江鮮雨，裴世敏

（海南大學(xué)動物科技學(xué)院，海南?？?570100）

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）是一個三維大分子網(wǎng)絡(luò)，為鄰近細(xì)胞提供生化和結(jié)構(gòu)幫助。ECM不僅能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、遷移、存活和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種生理活動，還與多種疾病的多種病理事件有關(guān)。ECM主要由糖蛋白、酶、多糖和水組成，ECM中主要存在的糖蛋白是蛋白多糖、膠原蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白等。膠原蛋白是ECM的主要組成部分，主要存在于動物的結(jié)締組織中，是一種纖維糖蛋白。膠原家族由29個（Ⅰ型膠原至ⅩⅩⅨ型膠原）不同的同三聚體或異三聚體多肽分子組成，其中Ⅰ型至Ⅲ型膠原是形成原纖維的膠原，主要負(fù)責(zé)向間質(zhì)基質(zhì)提供拉伸強(qiáng)度；Ⅳ、Ⅶ和ⅩⅩⅧ型膠原主要負(fù)責(zé)形成類似于基底膜的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMPs）家族既能夠參與正常生理過程中細(xì)胞外基質(zhì)的分解，如胚胎發(fā)育、生殖和組織重塑；也可參與疾病過程如炎癥反應(yīng)、腫瘤中血管生成[2-7]。大多數(shù)MMPs以非活性蛋白前體的形式分泌，細(xì)胞外蛋白酶將其分裂后被激活。MMP2和MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族的明膠酶類，為Ⅳ型膠原酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的明膠成分，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程[8]。許多研究證明，發(fā)生腫瘤后機(jī)體組織中MMP2和MMP9表達(dá)異常。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP9是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重要調(diào)節(jié)因子之一，MMP9的表達(dá)會促進(jìn)上皮細(xì)胞的分化和增殖[9]。MMP2在前列腺癌表達(dá)中上調(diào)，薈萃分析顯示，MMP2豐度越高，癌癥預(yù)后越差[10]。在腫瘤組織中，基質(zhì)金屬蛋白酶已被顯示為腫瘤侵襲和預(yù)后的特征性標(biāo)志[11]。但在犬乳腺癌等腫瘤疾病中，MMP2和MMP9的預(yù)后作用尚不明確。

1 MMP2和MMP9的功能

MMP2和MMP9統(tǒng)稱為明膠酶。MMP2被稱為明膠酶A，MMP9被稱為明膠酶B。明膠酶在結(jié)構(gòu)上與MMP家族中的其他蛋白酶相似，但具有一個獨特的膠原結(jié)合域。該膠原結(jié)合域由催化域N端的3個纖維連接蛋白Ⅱ型串聯(lián)重復(fù)序列組成，為明膠結(jié)合所需[12]。明膠酶通常由成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和白細(xì)胞分泌，MMP2主要由內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、單核細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分泌，而MMP9則由上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、成骨細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分泌[13]。明膠酶主要消化Ⅳ型膠原和明膠，但也能夠降解其他類型的膠原，如Ⅴ型、Ⅷ型、Ⅹ型、Ⅺ型和ⅪⅤ型膠原[13]。

MMP2分兩個階段分解膠原蛋白：第一階段中MMP2的作用類似于間質(zhì)膠原酶；第二階段中變性膠原蛋白或明膠在纖維連接蛋白樣結(jié)構(gòu)域的協(xié)助下被消化[12-13]。MMP9也主要消化明膠和Ⅳ型膠原。明膠酶可處理多種非膠原ECM蛋白質(zhì)，如纖維連接蛋白、彈性蛋白、聚集蛋白聚糖、蛋白多糖核心蛋白和巢蛋白等[14]。此外，明膠酶還負(fù)責(zé)激活其他幾種非基質(zhì)蛋白，如成纖維細(xì)胞生長因子受體1（FGFR1）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3和-5（IGF-BP-3和-5）、白細(xì)胞介素-1b（IL-1b）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子-b（TGF-b）[12]。MMP2和其他幾種MMP已被證明可蛋白水解激活TGF-β，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化不僅與ECM緊密相關(guān)，同時也被認(rèn)為是一個癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程[15]。MMP2可在蛋白酶細(xì)胞外激活，也可在細(xì)胞內(nèi)激活。MMP2被認(rèn)為參與多種途徑，包括作用于神經(jīng)系統(tǒng)以及調(diào)節(jié)血管化和轉(zhuǎn)移等。

MMP9的主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡。MMP9具有許多作用底物，如Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅹ型、Ⅺ型膠原以及蛋白聚糖的核心蛋白、明膠、彈性蛋白等，細(xì)胞因子及其受體也是MMP9作用的底物。MMP9是以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外，在體外通過有機(jī)汞制劑反應(yīng)才具有活性，在體內(nèi)則可經(jīng)一系列蛋白酶級聯(lián)激活。此膠原蛋白結(jié)構(gòu)域可被MMP3、MMP2或次氯酸裂解，而非纖維蛋白溶酶、凝血酶或者M(jìn)MP1。MMP9能夠分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物，如ECM和基底膜,既能夠參與呼吸道和肺的重建，還能夠調(diào)節(jié)其他蛋白酶及細(xì)胞因子的活性，降解α1抗胰蛋白酶，保護(hù)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性,加強(qiáng)膠原質(zhì)膠體中膠原細(xì)胞和MMP13的溶膠原活動，還能夠抑制一些中性粒細(xì)胞的趨化因子。此外，MMP9結(jié)合CD44可釋放儲存的TGF-β1，MMP9還可通過釋放血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以參與血管生成[16-17]，血管的生成有利于腫瘤的發(fā)展。

腫瘤的轉(zhuǎn)移過程依賴細(xì)胞外基質(zhì)的降解，MMP2和MMP9可加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是腫瘤侵襲的重要途徑，大部分惡性腫瘤均具有極強(qiáng)的轉(zhuǎn)移性。因此，MMP2和MMP9在腫瘤疾病中多呈現(xiàn)上調(diào)，能夠加快腫瘤的轉(zhuǎn)移。MMP2和MMP9與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、分化、侵襲、調(diào)節(jié)腫瘤血管生成及免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。

2 MMP2和MMP9作為生物標(biāo)志物

腫瘤的生物標(biāo)志物具有重要功能，生物標(biāo)志物可作為腫瘤的預(yù)測指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，如腫瘤普查、篩查，腫瘤的診斷、鑒別診斷與分期，腫瘤患者手術(shù)、化療、放療療效監(jiān)測，腫瘤復(fù)發(fā)的指標(biāo)，腫瘤的預(yù)后判斷以及尋找不知來源的轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)灶。目前，已被發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物包括血清癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺特異抗原（PSA）和絨毛膜促性腺激素（HCG）等。

MMP9不僅能夠促進(jìn)血管生成，也可增強(qiáng)血管的通透性，導(dǎo)致炎癥相關(guān)細(xì)胞因子更容易通過血管[18]。Ⅳ型膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，在被膠原酶切割后進(jìn)一步被MMP2和MMP9降解，該過程是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[12]。研究表明，多種腫瘤組織中，MMP2和MMP9的表達(dá)上調(diào)參與到腫瘤疾病進(jìn)展[19]。有研究表明，MMP9表達(dá)與胸主動脈瘤的潛在治療靶點相關(guān)[20]。抑制MMP9蛋白能夠作為腫瘤治療的靶點，一些靶向和抑制MMP9蛋白的理想先導(dǎo)化學(xué)物可應(yīng)用于透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的靶向治療[21]。MMP9表達(dá)水平升高也與胃癌密切相關(guān)[22]。因此，MMP2和MMP9被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生過程中潛在的生物標(biāo)志物，同時也作為細(xì)胞外基質(zhì)重塑的關(guān)鍵效應(yīng)物以及抗腫瘤治療的重要潛在靶點。

腫瘤能夠通過外周血的循環(huán)而發(fā)生轉(zhuǎn)移，而腫瘤組織中MMP2和MMP9可能會釋放到外周血中促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，成為血液中的腫瘤標(biāo)志物。血清中MMP2和MMP9的上調(diào)極大可能預(yù)示著腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展情況。已有研究證表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞和MMP9之間具有相關(guān)性，且二者聯(lián)合分析可作為腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)[23]。對MMP2和MMP9進(jìn)行抑制也會抑制腫瘤的發(fā)展[24]。

血液系統(tǒng)惡性腫瘤可以定義為影響血液、骨髓和淋巴結(jié)的造血細(xì)胞不受控制地增殖或擴(kuò)張[25]。世界衛(wèi)生組織登記的150多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中有3種主要類型的血液惡性腫瘤或血癌，包括白血病、淋巴瘤和黑色素瘤，均與明膠酶的活性相關(guān)[26]。MMP14和低濃度的TIMP-2負(fù)責(zé)MMP2的激活，而組織蛋白酶G、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽原、彈性蛋白酶、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和MMP（MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP10、MMP13和MMP26）等酶則負(fù)責(zé)MMP9的激活。TIMP1與血紅素蛋白酶結(jié)構(gòu)域pro-MMP-9相互作用，保護(hù)潛在的MMP9不被其他MMP或酶激活[27-28]。明膠酶的活性越高，對血液系統(tǒng)惡性腫瘤越不利。研究表明，MMP2和MMP9在實體惡性腫瘤中作用廣泛；有報道稱，MMP9的分泌與白血病細(xì)胞侵襲增加有關(guān)[29]。越來越多的研究表明，明膠酶對血液腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義。

3獸醫(yī)領(lǐng)域的液體活檢與MMP2和MMP9

在腫瘤性疾病的診斷中，腫瘤標(biāo)志物（tumor marker，TM）已經(jīng)成為腫瘤早期診斷的研究熱點之一。除了組織中的腫瘤標(biāo)志物外，血液中也可能存在腫瘤標(biāo)志物。研究表明，在犬的淋巴瘤病例中MMP9的活性形式與病例分析指標(biāo)——有絲分裂指數(shù)之間呈正相關(guān)[30]。在犬乳腺腫瘤病例中，對25例炎性乳腺癌和15例非炎性乳腺癌腫瘤進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)MMP9在犬炎性乳腺癌中的表達(dá)可能導(dǎo)致核多形性增加，但生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究[31]。

研究表明，犬貓骨肉瘤的轉(zhuǎn)移與MMP2和MMP9的水平和活性有關(guān)。大多數(shù)犬骨肉瘤中MMP9水平升高，且活性MMP2的值顯著較高[32]。MMP2和MMP9可能會促進(jìn)犬陰囊內(nèi)血管瘤的進(jìn)行性血管生成，并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，血清MMP2和MMP9的活性程度可作為預(yù)測犬陰囊內(nèi)血管瘤復(fù)發(fā)的無創(chuàng)性預(yù)后指標(biāo)；但是通過多變量分析顯示，血清MMP2和MMP9的活性程度不是獨立的預(yù)后因素[33]。血清TM需具有一定的特異性,且在不同腫瘤組織中的表達(dá)存在較大的差異，方可作為犬腫瘤性疾病的早期診斷依據(jù)，使用TM聯(lián)合檢測可顯著提高犬惡性腫瘤的檢出率[34]。綜上所述，血液中的MMP2和MMP9可作為潛在的腫瘤檢測標(biāo)志物，且血液中的TM更便于檢測，TM在犬腫瘤性疾病的診斷中具有較好的輔助診斷作用。隨著更多特異的TM不斷被發(fā)現(xiàn)以及檢測技術(shù)不斷提高，多項TM的聯(lián)合檢測將會在犬腫瘤性疾病診斷的領(lǐng)域中發(fā)揮更加重要的作用[35]。

4 結(jié)論

近年來，腫瘤性疾病的發(fā)生率逐年增高。在犬的腫瘤疾病中，乳腺腫瘤、肥大細(xì)胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤等較為常見，具有高轉(zhuǎn)移性和高致死率。晚期的腫瘤治療相對困難，找到能夠在初期診斷出腫瘤的方法有助于早期的腫瘤治療。同一腫瘤可含有多種TM，而不同腫瘤或同種腫瘤的不同組織類型可含有不同的TM，多項TM聯(lián)合檢測可彌補單項TM的不足，提高腫瘤檢出率。在動物腫瘤疾病中，MMP2和MMP9參與炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲。因此，MMP2和MMP9可能作為檢測腫瘤的標(biāo)志物應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。通常檢測腫瘤的方式是細(xì)針穿刺抽吸以及組織活檢進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物的檢測，大多數(shù)檢測方法對動物機(jī)體具有侵入性，而血液中的腫瘤標(biāo)志物可作為非侵入性的檢測方法應(yīng)用于小動物腫瘤的臨床診斷，找到血液中的腫瘤標(biāo)志物對臨床檢測腫瘤具有重大意義。