劉正浩，祁珊珊，鄭紅星，張國泰，王澤旭，雷佳蕾，張志健

（陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000）

糖尿病是一種代謝性疾病，其發(fā)病原因多樣且具有慢性高血糖的特征[1]。國際糖尿病聯(lián)盟指出，2011年全球糖尿病患者人數已達3.7億，其中80%在發(fā)展中國家，估計到2030年全球將有近5.5億糖尿病患者[2]。肝損傷是糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥之一[3-4]，研究表明，終末期的糖尿病患者由于肝病所導致的死亡人數遠高于心血管疾病[5]。肝臟是人體最大的解毒器官且是最容易受損的器官之一[6]，是糖代謝的關鍵器官，糖尿病引起的高血糖如果超出了肝臟的清除能力范圍，就會導致肝臟損傷并產生過量的氧自由基，使肝臟發(fā)生氧化應激反應從而引起細胞炎癥因子的異常分泌，這是糖尿病導致肝損傷的主要機制[7]。目前臨床治療手段主要是針對糖尿病本身，并沒有針對糖尿病所引發(fā)肝病的具體治療方法。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）作為一種主要的活性成分分布于魔芋的塊莖中并廣泛應用于醫(yī)藥、食品和生物等領域[8]。KGM作為一種可溶性膳食纖維，其獨特的結構賦予它許多優(yōu)良特性，在食品應用領域，KGM具有增強免疫力、降血糖、降脂減肥、抗炎等多種保健功能[9]。但KGM存在分子量大、黏度大、溶解度小、溶解速度慢等問題，限制了其在食品中的應用[10]。通過將KGM降解，得到分子量較小的魔芋葡甘低聚糖（konjac manno-oligosaccharides，KOGM），KOGM是一種功能性低聚糖，具有提高機體抗氧化的能力以及降血脂、護肝、排毒與增強免疫功能的作用[11]。

目前尚無對魔芋葡甘聚糖和低聚糖復合材料功能性的研究，而鑒于魔芋葡甘聚糖和低聚糖均具有一定的保健功能，本課題組開發(fā)了一種魔芋精粉多酶酶解技術，對魔芋精粉進行適度酶解，使酶解物中同時含有適量速溶性葡甘聚糖和低聚糖，以便能生產出一種同時具有魔芋葡甘聚糖和低聚糖保健功能的復合性保健食品材料，同時克服魔芋精粉溶解速度過慢的缺陷。對該魔芋精粉酶解物的成分分析結果表明，該魔芋精粉酶解物中含有54.61%低聚糖，31.37%速溶性多糖和12.55%單糖。動物實驗結果表明，該魔芋精粉酶解物同時具有降脂減肥、降血糖的功能，并對糖尿病引起的肝損傷和胰腺的損傷具有修復的功效。本文著重對其中的降血糖和對糖尿病大鼠的肝保護作用及其機制進行研究，旨在為魔芋精粉酶解物的進一步開發(fā)利用提供參考，進一步開發(fā)新型魔芋功能食品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉酶解物：陜西理工大學生物科學與工程學院黑色有機食品研究中心制備；8周齡SPF級雌性大鼠（體重220 g～260 g）：成都達碩實驗動物有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：阿拉丁試劑有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉：上海試劑一廠；鹽酸二甲雙胍（批號：H20052118）：山東明仁福瑞達制藥股份有限公司；二甲苯、三氯甲烷、異丙醇：天津市天力化學試劑有限公司；石蠟、蘇木精-伊紅染液：北京鼎國昌盛生物技術公司；中性樹膠：中國上海標本模型廠；谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；Trizol試劑：美國SIGMAALDRICH公司；Prime Script反轉錄試劑盒：中國TaKaRa公司；β-actin qPCR引物：西安熱默爾生物技術公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）引物：通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司；活化B細胞κ輕鏈增強子的核因子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）qPCR 引物：奧科鼎盛生物有限公司。所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GA-3型血糖儀及試紙：三諾生物傳感股份有限公司；RM23335CWEU型石蠟切片機：德國Leica有限公司；BPH-9162精密恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；KD-T電腦生物組織攤烤片機：科迪儀器設備有限公司；Motic BA400光學顯微鏡：日本奧林巴斯儀器有限公司；THERMO-GO酶標儀：日本日立公司；TDL-5C低速毫氏大容量離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；ETC811基因擴增儀：東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；ABI QuantStudio 1實時熒光定量PCR儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建模、給藥及取材

適應性喂養(yǎng)大鼠1周后，單次注射STZ（45 mg/kg）建立糖尿病大鼠模型，對照組大鼠注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1周后測定空腹血糖，挑選血糖值≥16.7 mmol/L[12]的大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組及魔芋精粉酶解物低、中、高劑量組，10只/組。

建模成功后，分別給予魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠0.625、1.250、2.500 g/（kg·d）魔芋精粉酶解物[13]，給予二甲雙胍組大鼠0.140 g/（kg·d）二甲雙胍，給予對照組大鼠和模型組大鼠等體積生理鹽水。連續(xù)給藥6周，在每周末禁食12 h，不禁水，測量每組大鼠的體質量并測量其空腹血糖水平。

給藥6周后，禁食12 h，不禁水，頸椎脫臼處死大鼠，眼球取血。將采集的血液置于4℃靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，收集上層血清，置于-80℃儲存。將部分肝臟組織包裹在錫箔中并置于-80℃。用組織固定劑固定肝組織用于病理組織蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）觀察。

1.3.2 血清相關指標的檢測

按照試劑盒說明書檢測 AST、ALT、MDA、T-SOD、GSH-Px。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測肝組織中mRNA表達

采用Trizol法提取大鼠肝組織總RNA，按照Prime Script反轉錄試劑盒說明，反轉錄獲得相應cDNA。以鼠β-actin作為內參基因，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB和Nrf2基因的mRNA表達水平，每個基因設置3個重復。擴增體系：SYBR-Green Mix 5 μL，Primer F/R 0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 2.4 μL。反應程序：95 ℃預變性 10 min；95℃變性15 s；60℃退火1 min。溶解曲線收集信號的程序：95℃預變性 15 s；60℃變性1 min；95℃退火15 s。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 qPCR primer sequence

1.3.4 肝臟組織病理學

肝組織于4%多聚甲醛中避光固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理情況。

1.4 數據處理

采集熒光實時定量PCR儀中每孔的閾值循環(huán)數（cycle threshold，Ct）值，采取F=2-ΔΔCt算法計算所檢測基因的相對表達量，使用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數據處理及統(tǒng)計學分析。結果以平均值±標準差形式表示，采取單因素方差分析及多重比較分析組間差異，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠體質量的影響

魔芋精粉酶解物對各組大鼠體質量的影響見表2。

表2 魔芋精粉酶解物對各組大鼠體質量的影響（n=10）Table 2 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac powder on body mass of rats in each group（n=10）

如表2所示，與對照組大鼠比較，在給藥前，模型組、二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質量均顯著下降（P＜0.05）。與模型組大鼠比較，在給藥6周末，二甲雙胍組大鼠體質量顯著降低（P＜0.05），魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質量顯著提升（P＜0.05）。與二甲雙胍組比較，在給藥6周末，魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質量顯著上升（P＜0.05）。與給藥前比較，二甲雙胍組大鼠體質量顯著降低（P＜0.05），對照組和魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠體質量顯著上升（P＜0.05）。綜上所述，魔芋精粉酶解物與二甲雙胍藥物相比，更具有提升糖尿病體質量的效果。

2.2 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血糖的影響

魔芋精粉酶解物對各組大鼠血糖的影響見表3。

表3 魔芋精粉酶解物對各組大鼠血糖的影響（n=10）Table 3 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac flour on blood glucose of rats in each group（n=10）

如表3所示，與對照組大鼠比較，在給藥前，模型組、二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠空腹血糖水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組大鼠比較，在給藥6周末，二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）。與給藥前比較，二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠空腹血糖水平顯著降低（P＜0.05）。綜上所述，魔芋精粉酶解物具有降低血糖的效果。

2.3 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中ALT、AST活性的影響

魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中AST、ALT活性的影響見表4。

如表4所示，與對照組大鼠比較，模型組、二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠血清中ALT、AST水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組大鼠比較，二甲雙胍組和魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠ALT水平顯著下降（P＜0.05），魔芋精粉酶解物低、中劑量組AST水平顯著下降（P＜0.05）。與二甲雙胍組大鼠比較，魔芋精粉酶解物低、中劑量組AST水平顯著下降（P＜0.05）。與魔芋精粉酶解物低劑量組比較，中劑量組大鼠血清中AST水平顯著下降（P＜0.05），高劑量組大鼠血清中AST水平顯著升高（P＜0.05）。與魔芋精粉酶解物中劑量組大鼠比較，高劑量組大鼠血清中AST水平顯著升高（P＜0.05）。結果表明，魔芋精粉酶解物低、中和高劑量與二甲雙胍一樣，可顯著降低糖尿病大鼠血清中ALT水平，并且魔芋精粉酶解物低、中劑量顯著降低糖尿病大鼠血清中AST水平。綜上所述，魔芋精粉酶解物相比二甲雙胍能更有效改善糖尿病大鼠肝損傷程度。

表4 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中AST、ALT活性的影響（n=10）Table 4 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac flour on the activities of AST and ALT in serum of diabetic rats（n=10）

2.4 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中MDA、TSOD、GSH-Px的影響

魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中MDA、TSOD、GSH-Px的影響見表5。

表5 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中MDA、T-SOD、GSHPx的影響（n=10）Table 5 Effects of enzymatic hydrolysates of konjac flour on MDA，T-SOD and GSH-Px in serum of diabetic rats（n=10）

續(xù)表5 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠血清中MDA、T-SOD、GSH-Px的影響（n=10）Continue table 5 Effects of enzymatic hydrolysates of konjac flour on MDA，T-SOD and GSH-Px in serum of diabetic rats（n=10）

如表5所示，與模型組大鼠比較，二甲雙胍組及魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠血清中MDA水平顯著下降（P＜0.05）；二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中劑量組大鼠血清中T-SOD水平顯著上升（P＜0.05）；二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物高劑量組大鼠血清中GSH-Px水平顯著提升（P＜0.05）。綜上所述，魔芋精粉酶解物可以改善糖尿病大鼠的脂質過氧化水平并提升抗氧化酶活性，使氧化應激反應得到改善。

2.5 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、Nrf2基因表達的影響

魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、Nrf2mRNA 的影響見表 6。

如表6所示，與模型組大鼠比較，二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠肝組織中TNF-α和NF-κB mRNA相對表達量顯著下降（P＜0.05）。與二甲雙胍組比較，魔芋精粉酶解物低劑量組大鼠肝組織中Nrf2mRNA相對表達量顯著增加（P＜0.05）。結果表明，魔芋精粉酶解物能顯著降低糖尿病大鼠肝組織中TNF-α和NF-κB mRNA相對表達量，同時魔芋精粉酶解物低劑量相比二甲雙胍能維持糖尿病大鼠肝組織中Nrf2mRNA相對表達量。綜上所述，魔芋精粉酶解物能有效抑制糖尿病大鼠肝組織中炎癥因子的表達。

表6 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、Nrf2mRNA 的影響（n=10）Table 6 Effects of enzymatic hydrolysate of konjac flour on TNF-α，NF-κB and Nrf2mRNA in liver tissue of diabetic rats（n=10）

2.6 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠肝組織病理損傷的影響

魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠肝組織病理損傷的影響見圖1。

圖1 魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠肝組織病理損傷的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysate of konjac powder on pathological damage of liver tissue in diabetic rats

如圖1所示，對照組中大鼠肝組織的結構和形態(tài)沒有異常且沒有炎癥細胞浸潤。模型組大鼠的肝組織結構紊亂，且著色不均勻并深染。二甲雙胍組、魔芋精粉酶解物低、中和高劑量組大鼠肝組織病理形態(tài)學改變減輕；其中低劑量組病變最輕。結果表明，魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠的肝損傷具有一定程度的改善作用。

3 討論與結論

糖尿病是目前威脅人體健康的非傳染性疾病之一，其導致的慢性肝損傷是常見的并發(fā)癥，嚴重者可導致肝硬化甚至肝癌。因此對魔芋精粉酶解物降血糖及保肝的研究對維持人體健康有著重要意義。

糖尿病以高血糖為主要特征并伴隨有多飲、多食、多尿、消瘦等癥狀[14]。本研究結果表明，魔芋精粉酶解物對糖尿病大鼠具有提升體質量和良好的降血糖作用。與文獻報道KGM具有的降血糖作用相一致[15]，且具有更好地改善糖尿病體重減輕的效果。這可能與魔芋精粉酶解物中含有一定比例的KOGM有關[16]。

AST和ALT是臨床肝功能檢查的主要指標，在慢性或急性肝損傷后，存在于肝細胞中的ALT和AST會滲入血液導致血清中的AST和ALT水平上升[17]。本研究結果表明，魔芋精粉酶解物能降低糖尿病大鼠血清中的AST和ALT水平。與文獻報道KGM降低糖尿病大鼠血清中AST和ALT水平的結果一致[18]，說明魔芋精粉酶解物對糖尿病引發(fā)的肝損傷具有一定的預防保護作用。

持續(xù)的高血糖會導致肝損傷并產生過量氧自由基，導致肝細胞膜上發(fā)生脂質過氧化反應并生成大量MDA，使機體內抗氧化酶（如GSH-Px、SOD）水平降低[19]。本研究結果表明，魔芋精粉酶解物可以降低糖尿病大鼠血清中MDA含量，提高SOD、GSH-Px水平。與文獻報道KOGM具有的降低血清中MDA以及提高SOD、GSH-Px水平的結果相一致[20]。這也許與KOGM含量及其抗氧化性有關[21-22]。

在各類肝損傷中，炎癥因子均發(fā)揮重要作用。其中TNF-α通過上調肝細胞膜上的TNF-R，對肝細胞產生直接的致傷作用[23-24]。本研究結果表明，魔芋精粉酶解物降低糖尿病大鼠肝組織中TNF-α相對表達量從而起到護肝作用。NF-κB能精確調控炎癥因子TNF-α的表達并影響組織細胞的生理和病理過程[25-26]。本研究結果表明，魔芋精粉酶解物能降低糖尿病大鼠肝組織中NF-κB的相對表達量，從而抑制下游炎癥因子TNF-α的活性進而保護糖尿病大鼠的肝臟。同時組織病理學觀察顯示，魔芋精粉酶解物組肝組織結構紊亂和深染程度減輕，這表明魔芋精粉酶解物對STZ誘導的糖尿病肝損傷起到了改善作用。Nrf2是調節(jié)機體氧化應激的重要因子，其通過調節(jié)多種抗氧化酶及蛋白的表達，從而增強細胞及組織的氧化耐受能力[27-28]。本研究結果表明，魔芋精粉酶解物低劑量相比二甲雙胍能提升糖尿病大鼠肝組織中Nrf2的相對表達量，從而增強肝臟組織的抗氧化能力。

綜上所述，魔芋精粉酶解物可以有效改善STZ誘導的糖尿病肝損傷，機制可能與降血糖、降低脂質過氧化水平、提高機體清除氧自由基能力以及抗炎作用有關。這為魔芋精粉酶解物的進一步開發(fā)利用奠定了理論基礎，以便進一步開發(fā)新型魔芋功能食品等。