王華敏，嚴(yán)佳佳，尤田，薛鮮麗，王德培，高強

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，生物工程國家級實驗教學(xué)示范中心，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）又稱三酰甘油水解酶，能夠水解長鏈脂肪酸三酰甘油的一類酶的總稱，是常用的生物催化酶制劑之一[1]，催化甘油三酯水解生成甘油和脂肪酸[2]。脂肪酶廣泛存在于動物、植物組織以及多種微生物中，種類最多的脂肪酶來源于微生物，據(jù)統(tǒng)計，產(chǎn)脂肪酶的微生物屬包括細菌28個屬、真菌23個屬[3]。工業(yè)用脂肪酶主要來源于微生物[4]，具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、穩(wěn)定性好等優(yōu)點[5]，而且其反應(yīng)條件溫和、對原材料要求低、成品質(zhì)量高[6]，不需要輔酶、副反應(yīng)少、可用于有機溶劑等[7]；因此，微生物脂肪酶被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及生物柴油等領(lǐng)域[8-9]。脂肪酶雖然在工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用，但是大多數(shù)游離脂肪酶壽命短且在有機相中不溶解，反應(yīng)過程中容易結(jié)塊，且受溫度、pH值、溶劑等因素的影響，游離酶的催化活性很低甚至容易失活，這大大降低了酶的水解效率[6，10]。而物理或化學(xué)固定化脂肪酶又有著固定化過程復(fù)雜、制備成本較高、固定化過程中酶活力或理化性質(zhì)易損失等缺點。因此，以全細胞的形式利用脂肪酶是降低生物轉(zhuǎn)化成本最有前景的方法之一[11]。

纖維素作為分布最廣、含量最多的多糖，是比較廉價的材料，可以作為實用的固定化載體[12]。人們在研究纖維素酶降解纖維素時發(fā)現(xiàn)，纖維素酶由纖維素結(jié)合域（cellulose binding domain，CBD）和纖維素催化域組成，兩者之間通過連接橋連在一起[12-13]。其中，纖維素結(jié)合域能夠牢固錨定在纖維素底物[14]，使鄰近的催化域更容易接近底物，促進底物的水解[15]。將表面展示真菌CBD的重組肉葡萄球菌固定于棉花纖維上[16]以及將糞堿纖維單胞菌（Cellulomonas fimi）的CBD錨定在大腸桿菌表面[17]等試驗證實了整個細胞與纖維素材料的特異性黏附。根據(jù)氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和結(jié)合特異性，CBD可分為14個家族，大部分屬于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ家族，來源于C.fimi的CBD屬于Ⅱα家族[18]。

肉葡萄球菌通常被認(rèn)為是一種安全性的菌株[19]，由于其缺乏毒素、溶血素以及極低的胞外蛋白水解活性[20]，從而使其成為有吸引力的生產(chǎn)分泌重組蛋白的宿主[21]。本研究通過基因工程的方法，將來源于變形桿菌（Proteus sp.）的脂肪酶基因（lip）和來源于 C.fimi的CBD結(jié)合域融合表達并錨定于肉葡萄球菌細胞表面，探究全細胞酶固定化的最適條件及其酶學(xué)性質(zhì)，為后續(xù)全細胞固定化脂肪酶的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌種

Staphylococcus carnosus TM300菌株（食品級）：德國圖賓根大學(xué)微生物遺傳學(xué)研究所Friedrich Goetz教授贈予；表達奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）MPE4069菌株脂肪酶（GenBank ID：CP053718.1）的 Escherichia coli-Staphylococci穿梭質(zhì)粒pBT2-SPP-LIP-XM：天津科技大學(xué)生化過程與技術(shù)實驗室前期構(gòu)建并保存；E.coli DH5α感受態(tài)細胞：天津科技大學(xué)生化過程與技術(shù)實驗室制備保存；糞堿纖維單胞菌（Cellulomonas fimi）的CBD 結(jié)合域（GenBank ID：M15823.1）：蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司全基因合成。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、瓊脂粉20.0 g/L（固體培養(yǎng)基加入），1×105Pa滅菌 20 min。

1.1.3 主要試劑與儀器

溶菌酶：北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅡ、T4 DNA連接酶：寶生物工程（大連）有限公司；多功能DNA純化回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；2×Rapid Taq Mster Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳快速制備試劑盒（12.5%）：上海雅酶生物科技有限公司。

pHSJ-4A pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；F-7100紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Master Cycler Nexus聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國 Eppendorf公司；TGL-16高速冷凍離心機：賽默飛世爾（中國）科技公司。

1.2 方法

1.2.1 表達載體pBT2-SPP-LIP-CBD-XM的構(gòu)建

以前期構(gòu)建保存的質(zhì)粒pBT2-SPP-LIP-XM為模板，使用引物 L-F（CCAAGCTTATGAGCACGAAATACCCGATT）和 L-R（GCTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGATGAAGCTGTTTGGAGGCAAGATACT）擴增 lip基因；使用引物C-F（GGCTAGCCATGTCCACCCGCAGAACC）和 C-R（CAGATCTGCTTATCGTCG TCATCCTTGT AATCG）擴增CBD基因；以瓊脂糖凝膠電泳回收純化后的lip和CBD片段為模板，使用引物L(fēng)-F和C-R擴增融合片段lip-CBD基因，下劃線為酶切位點。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，純化回收并送至華大基因測序分析。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BglⅡ分別對質(zhì)粒pBT2-SPP-LIP-XM和融合片段lip-CBD進行雙酶切，純化回收，Solution Ⅰ連接酶中16℃連接40 min。

1.2.2 基因工程菌S.carnosus TM300/pBT2-SPP-LIPCBD-XM的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pBT2-SPP-LIP-CBD-XM用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α的感受態(tài)細胞中，涂布至含有氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選，37℃培養(yǎng)12h～16h后，挑取單菌落至上述抗性LB培養(yǎng)液的試管中，溫度37℃、180 r/min培養(yǎng)12 h～16 h，取適量菌液提取質(zhì)粒擴增lip-CBD基因測序分析（測序委托深圳華大基因科技有限公司完成）。選擇測序正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至肉葡萄球菌的感受態(tài)細胞中，涂布至含有氯霉素的LB抗性平板上進行篩選，37℃培養(yǎng)14 h～16 h后，挑取單菌落至上述抗性LB培養(yǎng)液的試管中，37℃、180r/min培養(yǎng)14 h～16 h，取適量菌液提取質(zhì)粒，測序分析。

1.2.3 目的蛋白的提取和純化

挑取單菌落S.carnosus TM300/P-SPP-LIP-CBDXM接種到5 mL含有氯霉素的LB試管中培養(yǎng)，然后按接種量1%轉(zhuǎn)接至含有相同抗性的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)18 h～24 h。

將發(fā)酵后的菌液倒入50mLEP管中，4℃、5500r/min離心10 min收集菌體置于-80℃12 h。收集冰凍的菌體至研缽中，用液氮將其研磨至粉末，收集粉末大約0.2 g，用 1 mL 0.05 mol/L PBS（pH7.4）緩沖液溶解粉末。4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液提取蛋白。將收集到的蛋白提取液過鎳柱純化，使用80 mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白，再使用300 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白并收集，得到純化后的目的蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗驗證純度。

1.2.4 分光光度計法測脂肪酶酶活力

在一定范圍內(nèi)，OD410隨著對硝基苯酚濃度的升高而增長，而對硝基苯酚的濃度又體現(xiàn)了脂肪酶的活力。配制不同濃度的對硝基苯酚（p-nitro phenol，p-NP）溶液，混勻后測定OD410，繪制OD410與p-NP摩爾關(guān)系曲線見圖1。按照表1的反應(yīng)體系測定脂肪酶的活性，終止液選用10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）。

圖1 OD410中p-NP的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of p-NP in OD410

表1 測酶活力的反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for measuring enzyme activity

1個酶活力單位定義為室溫（25℃）下每分鐘釋放1 μmol對硝基苯酚（p-NP）所需要的酶量。

1.2.5 高酶活轉(zhuǎn)化子的篩選

對經(jīng)驗證正確的轉(zhuǎn)化子按照1.2.4的方法進行酶活力的測定，從中篩選出酶活力較高的轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)試驗。

1.2.6 溶菌酶處理菌體

挑取單菌落S.carnosus TM300/P-SPP-LIP-CBDXM接種到5 mL含有氯霉素的LB試管中振蕩培養(yǎng)18 h～24 h 后，180 r/min 離心 1 min，倒掉上清液，菌體用1 mL PBS洗滌2次。加入1 mL不同濃度的溶菌酶，37℃水浴鍋中放置1 h后加入1 mL PBS洗滌2次，收集菌體沉淀測酶活力。

1.2.7 纖維素濾紙固定細胞

按照1.2.3的方法對目的蛋白進行表達后離心收集菌體，用PBS洗滌2次，取適量菌體重懸于緩沖液中至OD600=1.0。在一次性培養(yǎng)皿中加入10 mL菌懸液，再加入一張纖維素濾紙振蕩孵育。孵育結(jié)束后取培養(yǎng)皿中的菌懸液測定OD600（B），以未加入纖維素濾紙的菌懸液的OD600（A）作為對照。

1.2.8 細胞對纖維素濾紙的吸附率計算方法

細胞對纖維素濾紙的吸附率計算公式如下。

吸附率/%=（A-B）/A×100

式中：A為未加入纖維素濾紙的菌懸液在600nm處的吸光度；B為加入纖維素濾紙的菌懸液在600nm處的吸光度。

1.2.9 單因素固定化條件優(yōu)化

對收集到的菌體用PBS洗滌2次后按照1.2.7的方法對菌懸液進行孵育，結(jié)束后按照1.2.8的方法計算吸附率，分別考察固定化溫度（4、16、25、30、37 ℃）、pH值（6、7、8、9、10、11）、時間（2、4、6、8、10 h）和轉(zhuǎn)速（60、80、100、120 r/min）對吸附率的影響。

1.2.10 正交試驗

在分別探究溫度、pH值、時間和轉(zhuǎn)速對吸附率的影響之后，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，獲得較優(yōu)的吸附條件。正交試驗因素水平見表2。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.11 固定化細胞穩(wěn)定性研究

取1.0 g微晶纖維素，用無菌水清洗3遍，與1.2.7處理后的菌懸液在最適的條件下進行固定化。按照酶活力的測定方法，將固定化細胞加入反應(yīng)體系中測定酶活力，然后1 200 r/min離心1 min倒去上清液，用PBS將固定化細胞在相同條件下多次離心洗滌過濾，除去表面殘留未反應(yīng)底物和反應(yīng)后的產(chǎn)物，然后將其重新加入到反應(yīng)體系中測定殘留的酶活力，如此反復(fù)操作10次，以初始酶活力為100%，考察隨著使用次數(shù)的增加，固定化細胞表面酶活力的保留情況。

1.2.12 固定化細胞酶學(xué)性質(zhì)探究

按照1.2.10的條件獲得固定化細胞，使用不同pH值的緩沖液將其洗滌3次后，40℃下在pH6.0～11.0緩沖液中反應(yīng)10 min測定酶活力，確定細胞固定化后酶活力的最適pH值。在最適pH值條件下，于30℃～55℃反應(yīng)10 min測定酶活力，確定細胞固定化后的最適溫度。最后分別在不同的溫度與pH值下反應(yīng)3 h，每隔30 min取樣測定酶活力，確定細胞固定化后的活力穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel處理后取平均值，圖表采用Minitab軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體pBT2-SPP-LIP-CBD-XM構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化子獲得

轉(zhuǎn)化子PCR驗證見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)化子PCR驗證Fig.2 PCR verification of transformants

由圖2可知，以純化后的lip和CBD基因為模板擴增融合片段lip-CBD，經(jīng)電泳檢測擴增的條帶約為1 437 bp，符合預(yù)期，經(jīng)測序比對，其結(jié)果與模板的基因序列匹配度為100%。分別進行HindⅢ和BglⅡ雙酶切后，將融合片段lip-CBD連接至質(zhì)粒pBT2-SPP-LIPXM，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，單菌落PCR驗證結(jié)果表明質(zhì)粒pBT2-SPP-LIP-CBDXM構(gòu)建成功。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到S.carnosus TM300的感受態(tài)細胞中，經(jīng)氯霉素抗性篩選和提質(zhì)粒PCR驗證，測序結(jié)果與模板基因序列的匹配度為100%，證明具有pBT2-SPP-LIP-CBD-XM表達載體S.carnosus基因工程菌株構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白的表達

肉葡萄球菌轉(zhuǎn)化子純化后lip-CBD的SDS-PAGE見圖3。

圖3 肉葡萄球菌轉(zhuǎn)化子純化后融合蛋白lip-CBD的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of lip-CBD after purification of S.carnosus transformants

由圖3可知，將樣品進行鎳柱純化后分析，試驗組均只在50 kDa左右出現(xiàn)單一條帶，而對照組則未出現(xiàn)任何條帶，進一步證明融合蛋白表達成功。

2.3 高酶活力轉(zhuǎn)化子的篩選

不同轉(zhuǎn)化子脂肪酶活力見圖4。

圖4 不同轉(zhuǎn)化子脂肪酶活力Fig.4 Lipase activity of different transformants

由圖4可知，5轉(zhuǎn)化子因為CBD結(jié)構(gòu)域蛋白的導(dǎo)入而對表面展示的脂肪酶的活力有促進作用，其余轉(zhuǎn)化子則因CBD結(jié)構(gòu)域的導(dǎo)入而對酶活力有抑制作用，但促進和抑制的作用并不明顯。將5轉(zhuǎn)化子命名為M5，該轉(zhuǎn)化子表面展示脂肪酶的酶活力高達（1 193.41±11.50）U/g濕菌體。

2.4 不同濃度溶菌酶處理M5轉(zhuǎn)化子結(jié)果

溶菌酶處理轉(zhuǎn)化子M5后的菌體脂肪酶活力見圖5。

圖5 溶菌酶處理轉(zhuǎn)化子M5后的菌體脂肪酶活力Fig.5 Bacterial lipase activity after lysozyme treatment of transformant M5

由圖5可知，與無溶菌酶處理的M5轉(zhuǎn)化子相比，用300 mg/mL的溶菌酶處理過的M5轉(zhuǎn)化子的酶活力損失巨大，僅為對照組的32%左右。進而表明溶菌酶對lip-CBD融合蛋白的表面展示影響很大，說明溶菌酶破壞肽聚糖結(jié)構(gòu)而造成表面展示的lip-CBD丟失，證明肉葡萄球菌表面展示lip-CBD成功。

2.5 轉(zhuǎn)化子M5固定化條件分析

對影響固定化吸附率的4個單因素進行分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 單因素試驗結(jié)果Fig.6 Single factor test results

由圖6可知，隨著pH值增大吸附率先上升后下降，pH10.0～11.0時，pH值對吸附率的影響不明顯。隨著時間的延長吸附率先上升后下降，固定化6 h時，吸附率最高達72%左右，可能由于達到吸附飽和后靠自然吸附的細胞會脫離纖維素基質(zhì)。當(dāng)固定化溫度為16℃時，吸附率最高。對轉(zhuǎn)速進行單因素分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速為100 r/min時纖維素基質(zhì)與細胞的結(jié)合最牢固，因此吸附率最高。

2.6 正交試驗確定固定化最佳條件

對影響吸附率的4個單因素（溫度、時間、pH值、轉(zhuǎn)速）進行四因素三水平的正交試驗，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，纖維素基質(zhì)吸附細胞的最優(yōu)條件為pH8.0、時間 6 h、溫度 16℃、轉(zhuǎn)速 100 r/min。經(jīng)驗證，在最優(yōu)條件下纖維素基質(zhì)對細胞的吸附率可達76%，高于試驗9組。

表3 正交試驗設(shè)計結(jié)果及極差分析Table 3 Orthogonal experimental design results and range analysis

續(xù)表3 正交試驗設(shè)計結(jié)果及極差分析Continue table 3 Orthogonal experimental design results and range analysis

2.7 固定化細胞穩(wěn)定性分析

固定化細胞重復(fù)使用次數(shù)的分析結(jié)果見圖7。

圖7 固定化細胞重復(fù)使用次數(shù)的研究Fig.7 Exploration of the number of repeated uses of immobilized cells

如圖7所示，固定到微晶纖維素上的細胞在連續(xù)使用10次后酶活力雖然有所下降，但是仍然能夠保持原始酶活力的60%左右。可見利用微晶纖維素固定化全細胞酶的效果較好，重復(fù)使用率也相對較高。

2.8 全細胞固定脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)分析

轉(zhuǎn)化子固定化的酶學(xué)性質(zhì)研究見圖8。

由圖8可知，將最高酶活力定義為100%，與游離菌相比，全細胞酶固定化后其脂肪酶的最適溫度可達到45℃，比游離細胞的脂肪酶更能夠耐受高溫，并且在40℃保溫3 h后仍能保留80%左右的酶活力，溫度穩(wěn)定性較好；而最適pH值則由10變?yōu)?，因為在pH值大于9的緩沖液里，部分纖維素結(jié)合域被堿性環(huán)境破壞，因此pH值大于9的酶活力明顯下降，但其在pH8～9之間穩(wěn)定性較好，處理3 h后仍能保留70%左右的酶活力。

3 結(jié)論

本研究利用食品級的肉葡萄球菌為宿主，將脂肪酶和纖維素結(jié)合域共同錨定于細胞壁表面；利用纖維素結(jié)合域與纖維素基質(zhì)的特異性結(jié)合以獲得全細胞固定化脂肪酶，提高脂肪酶的重復(fù)利用率。結(jié)果表明：在最優(yōu)的固定化條件（16 ℃、100 r/min、pH8.0、6 h）下，細胞對纖維素基質(zhì)的吸附率可達76%，且固定化全細胞酶在連續(xù)使用10次后酶活力仍然保留60%左右，固定化后的全細胞脂肪酶更能夠耐受更高溫度，pH值和溫度的穩(wěn)定性也較好。本研究可明顯提高脂肪酶在食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域的重復(fù)利用率，從而降低生物轉(zhuǎn)化的成本。