應(yīng)激、糖代謝紊亂、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)等相關(guān)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，LncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(LncRNA taurine up-regulated gene 1，LncRNA TUG1)在T2DM腎病中表達(dá)呈低表達(dá)，其可能通過抑制微小RNA-21(microRNA-21, miR-21)表達(dá)，進(jìn)而影響T2DM腎病病理發(fā)展。秦鳳等[6]研究顯示，miR-21在T2DM腎病患者中呈高表達(dá)，其可作為評(píng)估T2DM腎病患者病情嚴(yán)重程度的輔助指標(biāo)。但LncRNA TUG1在T2DM腎病患者中的表達(dá)水平及其與miR-21的相關(guān)性尚不明確。因此，本文通過測(cè)定LncRNA TUG1在T2DM腎病患者血清中的表達(dá)水平，旨在分析LncRNA TUG1與miR-21表達(dá)水平的相關(guān)性及其診斷T2DM腎病的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年8月大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的82例T2DM腎病患者為T2DM腎病組，男性42例，女性40例，年齡41～79歲，平均(61.65±12.73)歲。另選取同期T2DM無腎病患者80例為單純T2DM組，男性39例，女性41例，年齡41～80歲，平均(62.04±12.91)歲。納入同期體檢健康者82例為健康組，男性43例，女性39例，年齡40～79歲，平均(59.72±12.56)歲。單純T2DM組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2013年版)》[7]中T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②不伴有腎病。T2DM腎病組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合《糖尿病腎病防治專家共識(shí)(2014年版)》中T2DM腎病的判定標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查確診；②患T2DM時(shí)間>5年。單純T2DM組、T2DM腎病組患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有I型糖尿病者；②妊娠患者；③有透析、腎移植、膜性腎病史者；④有免疫球蛋白A腎病、高血壓腎病或其他原發(fā)性/繼發(fā)性腎病者；⑤臨床資料不齊全者；⑥合并腦血管、心、肝功能異常者；⑦合并甲狀腺疾病、腫瘤、感染性疾病者；⑧出現(xiàn)血尿者。受試者對(duì)本研究知情同意。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：20180117)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 收集受試者空腹外周靜脈血3～5 mL，自然凝集28～32 min，分離血清(4 500 r/min離心6 min，離心半徑為8 cm)，分裝，于-70℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)血清LncRNA TUG1、miR-21表達(dá)水平 冰上解凍血清樣本，利用TRIzol Reagent(15596018，美國(guó)GIBCO公司)獲取血清樣本總RNA；按High Capacity RNA-to-cDNA Kit(4489328C，美國(guó)Thermo公司)說明書合成cDNA；最后，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(XY-TYB-QPK-201，日本Cosmo Bio公司)、qRT-PCR儀(StepOne TM，美國(guó)ABI公司)擴(kuò)增cDNA，獲得循環(huán)閾值(CT值)。qRT-PCR儀參數(shù)：97.8℃ 8 min，95℃ 40 s，58.5℃ 20 s，62℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。LncRNA TUG1以GAPDH為內(nèi)參，miR-21以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。LncRNA TUG1、miR-21相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCT法計(jì)算。

表1 LncRNA TUG1、GAPDH、miR-21、U6引物序列

1.2.3 觀察指標(biāo) ①比較3組研究對(duì)象臨床資料(年齡、性別構(gòu)成比等)、收集3組對(duì)象糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1c)、估計(jì)腎小球?yàn)V過率(estimated glomeruar filtration rate, eGFR)、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、蛋白尿等資料，及血清LncRNA TUG1、miR-21水平；②分析血清LncRNA TUG1對(duì)T2DM腎病的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 3組對(duì)象一般資料比較 與健康組相比，單純T2DM組、T2DM腎病組患者HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿水平升高(P<0.05)，eGFR水平降低(P<0.05)；與單純T2DM組相比，T2DM腎病組患者SCr、蛋白尿水平升高(P<0.05)，eGFR水平降低(P<0.05)。3組對(duì)象年齡、BMI、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，基線資料可比。見表2。

表2 3組對(duì)象一般資料比較

2.2 3組對(duì)象血清LncRNA TUG1、miR-21表達(dá)水平比較 與健康組相比，單純T2DM組、T2DM腎病組患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平降低(P<0.05)，血清miR-21表達(dá)水平升高(P<0.05)；與單純T2DM組相比，T2DM腎病組患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平降低(P<0.05)，血清miR-21表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 3組對(duì)象血清LncRNA TUG1、miR-21表達(dá)水平比較

2.3 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1、miR-21表達(dá)水平與HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與eGFR呈正相關(guān)(P<0.05)；T2DM腎病患者血清miR-21表達(dá)水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈正相關(guān)(P<0.05)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1、miR-21表達(dá)水平與HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿的相關(guān)性

2.4 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平與miR-21的相關(guān)性 Pearson相關(guān)法分析顯示，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平與miR-21呈負(fù)相關(guān)(r=-0.587，P<0.05)。見圖1。

圖1 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平與miR-21的相關(guān)性(n=82)

2.5 血清LncRNA TUG1水平對(duì)T2DM腎病的診斷價(jià)值 以血清LncRNA TUG1為檢驗(yàn)變量，以 T2DM腎病是否發(fā)生為狀態(tài)變量，繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.871(95%CI:0.812～0.930)，截?cái)嘀禐?.63，約登指數(shù)為0.695，其靈敏度為81.7%，特異度為87.8%。見圖2。

圖2 血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的ROC曲線

3 討論

T2DM腎病是T2DM的一種并發(fā)癥，其以腎小球硬化為特征，可出現(xiàn)蛋白尿，嚴(yán)重?fù)p害患者身心健康[9-10]。因此，積極探討T2DM腎病的發(fā)病機(jī)制，有利于尋找診斷T2DM腎病的標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

LncRNA是一類非編碼RNA分子，長(zhǎng)度約為200 nt，其可調(diào)控氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，介導(dǎo)自噬，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程，與T2DM、高血壓、T2DM腎病等關(guān)系密切[11-12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，LncRNA TUG1在T2DM腎病中表達(dá)失調(diào)，其可能通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響腎上皮細(xì)胞損傷，LncRNA TUG1具有診斷T2DM腎病的潛在價(jià)值。Meng等[14]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA TUG1可能通過影響相關(guān)信號(hào)通路，抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，從而改善T2DM腎病病變進(jìn)程，IncRNA TUG1可能是治療T2DM腎病的潛在靶標(biāo)。本研究中,T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平低于單純T2DM患者及健康者，與Meng等[14]研究趨勢(shì)一致，提示LncRNA TUG1可能與T2DM腎病病理過程密切相關(guān)，推測(cè)LncRNA TUG1可能通過影響相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響T2DM腎病發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制仍需深入探討。本研究顯示，T2DM腎病患者HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿水平高于健康者，SCr、蛋白尿水平高于單純T2DM患者，eGFR水平低于單純T2DM患者及健康者，提示T2DM腎病患者存在血糖紊亂及腎損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈負(fù)相關(guān)，與eGFR呈正相關(guān)，提示LncRNA TUG1可能與血糖、腎功能共同影響T2DM腎病病變過程。此外，本文還利用ROC曲線分析了血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的價(jià)值，結(jié)果顯示，血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的AUC為0.871，當(dāng)血清LncRNA TUG1相對(duì)表達(dá)量<0.63時(shí)，T2DM腎病發(fā)生概率較大，提示LncRNA TUG1對(duì)T2DM腎病有一定診斷價(jià)值，測(cè)定血清LncRNA TUG1水平有助于臨床診斷T2DM腎病。

miRNA是一類非編碼RNA小分子，可參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程，與T2DM、糖尿病視網(wǎng)膜病變、T2DM腎病等有關(guān)[15-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，miR-21作為miRNA的一員，其在T2DM腎病中呈高表達(dá)，下調(diào)miR-21可抑制T2DM腎病的發(fā)展及腎纖維化，miR-21可能是治療T2DM腎病的潛在靶標(biāo)；另外，miR-21在T2DM腎臟疾病患者中表達(dá)水平較高，其可能在T2DM腎臟疾病患者發(fā)生腎纖維化過程中起促進(jìn)作用[18]。本文中，T2DM腎病患者血清miR-21表達(dá)水平高于單純T2DM患者、健康者，與秦鳳等[6]研究趨勢(shì)相符，提示miR-21可能參與T2DM腎病病理變化，分析原因，miR-21作為miRNA的成員之一，其可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，影響相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而在T2DM腎病中起促進(jìn)作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另外，本研究顯示，T2DM腎病患者血清miR-21表達(dá)水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，提示miR-21可能與血糖、腎功能協(xié)同影響T2DM腎病病理發(fā)展。此外，本文還分析了T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平與miR-21的相關(guān)性，結(jié)果顯示，LncRNA TUG1表達(dá)水平與miR-21呈負(fù)相關(guān)，提示LncRNA TUG1可能與miR-21共同影響T2DM腎病發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制需結(jié)合基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。

綜上所述，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達(dá)水平較低，其與miR-21、HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿顯著有關(guān)，LncRNA TUG1可能是診治T2DM腎病的分子靶標(biāo)。但本研究未深入探討LncRNA TUG1、miR-21在T2DM腎病中的機(jī)制，樣本較少，且未分析miR-21診斷T2DM腎病的價(jià)值，后期將從多角度進(jìn)行深入研究，為臨床診治T2DM腎病提供更有力參考。