倪 瓊 詹慶昊 黃榮蘭 胡文彬 楊任民 程 楠 韓永升

股骨頭壞死是由于股骨頭血供中斷引起骨細(xì)胞的凋亡和股骨頭內(nèi)微結(jié)構(gòu)的改變，出現(xiàn)股骨頭區(qū)域疼痛并進(jìn)行性加重的一種疾病。大多數(shù)患者最終需要進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換，長期效果難以預(yù)測[1]。研究[2]已確定過度飲酒和服用大劑量糖皮質(zhì)激素藥物是發(fā)生非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的2個(gè)最重要的誘因。因此，激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)的早期檢測、有效治療尤為重要。近年來，基于候選基因的關(guān)聯(lián)研究成功地定位了許多復(fù)雜疾病的易感性[3-4]，也有研究[5]將特定基因與股骨頭壞死聯(lián)系起來，表明遺傳因素可能與股骨頭壞死的發(fā)生有關(guān)。

糖皮質(zhì)激素受體基因NR3C1是介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素發(fā)揮作用的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，存在較多的突變及多態(tài)性，影響個(gè)體對外源性糖皮質(zhì)激素的敏感性[6]。NR3C1 BclI (rs41423247)基因多態(tài)性是一種比較常見的多態(tài)性變異，并已報(bào)告與高血壓和糖皮質(zhì)激素敏感性增加有關(guān)[7-8]。NR3C1rs6196 A等位基因攜帶者與G等位基因攜帶者相比，有更高的糖皮質(zhì)激素耐藥風(fēng)險(xiǎn)。與G等位基因相比，rs10052957和rs258751 A等位基因的存在可以降低糖皮質(zhì)激素耐藥的發(fā)生率[9]。NR3C1 DNA甲基化與抑郁、焦慮、創(chuàng)傷后心理壓力緊張綜合征、神經(jīng)性貪食癥和邊緣性人格障礙有關(guān)[10-13]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因可編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶，MTHFR的基因突變會顯著降低酶的活性，導(dǎo)致血漿同型半胱氨酸水平升高，從而增強(qiáng)了破骨細(xì)胞活力對骨組織產(chǎn)生直接的損害作用[14]。MTHFR基因的677C>T(rs1801133)變體與血漿同型半胱氨酸水平升高有密切的聯(lián)系[15]。較高的同型半胱氨酸濃度可能會阻礙膠原的合成，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)量的下降和股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)的增加[16]。同型半胱氨酸升高與rs1801133多態(tài)性和低甲基化之間有相關(guān)聯(lián)系[17]。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3(insulin like growth factor bind protein 3,IGFBP3)是血清IGF1的主要載體，通過與配體競爭性結(jié)合抑制IGF1。IGF1通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化[18]。IGFBP3基因的DNA甲基化能通過神經(jīng)體液、炎癥、氧化應(yīng)激等機(jī)制來調(diào)控基因表達(dá)和影響疾病發(fā)生發(fā)展。有研究[19-20]證明影響血管的IGFBP3基因的SNPs與多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化有關(guān)。

DNA甲基化是目前研究最為深入的一種表觀遺傳修飾，可對轉(zhuǎn)座子和基因表達(dá)產(chǎn)生抑制，也可激活一些基因的轉(zhuǎn)錄。筆者先前已證實(shí)基因CYP450的rs2242480 T等位基因與SONFH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)[21]。目前，只有少數(shù)研究探討NR3C1, MTHFR和IGFBP3基因多態(tài)性和甲基化與 SONFH的關(guān)系。本研究對上述3個(gè)基因的SNP位點(diǎn)及陽性位點(diǎn)的DNA甲基化水平進(jìn)行測定，以期進(jìn)一步了解SONFH的生物學(xué)和生理學(xué)機(jī)制，為該病的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018-2021年共招募了來自安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院、安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和宿州醫(yī)院、合肥市第八人民醫(yī)院、中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院和南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院等共82例股骨頭壞死患者。其中79例患者有在患視神經(jīng)脊髓炎病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、急性淋巴細(xì)胞白血病或系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病接受短期沖擊或長期口服糖皮質(zhì)激素治療史，為本研究的病例組，均符合SONFH的診斷標(biāo)準(zhǔn)[22]。3例患者因其他非糖皮質(zhì)激素原因造成的股骨頭壞死被排除在外。根據(jù)安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院的醫(yī)學(xué)檢查，招募了口服糖皮質(zhì)激素(強(qiáng)的松>30 mg/d)治療3個(gè)月后,臨床觀察3年以上未發(fā)生股骨頭壞死的114例患者作為對照組，所有參與者為在合肥及周邊地區(qū)居住或住院就診的中國漢族人口。每位參與者均簽署一份知情同意書。安徽中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)了該研究[倫理批號：2018倫字(07)號]。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①長期口服或短期沖擊使用糖皮質(zhì)激素，累計(jì)相當(dāng)于強(qiáng)的松>30 mg/d超過3個(gè)月；②采用《中國成人股骨頭壞死臨床診療指南(2020)》[23]確診為SONFH的患者；③均攝雙側(cè)髖關(guān)節(jié)正、蛙位片和雙髖磁共振檢查；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未獲得知情同意者;②創(chuàng)傷性股骨頭壞死及其他非糖皮質(zhì)激素原因造成股骨頭壞死者;③病史不全或嚴(yán)重缺陷影響觀察者。

1.3 提取基因及基因分型 基因組DNA提取使用DNA純化試劑盒(Promega, Madison, Wisconsin, USA)，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。目標(biāo)基因SNP位點(diǎn)采用Genesky生物技術(shù)公司(上海，中國)開發(fā)改良的iMLDR技術(shù)進(jìn)行分型。采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測進(jìn)行iMLDR的研究。對每個(gè)單核苷酸多態(tài)性，用不同的熒光標(biāo)記來區(qū)分等位基因特異性寡核苷酸探針對。不同的SNP在3'端被進(jìn)一步區(qū)分為不同的延長長度。設(shè)置兩組陰性對照:一組以雙蒸餾水為模板，另一組為不加引物的DNA樣品，其他條件保持不變。采用ABI3730XL自動測序儀(Applied Biosystems)對占總DNA樣品約5%(n=20)的隨機(jī)樣本進(jìn)行直接測序，以確認(rèn)iMLDR的結(jié)果。

1.4 CpG島選擇 選取位于NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因近端啟動子的CpG島，按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測量:①最小長度為200 bp;②GC含量在50%以上;③0.60或更高的觀察/預(yù)期二核苷酸CpG比值。

1.5 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換和多重放大 DNA甲基化水平采用甲基化靶(MethylTargetTM, Genesky Biotechnologies Inc， Shanghai, China)分析，這是一種基于NGS的多靶點(diǎn)CpG甲基化分析方法。利用基因CpG軟件對感興趣的基因組區(qū)域進(jìn)行分析，并將其轉(zhuǎn)化為bisulfit-convert序列。利用硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化DNA的甲基化引物軟件設(shè)計(jì)PCR引物。使用EZ DNA甲基化TM-GOLD試劑盒(Zymo Research)按照制造商協(xié)議對基因組DNA(400 ng)進(jìn)行亞硫酸鈉處理。用優(yōu)化的引物組合進(jìn)行多重PCR。

1.6 測序 將來自不同樣本的庫進(jìn)行量化并匯集在一起，在Illumina NextSeq平臺上進(jìn)行排序。測序采用2×150 bp雙端模式。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 病例組79例，其中女性45例，男性34例，平均年齡(50.65±13.95)歲；對照組114例，其中女性65，男性49例，平均年齡(42.63±19.27)歲。病例組與對照組相比，年齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.331，P=0.001)，性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.127，P=0.899)。

2.2 SNP位點(diǎn)信息及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 選擇了5個(gè)SNP位點(diǎn)(NR3C1基因的rs10052957、rs41423247位點(diǎn)；MTHFR基因的rs1801133位點(diǎn)；IGFBP3基因的rs2453839、rs3110697位點(diǎn))，對所有樣本采用iMLDR技術(shù)進(jìn)行基因分型并做HWE檢驗(yàn)質(zhì)控，所有位點(diǎn)的P值均>0.05，符合平衡，數(shù)據(jù)可用。見表1。

表1 SNP位點(diǎn)信息與Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.3 SNP位點(diǎn)等位基因及基因型頻率與SONFH的關(guān)聯(lián)分析 病例組與對照組中的5個(gè)SNP位點(diǎn)的2個(gè)等位基因頻率在logistic回歸分析中發(fā)現(xiàn)，rs3110697位點(diǎn)與SONFH有關(guān)聯(lián)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs3110697位點(diǎn)的基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 對照組和病例組等位基因和基因型頻率與SONFH風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析

2.4 SNP位點(diǎn)與SONFH的遺傳模型關(guān)聯(lián)分析 遺傳模型分析發(fā)現(xiàn)，IGFBP3基因的rs3110697位點(diǎn)，在隱性遺傳模型下，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 病例組與對照組遺傳模型分析

2.5 連鎖不平衡分析 對NR3C1及IGFBP3的SNP位點(diǎn)使用haploview軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析存在關(guān)聯(lián)的單倍型，發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)間均不具有較強(qiáng)的連鎖關(guān)系。見圖1。

注：方框中的顏色與數(shù)字均表示SNP之間的連鎖程度強(qiáng)弱，數(shù)字越大，表示SNP之間關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)。

2.6 甲基化數(shù)據(jù)分析

2.6.1 甲基化檢測片段信息 采用Primer3(http://primer3.ut.ee/)軟件對亞硫酸氫鹽處理之后的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。見表4。

表4 甲基化檢測片段引物序列信息

2.6.2 CpG位點(diǎn)甲基化水平差異 本研究共檢測CpG位點(diǎn)164個(gè)，對每個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，篩選具有顯著甲基化水平差異的CpG位點(diǎn)。病例組與對照組相比，CpG位點(diǎn)IGFBP3_2-143，MTHFR_1-36、-77、-139，MTHFR_2-42，NR3C1_2-163，NR3C1_4-47邏輯回歸檢驗(yàn)P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5。

表5 CpG位點(diǎn)甲基化水平顯著差異信息

2.6.3 SNP位點(diǎn)與甲基化交互作用分析 通過基因表達(dá)數(shù)量性狀定位(expression quantitative trait loci,e QTL)作圖方法將所有SNP分型結(jié)果與對應(yīng)位點(diǎn)基因甲基化水平交互作用進(jìn)行線性回歸分析。共10對SNP與甲基化位點(diǎn)之間的線性回歸檢驗(yàn)P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表6。

表6 SNP和CpG位點(diǎn)間交互作用的meQTL分析

3 討論

近年來，糖皮質(zhì)激素已被認(rèn)為是引起非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的首要致病因素[24]。既往研究[25]證實(shí)，大多數(shù)糖皮質(zhì)激素的作用是由糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的。糖皮質(zhì)激素受體由激素結(jié)合域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和氨基末端區(qū)域組成，在糖皮質(zhì)激素敏感性中起決定作用[26]，其作用的分子機(jī)制的改變能改變組織對糖皮質(zhì)激素的敏感性從而導(dǎo)致耐藥或過敏，并引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。股骨頭壞死(osteno narosis of the femoral head,ONFH)和低纖維蛋白溶解或血栓形成傾向之間的遺傳聯(lián)系已經(jīng)被報(bào)道過[27]，MTHFR和血漿纖溶酶原激活抑制劑-1(PAI-1)等凝血相關(guān)因子與ONFH的發(fā)生有關(guān)。因此，凝血和血管生成機(jī)制也被認(rèn)為是影響ONFH的主要因素。本研究希望通過對SONFH相關(guān)基因NR3C1、MTHFR和IGFBP3多態(tài)性及DNA甲基化水平交互作用的遺傳結(jié)構(gòu)研究，探討該病的發(fā)病機(jī)理，以期為疾病的診療提供依據(jù)。

NR3C1的rs41423247多態(tài)性是糖皮質(zhì)激素受體基因外顯子2內(nèi)含子2連接區(qū)下游的C→G核苷酸發(fā)生變化[28]，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和健康人對外源性糖皮質(zhì)激素敏感性的變化有關(guān)[29-30]。本研究中，首次篩選出了NR3C1_2-163和NR3C1_4-47 2個(gè)顯著甲基化水平差異的CpG位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)NR3C1基因SNPs與DNA甲基化之間具有相關(guān)性，表明NR3C1基因的表觀遺傳修飾可與基因多態(tài)性產(chǎn)生交互作用，為SONFH的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的視角。但沒有發(fā)現(xiàn)NR3C1基因型頻率與SONFH的易感性關(guān)系，這可能與本研究選擇的研究對象有關(guān)，本研究招募的對照組人員來自同一所醫(yī)院，但是SONFH患者血液標(biāo)本卻是從不同醫(yī)院獲取，在關(guān)聯(lián)分析中受人口混雜因素影響。進(jìn)一步研究，需要控制地區(qū)差異對研究結(jié)果的干擾。

MTHFR的rs1801133多態(tài)性是由第677位點(diǎn)突變導(dǎo)致的，突變導(dǎo)致的酶活性下降可引起同型半胱氨酸水平增高[31]。同型半胱氨酸會影響創(chuàng)傷愈合、骨骼重塑。Zalavras等[32]在66例患者的對照研究中報(bào)道了非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生率與rs1801133基因突變有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究不支持此結(jié)果，韓國的一項(xiàng)包含443例ONFH患者和273名健康受試者的病例對照研究對15個(gè)SNPs進(jìn)行了基因分析，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的rs1801133多態(tài)性與非創(chuàng)傷性股骨頭壞死基因易感性之間并沒有明顯的聯(lián)系，但作者認(rèn)為地區(qū)和種族的不同可能影響了個(gè)體間的MTHFR基因多態(tài)性[33]。Shang等[34]對MTHFR基因rs1801133多態(tài)性與ONFH的相關(guān)性研究進(jìn)行了進(jìn)一步的Meta分析，發(fā)現(xiàn)在亞洲人群中找不到rs1801133多態(tài)性與ONFH的相關(guān)性，但是在非洲人群中可以找到與ONFH的重要聯(lián)系，認(rèn)為MTHFR基因的rs1801133多態(tài)性是非洲人群ONFH的主要危險(xiǎn)因素。Chai等[35]的Meta分析對種族進(jìn)行分層，結(jié)果顯示ONFH易感性和rs1801133多態(tài)性之間沒有直接聯(lián)系?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，課題組把rs1801133納入本研究中，單獨(dú)分析了ONFH中的SONFH，希望可以解釋文獻(xiàn)報(bào)道的MTHFR基因與SONFH的各種關(guān)聯(lián)。但是本研究結(jié)果也與多數(shù)研究結(jié)果一致，并沒有發(fā)現(xiàn)rs1801133多態(tài)性與SONFH的顯著相關(guān)性。需注意，本研究不包括對止血機(jī)制的評估，此外，本研究也沒有測量同型半胱氨酸水平，rs1801133多態(tài)性可能通過促進(jìn)血管內(nèi)凝血導(dǎo)致SONFH的假設(shè)仍有待證實(shí)。但本研究在分析SNPs與甲基化水平交互作用時(shí)，得出MTHFR1-36、MTHFR_1-77、MTHFR_1-139、MTHFR_2-42等位點(diǎn)的甲基化水平差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在SONFH的發(fā)生發(fā)展中，MTHFR的表觀遺傳學(xué)可能是連接環(huán)境因素和SONFH基因相互作用的重要橋梁。

IGFBP3是IGF1在血循環(huán)中的主要載體，能夠延長IGF1在血液循環(huán)中的半衰期。IGF1能夠促進(jìn)骨骼細(xì)胞增殖，增加骨骼長度，參與了蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)維生素D活化[36]。IGFBP3在缺氧誘導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮作用[37]，并且與動脈粥樣硬化有關(guān)[38]。有研究觀察IGFBP3rs2453839與子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系時(shí)，證實(shí)IGFBP3的遺傳變異可能影響白種人的子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)[39]，涉及到了種族因素。Hong等[40]采用Affymetrix靶向基因分型3K芯片陣列對460例ONFH患者和300例對照者進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)韓國人群中IGFBP3基因的SNPs與ONFH風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；rs2453839在隱性模型中與酒精誘發(fā)的ONFH和特發(fā)性O(shè)NFH有顯著相關(guān)性；攜帶rs2453839的小純合子等位基因(CC)的受試者有較高的ONFH發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Song等[41]納入ONFH臨床分期，得出與正常對照組相比，SONFH組IGFBP3rs2453839 TT和CT頻率分別呈上升和下降趨勢；多態(tài)性與臨床表型的關(guān)聯(lián)分析表明IGFBP3基因rs2453839 TT型SONFH患者的病程明顯短于CT+CC攜帶者。Ⅲ/Ⅳ期雙側(cè)髖部病變組CT+CC基因型頻率顯著高于Ⅲ/Ⅳ期單側(cè)病變組和Ⅱ/Ⅲ期雙側(cè)病變組。另一項(xiàng)對照研究中，IGFBP3基因rs3110697和rs2453839的主要模型與ONFH的風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)，rs2453839的基因型也與臨床分期密切相關(guān)；與對照組相比，ONFH組中IGF1的統(tǒng)計(jì)量增加了，血清三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平相較于對照組明顯升高，但血清高密度脂蛋白膽固醇水平相較對照組則明顯降低[42]。因此，本研究認(rèn)為IGFBP3基因多態(tài)性可能影響血液循環(huán)，損害股骨頭，進(jìn)一步導(dǎo)致SONFH。在本研究中，證實(shí)了IGFBP3基因的rs3110697多態(tài)性與中國漢族人群SONFH的發(fā)生有關(guān)。與對照組相比，rs3110697的A/G基因型攜帶者患病風(fēng)險(xiǎn)較低；在隱性遺傳模型中，rs3110697的A等位基因攜帶者的患病風(fēng)險(xiǎn)也較低。本研究發(fā)現(xiàn)CpG位點(diǎn)IGFBP3_2-143可能與IGFBP3基因多態(tài)性有相互作用，從而影響SONFH的發(fā)生；但沒有發(fā)現(xiàn)rs2453839多態(tài)性與SONFH的相關(guān)性。

綜上所述，SONFH是一個(gè)多基因遺傳病，涉及激素受體、代謝轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激、遺傳、神經(jīng)突觸、脂質(zhì)及骨代謝等多種機(jī)制，本研究首次證實(shí)了在中國漢族人群中NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因的表觀遺傳修飾可與遺傳基因多態(tài)性產(chǎn)生交互作用影響SONFH，基于對該病的遺傳結(jié)構(gòu)特征的研究可以準(zhǔn)確把握該疾病的發(fā)展規(guī)律。

本研究也存在一些局限性。首先，本研究不包括生物學(xué)功能的分析，這對闡明NR3C1、MTHFR和IGFBP3基因在SONFH的作用至關(guān)重要。另外，糖皮質(zhì)激素治療病例中的骨壞死并不意味著單純的糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致它。應(yīng)考慮所有可能的風(fēng)險(xiǎn)因素，如基礎(chǔ)疾病，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，這是導(dǎo)致SONFH的累積效應(yīng)[43]。其次，SONFH還需要分為不同的臨床分期進(jìn)行進(jìn)一步分析。再次，本研究的病例組與對照組人員都是自合肥及周邊地區(qū)招募的漢族人口，這可能存在區(qū)域選擇偏差。最后，本研究納入的病例組與對照組平均年齡差異較明顯，可能存在結(jié)果誤差。進(jìn)一步的功能性研究和更大規(guī)模的病例對照研究有望避免這些問題，使本研究的結(jié)論更具有說服力。