李睿 ，紀(jì)樹(shù)亮 ，章潔淳 ，孫治中 ，楊曉丹 ，劉煜德 ，鄺棗園 ，卿立金 ，吳偉 （.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，廣州 000；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 000；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院呼吸科，廣州 000；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣州 000）

隨著再灌注治療如經(jīng)皮冠脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）的普及，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的病死率顯著降低。然而，隨著冠心病患者數(shù)量逐年增加，AMI-PCI術(shù)后無(wú)復(fù)流現(xiàn)象、微循環(huán)障礙、心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）等并發(fā)癥日益突出[1]。廣東省名中醫(yī)吳偉教授基于冠心病熱毒血瘀病機(jī)所創(chuàng)制的清熱活血湯（由毛冬青、黃芩、川芎、赤芍、降香、紅花、丹參組成）是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療AMI-PCI術(shù)后的協(xié)定方劑，已廣泛運(yùn)用于臨床20余年，療效確切。為使更多患者獲益，醫(yī)院擬對(duì)其進(jìn)行制劑開(kāi)發(fā)及成果轉(zhuǎn)化。本課題組前期研究表明，清熱活血湯能改善AMI-PCI術(shù)后患者圍術(shù)期臨床癥狀、短期及遠(yuǎn)期預(yù)后，減少心血管終點(diǎn)事件的發(fā)生，且可通過(guò)調(diào)控自噬改善AMI模型大鼠的心肌組織損傷[2―4]，但對(duì)MIRI的影響及具體機(jī)制尚未明確。超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spec‐trometry，UPLC-MS）技術(shù)具有高通量、高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)，適用于分析包括難揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差的代謝產(chǎn)物。本研究旨在探討清熱活血湯對(duì)MIRI模型大鼠的改善作用，并基于UPLC-MS技術(shù)分析其藥效成分及相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)制劑開(kāi)發(fā)提供思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BL-420I型動(dòng)物信號(hào)采集與處理系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），Pannoramic MIDIⅡ型數(shù)字病理切片掃描儀（濟(jì)南丹吉爾電子有限公司），TGL-16MS型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），LNG-T98型冷凍濃縮離心干燥器（太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)），QE型高分辨質(zhì)譜儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；Nexera UPLC型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 主要藥物與試劑

清熱活血湯的中藥配方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，其方劑組成為黃芩15 g、毛冬青30 g、丹參30 g、赤芍15 g、川芎15 g、降香6 g、紅花10 g。戊巴比妥鈉鹽（貨號(hào)57330）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號(hào)A001-1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（貨號(hào)A005）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號(hào)A003-1）均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；多聚甲醛固定液（貨號(hào)G1101-500ML）、蘇木素-伊紅（HE）染液試劑盒（貨號(hào)G1003）、TUNEL試劑盒（貨號(hào)G1501）均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；L-2-氯苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)C2001，純度98%）購(gòu)自上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD大鼠，5～7周齡，體質(zhì)量180～220 g，共42只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2021-0041。大鼠飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循3R原則。所有實(shí)驗(yàn)操作均獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批，批準(zhǔn)號(hào)為T(mén)CMF1-2021044。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，清熱活血湯低、中、高劑量組（4.94、9.88、19.79 g/kg，參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行人鼠等效劑量換算，中劑量為等效劑量），清熱活血湯含藥血清組（19.79 g/kg），空白血清組，每組6只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白血清組、假手術(shù)組、模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)2周。于末次給藥12 h后，模型組和清熱活血湯各劑量組復(fù)制MIRI大鼠模型，假手術(shù)組僅穿線(xiàn)不結(jié)扎，具體參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行造模：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）進(jìn)行麻醉，行氣管內(nèi)插管并連接呼吸機(jī)輔助通氣，鈍性分離皮下各層肌肉后剪斷第3肋骨以暴露心臟，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界下2 mm處用帶有5-0縫合線(xiàn)的圓針進(jìn)針，對(duì)冠脈左前降支近中段行活結(jié)結(jié)扎（進(jìn)針深度2 mm，寬度3～4 mm）；缺血（左室前壁心肌發(fā)白、心電圖ST段抬高0.1 mV以上為缺血標(biāo)志）30 min后松開(kāi)活結(jié)再灌注90 min，若再灌注時(shí)左室前壁缺血心肌部分恢復(fù)紅潤(rùn)，且心電圖ST段下降50%以上則造模成功。后續(xù)取上述5組大鼠全血及心臟組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。空白血清組和清熱活血湯含藥血清組大鼠不進(jìn)行MIRI造模，于末次給藥2 h后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，血樣室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大鼠心臟組織病理學(xué)形態(tài)觀(guān)察

將“2.1”項(xiàng)下假手術(shù)組、模型組和清熱活血湯各劑量組大鼠心臟組織使用預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液清洗后固定于4%多聚甲醛中24 h，然后進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作，取上述部分切片（剩余部分進(jìn)行細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)）以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，進(jìn)行HE染色，采用數(shù)字病理切片掃描儀觀(guān)察大鼠心臟組織的病理學(xué)形態(tài)變化。

2.3 大鼠心臟組織中細(xì)胞凋亡水平的檢測(cè)

取“2.2”項(xiàng)下剩余切片按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作后，采用數(shù)字病理切片掃描儀掃描觀(guān)察，并隨機(jī)選取6個(gè)視野使用Image J軟件計(jì)算心臟組織細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4 大鼠清熱活血湯含藥血清和空白血清的UPLCMS分析

2.4.1 血清樣本的預(yù)處理 將“2.1”項(xiàng)下空白血清組和清熱活血湯含藥血清組的血清樣本取出解凍，移取樣本100 μL，加入內(nèi)標(biāo)（0.06 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸）20 μL，渦旋震蕩10 s；加入蛋白沉淀劑300 μL渦旋震蕩1 min，再于冰水浴中超聲（功率360 W，頻率40 kHz，下同）提取10 min后，于－20 ℃條件下靜置30 min；靜置后，將樣本于4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL裝入U(xiǎn)PLC-MS進(jìn)樣小瓶中揮干溶劑。樣本殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶（渦旋30 s，超聲3 min）后，離心10 min，吸取上清液150 μL，以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行UPLC-MS分析。每組平行6份樣本。

2.4.2 UPLC-MS條件 （1）色譜條件：色譜柱為ACQUITYUPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B，含0.1%甲酸），梯度洗脫（0～2 min，5%B；2～4 min，5%B→30%B；4～8 min，30%B→50%B；8～10 min，50%B→80%B；10～14 min，80%B→100%B；14～15 min，100%B；15～16 min，100%B→5%B）；流速為0.35 mL/min；進(jìn)樣體積為2 μL。（2）質(zhì)譜條件：離子源為ESI；質(zhì)荷比掃描范圍為100～1 200；一級(jí)全掃描分辨率為7×105；噴霧電壓（V）為3 500（+）、－3 000（－）；鞘氣流速（Arb）為40（+）、35（－）；輔氣流速（Arb）為10（+）、8（－）；毛細(xì)管溫度為320 ℃；質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。

2.4.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理 UPLC-MS原始數(shù)據(jù)采用Progenesis QI v2.3軟件進(jìn)行基線(xiàn)過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化?；衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片及同位素分布，并使用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、Lipidmapsv2.3（https：//dev.lipidmaps.org/）和METLIN（http：//enigma.lbl.gov/metlin/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。筆者基于提取出的數(shù)據(jù)，將組內(nèi)缺失值（即離子峰值為0）＞50%的化合物的所有離子峰以極小值的1/2進(jìn)行替換，并根據(jù)化合物定性結(jié)果打分進(jìn)行篩選[篩選標(biāo)準(zhǔn)為≥36分（滿(mǎn)分60分）；＜36分視為定性結(jié)果不準(zhǔn)確，則排除[7]]，最后將正負(fù)離子數(shù)據(jù)合并為一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣表，后續(xù)研究則以此表為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。

2.4.4 藥效成分分析 基于“2.4.3”項(xiàng)下鑒定所得化合物，以P＜0.05、差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.2為篩選條件，篩選清熱活血湯含藥血清相對(duì)于空白血清含量較高的化合物，然后與黃芩、毛冬青、川芎、赤芍、降香、紅花、丹參在TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SYMMAP（http：//www.symmap.org/）、HERB（http：//herb.ac.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的化學(xué)成分進(jìn)行交集，以確認(rèn)清熱活血湯含藥血清中的主要藥效成分。

2.4.5 差異代謝物及代謝通路分析 基于“2.4.3”項(xiàng)下鑒定所得化合物，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘分析（partial least squares dis‐crimination analysis，PLS-DA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）來(lái)區(qū)分清熱活血湯含藥血清組與空白血清組之間代謝輪廓的總體差異[7]。采用OPLS-DA中變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值及t檢驗(yàn)篩選組間差異代謝物（篩選標(biāo)準(zhǔn)為VIP值＞1，P＜0.05）[8]。 采 用 HMDB、METLIN、KEGG（https：//www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行指認(rèn)并基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路富集分析。

2.5 大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的檢測(cè)

取假手術(shù)組、模型組和清熱活血湯低、中、高劑量組大鼠的全血樣本適量，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min。取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法操作后，采用比色法檢測(cè)大鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）或Dunnett’s T3檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠心臟組織病理形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞纖維排列整齊、肌節(jié)清晰緊密。模型組大鼠大部分心肌細(xì)胞腫脹變形、肌絲斷裂，組織間隙水腫、白細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯。清熱活血湯各劑量組心肌細(xì)胞紊亂、心肌纖維斷裂有所改善，且隨著給藥劑量的增加，改善越明顯。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織的病理形態(tài)學(xué)顯微圖（HE染色，×200）

3.2 大鼠心臟組織中細(xì)胞凋亡水平的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組[（1.25±0.34）%]比較，模型組大鼠心臟組織中細(xì)胞凋亡率[（38.62±5.75）%]顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，清熱活血湯低、中、高劑量組大鼠心臟組織中細(xì)胞凋亡率[分別為（24.59±1.17）%、（21.41±3.03）%、（15.86±3.06）%]均顯著降 低（P＜0.05），且清熱活血湯高劑量組細(xì)胞凋亡率顯著低于中、低劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織中細(xì)胞凋亡的熒光圖（TUNEL染色，×200）

3.3 清熱活血湯含藥血清的藥效成分分析

清熱活血湯含藥血清中相對(duì)含量較高的化學(xué)成分共有1 137種，與黃芩、毛冬青、川芎、赤芍、降香、紅花、丹參在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中所收錄的1 402種化學(xué)成分進(jìn)行交集后，得出清熱活血湯含藥血清中共有20種主要藥效成分，包括黃芩苷、琥珀酸、黃芩素、隱丹參酮、異阿魏酸、原兒茶醛、丹酚酸G、3，4-二羥基肉桂酸、異紅花素等，其中黃芩苷的相對(duì)含量較高。結(jié)果見(jiàn)圖3、表1。

表1 清熱活血湯含藥血清中的主要藥效成分

圖3 正、負(fù)離子模式下清熱活血湯含藥血清代謝成分的總離子流圖

3.4 差異代謝物的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

清熱活血湯含藥血清組和空白血清組的血清樣本數(shù)據(jù)經(jīng)無(wú)監(jiān)督PCA模型（R2X＝0.577）及PLS-DA模型（R2X＝0.807，R2Y＝0.997，Q2＝0.97）預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，模型可靠性較好，組間總體代謝成分存在差異。進(jìn)一步經(jīng)OPLS-DA 模型（R2X＝0.731，R2Y＝0.986，Q2＝0.908）預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，R2Y和Q2均接近于1，結(jié)合Splot-OPLS-DA圖結(jié)果提示兩組間血清總體代謝譜差異顯著。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 清熱活血湯含藥血清組和空白血清組大鼠血清樣本的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

3.5 差異代謝物的通路富集分析

本研究共篩選出29種差異代謝物，共參與35條代謝通路。其中，清熱活血湯可上調(diào)L-異亮氨酸、左旋精氨酸、檸檬酸、谷胱甘肽、β-D-葡萄糖、左旋肉堿、瓜氨酸、異丙腎上腺素、D-核糖、D-葡萄糖醛酸等15種代謝物水平（P＜0.05），可下調(diào)花生四烯酸、3-磷酸-d-甘油磷酸酯、亞油酸、二十二碳六烯酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、棕櫚酰肉堿、4-羥脯氨酸、葡萄糖苷酸、碘化酪氨酸等14種代謝物水平（P＜0.05）。上述差異代謝物主要涉及精氨酸生物合成、亞油酸代謝、檸檬酸循環(huán)、糖酵解/糖異生途徑、磷酸戊糖途徑、脂質(zhì)降解調(diào)節(jié)、血管平滑肌收縮、鐵死亡、瞬時(shí)感受器電位（transient receptor potential，TRP）通道炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)，以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mamma‐lian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路等代謝途徑。

3.6 大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的檢測(cè)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，清熱活血湯各劑量組大鼠上述指標(biāo)（低劑量組SOD除外）水平均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴(lài)趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表2 各組大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與清熱活血湯低劑量組比較，P＜0.05；d：與清熱活血湯中劑量組比較，P＜0.05

GSH-Px/（U/mL）394.52±35.23 104.88±33.43a 187.14±27.30b 271.43±27.70bc 335.71±22.23bcd組別假手術(shù)組模型組清熱活血湯低劑量組清熱活血湯中劑量組清熱活血湯高劑量組MDA/（nmol/mL）7.36±1.50 52.66±5.32a 33.65±3.99b 15.14±3.15bc 10.09±2.33bc SOD/（U/mL）387.11±20.85 211.66±23.14a 246.87±17.91 271.33±21.79b 338.11±20.52bcd

4 討論

心肌梗死面積是AMI患者預(yù)后的決定性因素，再灌注治療可誘發(fā)心肌缺血期間并不存在的損傷或使已有損傷加重，其所造成的心肌損傷甚至可達(dá)50%心肌梗死面積[9]。因此，抑制MIRI，減少心肌梗死面積，從而減少介入術(shù)后心力衰竭及心室重構(gòu)的發(fā)生，是心肌保護(hù)治療策略的重要方向。清熱活血湯方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，毛冬青清熱解毒、活血通脈，君臣配伍為主藥；丹參、赤芍、川芎、紅花力佐活血化瘀之功，降香理氣助使活血止痛；幾者并用共奏清熱解毒、活血化瘀之效?；诖耍菊n題組探討了清熱活血湯改善模型大鼠MIRI的藥效成分及相關(guān)作用機(jī)制。

4.1 清熱活血湯對(duì)MIRI模型大鼠的影響及藥效成分分析

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重，而清熱活血湯各劑量組大鼠心肌組織損傷減輕，細(xì)胞凋亡率顯著降低。應(yīng)用UPLC-MS確認(rèn)了清熱活血湯含藥血清中20種主要藥效成分，包括黃芩苷、琥珀酸、黃芩素、隱丹參酮、異阿魏酸、原兒茶醛、丹酚酸G、3，4-二羥基肉桂酸、異紅花素等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過(guò)抑制Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路促進(jìn)MIRI模型大鼠心肌巨噬細(xì)胞M2型極化，并通過(guò)抗炎、抗氧化、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用改善MIRI模型大鼠的心肌損傷及血管內(nèi)皮功能[10―12]。原兒茶醛可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)，從而改善MIRI模型大鼠的心肌損傷[13]。隱丹參酮可通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平，發(fā)揮保護(hù)心肌組織的作用[14]。3，4-二羥基肉桂酸可通過(guò)誘導(dǎo)MIRI模型大鼠心肌組織胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化，降低B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)X蛋白表達(dá)，抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡[15]。這提示，上述成分可能是清熱活血湯改善MIRI模型大鼠心肌損傷的藥效成分基礎(chǔ)。

4.2 清熱活血湯改善MIRI的差異代謝物及代謝通路分析

4.2.1 改善心肌能量代謝 MIRI造成的缺血缺氧心肌于再灌注期間進(jìn)一步損傷、凋亡或壞死，其病理生理機(jī)制涉及能量代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞壞死與凋亡等多種機(jī)制[16]。其中，心肌能量代謝障礙是始發(fā)因素，缺血期間心肌細(xì)胞脂肪酸有氧代謝受到抑制，無(wú)氧糖酵解供能增加，導(dǎo)致乳酸等代謝物堆積；而再灌注期間脂肪酸氧化代謝增多，但脂肪酸的低效供能可導(dǎo)致細(xì)胞氧耗增多，同時(shí)糖有氧酵解被抑制而導(dǎo)致糖代謝的酸性中間產(chǎn)物進(jìn)一步增加，造成細(xì)胞內(nèi)酸中毒[17]。本研究結(jié)果顯示，清熱活血湯含藥血清中涉及氨基酸合成通路的異亮氨酸、左旋精氨酸、瓜氨酸等代謝物，以及涉及檸檬酸循環(huán)、糖酵解/糖異生途徑、磷酸戊糖途徑的檸檬酸、D-核糖、D-葡萄糖醛酸、β-D-葡萄糖等代謝物均顯著上調(diào)；其中，異亮氨酸、精氨酸又為生糖氨基酸，D-核糖是機(jī)體重要的五碳糖，可加快心肌細(xì)胞ATP合成。另外，清熱活血湯含藥血清中3-磷酸-d-甘油磷酸酯、二十二碳六烯酸、亞油酸、磷脂酰膽堿等脂質(zhì)代謝物均顯著下調(diào)，而脂肪酸β-氧化必需的輔助因子——左旋肉堿釋放增加。這提示，清熱活血湯可調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝途徑，減少脂質(zhì)代謝，促進(jìn)非必需氨基酸合成、糖異生及糖酵解，進(jìn)而改善MIRI。

4.2.2 調(diào)節(jié)炎癥損傷、氧化應(yīng)激及自噬通路 再灌注期間細(xì)胞能量供應(yīng)仍不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，導(dǎo)致大量Ca2+內(nèi)流引發(fā)鈣超載[18―19]。鈣超載可激活氧自由基底物，從而加速活性氧（reactive oxygen species，ROS）形成，ROS可對(duì)磷脂膜、蛋白和DNA功能結(jié)構(gòu)造成直接破壞[20―21]，并激活核因子κB信號(hào)通路活性，促進(jìn)炎癥因子及炎癥細(xì)胞的釋放，進(jìn)而加重心肌損傷；同時(shí)可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線(xiàn)粒體損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果顯示，清熱活血湯含藥血清中涉及磷酸戊糖途徑的D-核糖、β-D-葡萄糖代謝物及谷胱甘肽水平顯著上調(diào)。磷酸戊糖途徑的激活有助于維持谷胱甘肽水平，而谷胱甘肽是體內(nèi)ROS的強(qiáng)效清除劑，有助于拮抗MIRI所致的心肌組織氧化應(yīng)激損傷[23]。這提示，清熱活血湯可通過(guò)抗氧化作用改善MIRI。

花生四烯酸次級(jí)產(chǎn)物血栓烷素A2和白細(xì)胞三烯具有促血小板聚集及促炎癥作用，其羥化酶代謝產(chǎn)物20-羥基二十碳四烯酸具有收縮血管及誘導(dǎo)ROS生成、血管內(nèi)皮紊亂及心肌細(xì)胞凋亡等作用[24]；溶血磷脂酰膽堿具有促進(jìn)血管平滑肌收縮、血小板聚集及誘導(dǎo)心肌動(dòng)作電位紊亂和心肌細(xì)胞鈣循環(huán)障礙的作用[25]。本研究結(jié)果顯示，清熱活血湯含藥血清可下調(diào)涉及TRP通道炎癥介質(zhì)、鐵死亡及血管平滑肌收縮代謝途徑的溶血磷脂酰膽堿、花生四烯酸、棕櫚酰肉堿水平，上調(diào)谷胱甘肽水平。上述代謝途徑均與MIRI預(yù)后密切相關(guān)[26―27]。這提示，清熱活血湯有助于改善MIRI所致的心肌組織炎癥浸潤(rùn)、微循環(huán)障礙及氧化應(yīng)激相關(guān)性損傷。此外，清熱活血湯含藥血清可上調(diào)涉及mTOR信號(hào)通路的左旋精氨酸。mTOR是調(diào)控細(xì)胞自噬的關(guān)鍵靶點(diǎn)[28]，這提示清熱活血湯改善MIRI的作用可能與自噬機(jī)制有關(guān)。

MDA是脂類(lèi)過(guò)氧化的最終代謝產(chǎn)物，是反映組織氧化損傷的客觀(guān)指標(biāo)，而SOD、GSH-Px作為抗氧化酶可有效清除超氧陰離子及脂類(lèi)過(guò)氧化物自由基以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[29]?；诖?，通過(guò)對(duì)該類(lèi)指標(biāo)的檢測(cè)可對(duì)上述氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物及代謝途徑進(jìn)行表型驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，清熱活血湯可呈劑量依賴(lài)地改善MIRI模型大鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平。

綜上所述，清熱活血湯可改善MIRI模型大鼠心臟組織損傷，其藥效成分包括黃芩苷、隱丹參酮、異阿魏酸、原兒茶醛等，其作用機(jī)制可能與改善心肌能量代謝、下調(diào)氧化應(yīng)激水平、抑制炎癥浸潤(rùn)有關(guān)。