劉正浩，祁珊珊，鄭紅星，張國(guó)泰，王澤旭，雷佳蕾，張志健

（陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000）

糖尿病是一種代謝性疾病，其發(fā)病原因多樣且具有慢性高血糖的特征[1]。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟指出，2011年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)3.7億，其中80%在發(fā)展中國(guó)家，估計(jì)到2030年全球?qū)⒂薪?.5億糖尿病患者[2]。肝損傷是糖尿病患者常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一[3-4]，研究表明，終末期的糖尿病患者由于肝病所導(dǎo)致的死亡人數(shù)遠(yuǎn)高于心血管疾病[5]。肝臟是人體最大的解毒器官且是最容易受損的器官之一[6]，是糖代謝的關(guān)鍵器官，糖尿病引起的高血糖如果超出了肝臟的清除能力范圍，就會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷并產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基，使肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)從而引起細(xì)胞炎癥因子的異常分泌，這是糖尿病導(dǎo)致肝損傷的主要機(jī)制[7]。目前臨床治療手段主要是針對(duì)糖尿病本身，并沒(méi)有針對(duì)糖尿病所引發(fā)肝病的具體治療方法。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）作為一種主要的活性成分分布于魔芋的塊莖中并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和生物等領(lǐng)域[8]。KGM作為一種可溶性膳食纖維，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予它許多優(yōu)良特性，在食品應(yīng)用領(lǐng)域，KGM具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、降脂減肥、抗炎等多種保健功能[9]。但KGM存在分子量大、黏度大、溶解度小、溶解速度慢等問(wèn)題，限制了其在食品中的應(yīng)用[10]。通過(guò)將KGM降解，得到分子量較小的魔芋葡甘低聚糖（konjac manno-oligosaccharides，KOGM），KOGM是一種功能性低聚糖，具有提高機(jī)體抗氧化的能力以及降血脂、護(hù)肝、排毒與增強(qiáng)免疫功能的作用[11]。

目前尚無(wú)對(duì)魔芋葡甘聚糖和低聚糖復(fù)合材料功能性的研究，而鑒于魔芋葡甘聚糖和低聚糖均具有一定的保健功能，本課題組開發(fā)了一種魔芋精粉多酶酶解技術(shù)，對(duì)魔芋精粉進(jìn)行適度酶解，使酶解物中同時(shí)含有適量速溶性葡甘聚糖和低聚糖，以便能生產(chǎn)出一種同時(shí)具有魔芋葡甘聚糖和低聚糖保健功能的復(fù)合性保健食品材料，同時(shí)克服魔芋精粉溶解速度過(guò)慢的缺陷。對(duì)該魔芋精粉酶解物的成分分析結(jié)果表明，該魔芋精粉酶解物中含有54.61%低聚糖，31.37%速溶性多糖和12.55%單糖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該魔芋精粉酶解物同時(shí)具有降脂減肥、降血糖的功能，并對(duì)糖尿病引起的肝損傷和胰腺的損傷具有修復(fù)的功效。本文著重對(duì)其中的降血糖和對(duì)糖尿病大鼠的肝保護(hù)作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為魔芋精粉酶解物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考，進(jìn)一步開發(fā)新型魔芋功能食品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉酶解物：陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院黑色有機(jī)食品研究中心制備；8周齡SPF級(jí)雌性大鼠（體重220 g～260 g）：成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：阿拉丁試劑有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉：上海試劑一廠；鹽酸二甲雙胍（批號(hào)：H20052118）：山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司；二甲苯、三氯甲烷、異丙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；石蠟、蘇木精-伊紅染液：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；中性樹膠：中國(guó)上海標(biāo)本模型廠；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；Trizol試劑：美國(guó)SIGMAALDRICH公司；Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒：中國(guó)TaKaRa公司；β-actin qPCR引物：西安熱默爾生物技術(shù)公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）引物：通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司；活化B細(xì)胞κ輕鏈增強(qiáng)子的核因子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）qPCR 引物：奧科鼎盛生物有限公司。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GA-3型血糖儀及試紙：三諾生物傳感股份有限公司；RM23335CWEU型石蠟切片機(jī)：德國(guó)Leica有限公司；BPH-9162精密恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KD-T電腦生物組織攤烤片機(jī)：科迪儀器設(shè)備有限公司；Motic BA400光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯儀器有限公司；THERMO-GO酶標(biāo)儀：日本日立公司；TDL-5C低速毫氏大容量離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；ETC811基因擴(kuò)增儀：東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；ABI QuantStudio 1實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建模、給藥及取材

適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周后，單次注射STZ（45 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，對(duì)照組大鼠注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1周后測(cè)定空腹血糖，挑選血糖值≥16.7 mmol/L[12]的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組及魔芋精粉酶解物低、中、高劑量組，10只/組。

建模成功后，分別給予魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠0.625、1.250、2.500 g/（kg·d）魔芋精粉酶解物[13]，給予二甲雙胍組大鼠0.140 g/（kg·d）二甲雙胍，給予對(duì)照組大鼠和模型組大鼠等體積生理鹽水。連續(xù)給藥6周，在每周末禁食12 h，不禁水，測(cè)量每組大鼠的體質(zhì)量并測(cè)量其空腹血糖水平。

給藥6周后，禁食12 h，不禁水，頸椎脫臼處死大鼠，眼球取血。將采集的血液置于4℃靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，置于-80℃儲(chǔ)存。將部分肝臟組織包裹在錫箔中并置于-80℃。用組織固定劑固定肝組織用于病理組織蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察。

1.3.2 血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè) AST、ALT、MDA、T-SOD、GSH-Px。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)肝組織中mRNA表達(dá)

采用Trizol法提取大鼠肝組織總RNA，按照Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)cDNA。以鼠β-actin作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB和Nrf2基因的mRNA表達(dá)水平，每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增體系：SYBR-Green Mix 5 μL，Primer F/R 0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 2.4 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 10 min；95℃變性15 s；60℃退火1 min。溶解曲線收集信號(hào)的程序：95℃預(yù)變性 15 s；60℃變性1 min；95℃退火15 s。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequence

1.3.4 肝臟組織病理學(xué)

肝組織于4%多聚甲醛中避光固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采集熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀中每孔的閾值循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值，采取F=2-ΔΔCt算法計(jì)算所檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量，使用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采取單因素方差分析及多重比較分析組間差異，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響

魔芋精粉酶解物對(duì)各組大鼠體質(zhì)量的影響見(jiàn)表2。

表2 魔芋精粉酶解物對(duì)各組大鼠體質(zhì)量的影響（n=10）Table 2 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac powder on body mass of rats in each group（n=10）

如表2所示，與對(duì)照組大鼠比較，在給藥前，模型組、二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質(zhì)量均顯著下降（P＜0.05）。與模型組大鼠比較，在給藥6周末，二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著提升（P＜0.05）。與二甲雙胍組比較，在給藥6周末，魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著上升（P＜0.05）。與給藥前比較，二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），對(duì)照組和魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著上升（P＜0.05）。綜上所述，魔芋精粉酶解物與二甲雙胍藥物相比，更具有提升糖尿病體質(zhì)量的效果。

2.2 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響

魔芋精粉酶解物對(duì)各組大鼠血糖的影響見(jiàn)表3。

表3 魔芋精粉酶解物對(duì)各組大鼠血糖的影響（n=10）Table 3 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac flour on blood glucose of rats in each group（n=10）

如表3所示，與對(duì)照組大鼠比較，在給藥前，模型組、二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠空腹血糖水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組大鼠比較，在給藥6周末，二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）。與給藥前比較，二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）。綜上所述，魔芋精粉酶解物具有降低血糖的效果。

2.3 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中ALT、AST活性的影響

魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中AST、ALT活性的影響見(jiàn)表4。

如表4所示，與對(duì)照組大鼠比較，模型組、二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠血清中ALT、AST水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組大鼠比較，二甲雙胍組和魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠ALT水平顯著下降（P＜0.05），魔芋精粉酶解物低、中劑量組AST水平顯著下降（P＜0.05）。與二甲雙胍組大鼠比較，魔芋精粉酶解物低、中劑量組AST水平顯著下降（P＜0.05）。與魔芋精粉酶解物低劑量組比較，中劑量組大鼠血清中AST水平顯著下降（P＜0.05），高劑量組大鼠血清中AST水平顯著升高（P＜0.05）。與魔芋精粉酶解物中劑量組大鼠比較，高劑量組大鼠血清中AST水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物低、中和高劑量與二甲雙胍一樣，可顯著降低糖尿病大鼠血清中ALT水平，并且魔芋精粉酶解物低、中劑量顯著降低糖尿病大鼠血清中AST水平。綜上所述，魔芋精粉酶解物相比二甲雙胍能更有效改善糖尿病大鼠肝損傷程度。

表4 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中AST、ALT活性的影響（n=10）Table 4 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac flour on the activities of AST and ALT in serum of diabetic rats（n=10）

2.4 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中MDA、TSOD、GSH-Px的影響

魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中MDA、TSOD、GSH-Px的影響見(jiàn)表5。

表5 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中MDA、T-SOD、GSHPx的影響（n=10）Table 5 Effects of enzymatic hydrolysates of konjac flour on MDA，T-SOD and GSH-Px in serum of diabetic rats（n=10）

續(xù)表5 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠血清中MDA、T-SOD、GSH-Px的影響（n=10）Continue table 5 Effects of enzymatic hydrolysates of konjac flour on MDA，T-SOD and GSH-Px in serum of diabetic rats（n=10）

如表5所示，與模型組大鼠比較，二甲雙胍組及魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠血清中MDA水平顯著下降（P＜0.05）；二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中劑量組大鼠血清中T-SOD水平顯著上升（P＜0.05）；二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物高劑量組大鼠血清中GSH-Px水平顯著提升（P＜0.05）。綜上所述，魔芋精粉酶解物可以改善糖尿病大鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化水平并提升抗氧化酶活性，使氧化應(yīng)激反應(yīng)得到改善。

2.5 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、Nrf2基因表達(dá)的影響

魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、Nrf2mRNA 的影響見(jiàn)表 6。

如表6所示，與模型組大鼠比較，二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠肝組織中TNF-α和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。與二甲雙胍組比較，魔芋精粉酶解物低劑量組大鼠肝組織中Nrf2mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物能顯著降低糖尿病大鼠肝組織中TNF-α和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)魔芋精粉酶解物低劑量相比二甲雙胍能維持糖尿病大鼠肝組織中Nrf2mRNA相對(duì)表達(dá)量。綜上所述，魔芋精粉酶解物能有效抑制糖尿病大鼠肝組織中炎癥因子的表達(dá)。

表6 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、Nrf2mRNA 的影響（n=10）Table 6 Effects of enzymatic hydrolysate of konjac flour on TNF-α，NF-κB and Nrf2mRNA in liver tissue of diabetic rats（n=10）

2.6 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠肝組織病理?yè)p傷的影響

魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠肝組織病理?yè)p傷的影響見(jiàn)圖1。

圖1 魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠肝組織病理?yè)p傷的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac powder on pathological damage of liver tissue in diabetic rats

如圖1所示，對(duì)照組中大鼠肝組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)沒(méi)有異常且沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，且著色不均勻并深染。二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變減輕；其中低劑量組病變最輕。結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠的肝損傷具有一定程度的改善作用。

3 討論與結(jié)論

糖尿病是目前威脅人體健康的非傳染性疾病之一，其導(dǎo)致的慢性肝損傷是常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌。因此對(duì)魔芋精粉酶解物降血糖及保肝的研究對(duì)維持人體健康有著重要意義。

糖尿病以高血糖為主要特征并伴隨有多飲、多食、多尿、消瘦等癥狀[14]。本研究結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病大鼠具有提升體質(zhì)量和良好的降血糖作用。與文獻(xiàn)報(bào)道KGM具有的降血糖作用相一致[15]，且具有更好地改善糖尿病體重減輕的效果。這可能與魔芋精粉酶解物中含有一定比例的KOGM有關(guān)[16]。

AST和ALT是臨床肝功能檢查的主要指標(biāo)，在慢性或急性肝損傷后，存在于肝細(xì)胞中的ALT和AST會(huì)滲入血液導(dǎo)致血清中的AST和ALT水平上升[17]。本研究結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物能降低糖尿病大鼠血清中的AST和ALT水平。與文獻(xiàn)報(bào)道KGM降低糖尿病大鼠血清中AST和ALT水平的結(jié)果一致[18]，說(shuō)明魔芋精粉酶解物對(duì)糖尿病引發(fā)的肝損傷具有一定的預(yù)防保護(hù)作用。

持續(xù)的高血糖會(huì)導(dǎo)致肝損傷并產(chǎn)生過(guò)量氧自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜上發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并生成大量MDA，使機(jī)體內(nèi)抗氧化酶（如GSH-Px、SOD）水平降低[19]。本研究結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物可以降低糖尿病大鼠血清中MDA含量，提高SOD、GSH-Px水平。與文獻(xiàn)報(bào)道KOGM具有的降低血清中MDA以及提高SOD、GSH-Px水平的結(jié)果相一致[20]。這也許與KOGM含量及其抗氧化性有關(guān)[21-22]。

在各類肝損傷中，炎癥因子均發(fā)揮重要作用。其中TNF-α通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞膜上的TNF-R，對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生直接的致傷作用[23-24]。本研究結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物降低糖尿病大鼠肝組織中TNF-α相對(duì)表達(dá)量從而起到護(hù)肝作用。NF-κB能精確調(diào)控炎癥因子TNF-α的表達(dá)并影響組織細(xì)胞的生理和病理過(guò)程[25-26]。本研究結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物能降低糖尿病大鼠肝組織中NF-κB的相對(duì)表達(dá)量，從而抑制下游炎癥因子TNF-α的活性進(jìn)而保護(hù)糖尿病大鼠的肝臟。同時(shí)組織病理學(xué)觀察顯示，魔芋精粉酶解物組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂和深染程度減輕，這表明魔芋精粉酶解物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病肝損傷起到了改善作用。Nrf2是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激的重要因子，其通過(guò)調(diào)節(jié)多種抗氧化酶及蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞及組織的氧化耐受能力[27-28]。本研究結(jié)果表明，魔芋精粉酶解物低劑量相比二甲雙胍能提升糖尿病大鼠肝組織中Nrf2的相對(duì)表達(dá)量，從而增強(qiáng)肝臟組織的抗氧化能力。

綜上所述，魔芋精粉酶解物可以有效改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病肝損傷，機(jī)制可能與降血糖、降低脂質(zhì)過(guò)氧化水平、提高機(jī)體清除氧自由基能力以及抗炎作用有關(guān)。這為魔芋精粉酶解物的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)，以便進(jìn)一步開發(fā)新型魔芋功能食品等。