王雁 潘華

肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是選擇性累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)退行性疾病。發(fā)病機(jī)制至今仍在探討中。近年來(lái)越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究表明，神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscular junction，NMJ）損傷可見(jiàn)于疾病早期，甚至早于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性丟失。臨床上，重復(fù)神經(jīng)刺激是評(píng)價(jià)NMJ功能的主要電生理手段。對(duì)臨床擬診的ALS患者進(jìn)行重復(fù)神經(jīng)刺激檢測(cè)，部分可見(jiàn)低頻遞減現(xiàn)象。針對(duì)ALS患者早期存在NMJ受累這一現(xiàn)象，本文從基礎(chǔ)研究和臨床電生理研究?jī)蓚€(gè)角度，對(duì)ALS疾病進(jìn)展中NMJ的動(dòng)態(tài)改變和重復(fù)神經(jīng)刺激在其中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行綜述，旨在提高讀者對(duì)ALS早期出現(xiàn)NMJ損傷的認(rèn)識(shí)和對(duì)重復(fù)神經(jīng)刺激技術(shù)在ALS早期診斷中應(yīng)用的重視程度，并了解當(dāng)前以NMJ為治療靶點(diǎn)的藥物研究進(jìn)展。

1 肌萎縮側(cè)索硬化及發(fā)病起源

ALS是一種復(fù)雜的神經(jīng)變性疾病，以選擇性累及皮質(zhì)錐體細(xì)胞、錐體束、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和脊髓前角細(xì)胞為特征[1]。針對(duì)ALS的發(fā)病部位，研究者提出了多種假說(shuō)，主要有“dying forward”假說(shuō)和“dying back”假說(shuō)。其中“dying back”假說(shuō)認(rèn)為，ALS發(fā)病起源于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢或肌纖維，因NMJ結(jié)構(gòu)和功能異常而繼發(fā)運(yùn)動(dòng)軸索變性，進(jìn)而逆向誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、死亡[2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明NMJ解體是ALS的早期病理?yè)p傷之一[3]。對(duì)于“dying back”假說(shuō)，目前的支持點(diǎn)包括：①不論是在ALS患者還是動(dòng)物模型中，多項(xiàng)研究均表明疾病早期可出現(xiàn)明顯的NMJ損傷，且往往早于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性丟失[4-6]；②骨骼肌中局限性表達(dá)突變超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因足以導(dǎo)致NMJ失穩(wěn)態(tài)，并誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性死亡[7-8]；③僅對(duì)神經(jīng)元胞體采取保護(hù)措施并不能阻止NMJ的解體[9]；④即使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性被有效逆轉(zhuǎn)，NMJ處的損傷也會(huì)持續(xù)進(jìn)展，導(dǎo)致肌肉無(wú)力和萎縮[9]。1例來(lái)源于ALS患者的尸檢報(bào)告也證實(shí)NMJ損傷早于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性丟失，該患者肌電圖檢查提示上、下肢肌肉均存在失神經(jīng)改變，兩周后該患者死于意外，對(duì)其進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)，此時(shí)脊髓前角細(xì)胞及前根尚無(wú)明顯變性丟失[4]。

雖然ALS中皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累不可避免，但可達(dá)成共識(shí)的是，NMJ解體是ALS臨床癥狀出現(xiàn)和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。NMJ或?qū)⒊蔀锳LS早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期干預(yù)的有效靶點(diǎn)。

2 神經(jīng)肌肉接頭的基礎(chǔ)研究

NMJ是一種三方突觸結(jié)構(gòu)，由突觸前運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢、突觸后肌纖維及突觸末梢施萬(wàn)細(xì)胞構(gòu)成，共同參與神經(jīng)肌肉間的信號(hào)傳遞，維持NMJ的穩(wěn)定。近年來(lái)，隨著NMJ研究的不斷深入，突觸前囊泡數(shù)量減少、線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)功能紊亂、突觸后終板面積減小或碎片化、突觸末梢施萬(wàn)細(xì)胞表型改變或數(shù)量減少等被認(rèn)為是NMJ損傷的有效標(biāo)記[11-14]。

2.1 ALS患者相關(guān)研究ALS患者的肌肉活檢、電生理評(píng)估及尸檢報(bào)告均證實(shí)NMJ損傷在ALS早期進(jìn)展中扮演了重要角色。1984年BJORNSKOV等[15]發(fā)現(xiàn)ALS患者NMJ處存在失神經(jīng)損傷和終板碎片化。同年TSUJIHATA等[16]發(fā)現(xiàn)ALS患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢及終板面積減小，神經(jīng)末梢內(nèi)線(xiàn)粒體數(shù)量減少。1998年YOSHIHARA等[17]通過(guò)喉肌活檢發(fā)現(xiàn)ALS患者NMJ處存在多種病理改變，包括失神經(jīng)、突觸后膜折疊度下降、神經(jīng)不全再生等。近年來(lái)，分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NMJ處存在多種分子水平的改變，如突觸前電壓門(mén)控鈣通道亞基表達(dá)異常[18]、神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子Nogo-A表達(dá)增加[19]、乙酰膽堿受體亞單位表達(dá)異常[20]等。

2.2 ALS動(dòng)物模型研究研究者最常利用SOD1G93A小鼠模型來(lái)探索ALS中NMJ的病理改變。在小鼠出生后第7天，可見(jiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢形態(tài)圓鈍，其內(nèi)線(xiàn)粒體出現(xiàn)空泡化改變，但NMJ結(jié)構(gòu)保持完整[5]。出生后第25天，快收縮肌纖維中可見(jiàn)失神經(jīng)改變，而慢收縮肌纖維無(wú)明顯異常，此時(shí)尚未出現(xiàn)臨床表現(xiàn)。出生后第30天，快收縮肌纖維失神經(jīng)損傷明顯增多，神經(jīng)末梢內(nèi)可見(jiàn)線(xiàn)粒體數(shù)量減少、形態(tài)腫脹及乙酰膽堿囊泡數(shù)量減少[5,9]，突觸后膜折疊度降低[5]等。隨著時(shí)間進(jìn)展，可見(jiàn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中突變SOD1蛋白聚集，胞漿空泡變性，線(xiàn)粒體腫脹等。繼之出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)單位數(shù)量減少、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元廣泛丟失，臨床出現(xiàn)典型的肌肉無(wú)力和萎縮。在果蠅肌肉組織中特異性表達(dá)二肽重復(fù)蛋白，發(fā)現(xiàn)多聚甘氨酸-精氨酸蛋白的過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)NMJ結(jié)構(gòu)異常，并伴谷氨酸能神經(jīng)元的變性退化[21]。在突變TARDBP基因小鼠模型中，可見(jiàn)斑塊樣NMJ，提示TDP-43蛋白（TAR DNA binding protein 43,TDP-43）的正常功能對(duì)于NMJ形態(tài)的成熟和穩(wěn)定至關(guān)重要[22]。在TDP-43Q331K小鼠模型中可見(jiàn)NMJ處乙酰膽堿受體區(qū)域面積減少，完整NMJ的數(shù)量較健康對(duì)照組明顯減少[23]。hTDP-43ΔNLS小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠生后4周左右即可見(jiàn)明顯的NMJ失神經(jīng)損傷而運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量未見(jiàn)減少。相反，利用多西環(huán)素來(lái)抑制突變TARDBP基因可促進(jìn)肌肉神經(jīng)再支配，早期給予藥物干預(yù)或許會(huì)逆轉(zhuǎn)NMJ損傷[24]。FUSΔNLS∕ΔNLS小鼠模型中可見(jiàn) NMJ處終板面積和終板數(shù)量明顯減少，而選擇性恢復(fù)FUS基因在肌纖維細(xì)胞核中的表達(dá)，可一定程度增加終板面積[14]。hFUS+∕+小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生后第15天，腓腸肌中已有40%出現(xiàn)失神經(jīng)改變，而脊髓腰段尚無(wú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量減少。超微結(jié)構(gòu)分析提示NMJ處存在突觸囊泡丟失，突觸前膜結(jié)構(gòu)異常以及突觸前線(xiàn)粒體數(shù)量減少，而終板相對(duì)完好[13]。以上研究表明，不同基因突變介導(dǎo)的ALS中，NMJ均存在不同程度的受累，且往往早于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性丟失。

3 重復(fù)神經(jīng)刺激在ALS中的臨床應(yīng)用價(jià)值

重復(fù)神經(jīng)刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）是臨床評(píng)價(jià)NMJ功能的主要電生理手段。正常情況下，NMJ的安全系數(shù)較大，可確保每一次神經(jīng)沖動(dòng)都能激發(fā)一次肌肉收縮。而在病理情況下，NMJ傳遞受損，安全系數(shù)減小，在一連串持續(xù)刺激下，僅有最初的幾次刺激可以超過(guò)動(dòng)作電位閾值，從而表現(xiàn)為RNS時(shí)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（compound muscle action potential，CMAP）波幅下降。低頻RNS主要用于評(píng)價(jià)突觸后膜的功能，而高頻RNS主要用于評(píng)價(jià)突觸前膜的功能。臨床實(shí)踐中，可利用低頻或高頻RNS評(píng)價(jià)ALS中NMJ的功能，以發(fā)現(xiàn)早期異常，提高ALS早期診斷的敏感性。實(shí)際上，當(dāng)前已有多項(xiàng)研究表明RNS可用于早期發(fā)現(xiàn)ALS中NMJ異常。

1959年梅奧醫(yī)學(xué)中心的MULDER等[25]首次報(bào)告了一例ALS患者中可見(jiàn)RNS低頻遞減現(xiàn)象。隨后，多項(xiàng)研究相繼報(bào)道了此類(lèi)現(xiàn)象，提示ALS中NMJ傳遞受損并不少見(jiàn)。1981年研究發(fā)現(xiàn)，在快速進(jìn)展的ALS患者中進(jìn)行RNS，可見(jiàn)小指展肌的CMAP波幅顯著下降，而在緩慢進(jìn)展的ALS患者中，未見(jiàn)明顯的CMAP波幅下降，提示ALS患者RNS波幅下降與疾病活動(dòng)性相關(guān)[26]。而JAMES等[27]發(fā)現(xiàn)相較于遠(yuǎn)端的小魚(yú)際肌，近端的斜方肌在顯示NMJ損傷方面敏感性更高。隨后，有研究進(jìn)一步指出，對(duì)于上肢起病的患者，如果三角肌中未見(jiàn)RNS低頻遞減，則或許可以排除ALS的診斷[28]。斜方肌中RNS低頻遞減百分?jǐn)?shù)超過(guò)5%，對(duì)于ALS診斷的特異性可達(dá)到100%。2001年有研究對(duì)ALS患者的拇短展肌進(jìn)行低頻RNS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)低頻遞減的幅度與運(yùn)動(dòng)末端CMAP的年下降率呈顯著正相關(guān)，提示RNS低頻遞減幅度對(duì)于未來(lái)CMAP波幅的下降具有預(yù)測(cè)價(jià)值[27]。此外，相較于小指展肌，拇短展肌的RNS波幅下降更明顯，而這與ALS患者臨床常見(jiàn)的“分裂手”現(xiàn)象相一致[29]。隨后，有研究指出，ALS患者中小指展肌的RNS低頻遞減陽(yáng)性率顯著低于拇短展肌和第一骨間背側(cè)肌的陽(yáng)性率，提示NMJ傳遞障礙可能參與了ALS中常見(jiàn)的“分裂手”現(xiàn)象[30-31]。2016年有研究表明，正中神經(jīng)RNS低頻遞減或可作為ALS診斷的有效標(biāo)記物[28]。且通過(guò)ROC曲線(xiàn)分析，進(jìn)一步確定正中神經(jīng)RNS低頻遞減百分?jǐn)?shù)的cut-off值約為4.3%，而尺神經(jīng)的cut-off值約為3.2%，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于當(dāng)前使用的陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)值（10%或15%）。2021年有研究表明，相較于健康對(duì)照組，ALS患者的RNS低頻遞減比例明顯增高，且在部分ALS患者中，在肌肉出現(xiàn)失神經(jīng)電位前即可見(jiàn)到RNS低頻遞減[32]。首診發(fā)現(xiàn)RNS低頻遞減百分?jǐn)?shù)高的患者，未來(lái)疾病進(jìn)展可能更快。其研究指出低頻RNS中CMAP波幅下降可支持ALS超早期即存在NMJ損傷。

4 以NMJ為靶點(diǎn)的潛在干預(yù)措施

多項(xiàng)研究均表明單一的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保護(hù)不足以對(duì)抗該病。相反，越來(lái)越多的證據(jù)支持NMJ解體是ALS臨床癥狀出現(xiàn)和疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著對(duì)ALS中NMJ的研究進(jìn)一步加深，目前提出了多種潛在的以NMJ為靶點(diǎn)的干預(yù)措施。

HUANG等[33]指出，利用抗體來(lái)阻斷死亡受體6可有效維持NMJ的完整性并提高運(yùn)動(dòng)能力。BROS-FACER等[34]表明，每周注射抗Nogo-A抗體，可有效改善SOD1G93A小鼠的肌無(wú)力癥狀，促進(jìn)肌肉神經(jīng)再支配。HARRISON等[35]的研究表明，在尚未出現(xiàn)臨床癥狀但已有部分失神經(jīng)損傷的SOD1G93A小鼠中應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑馬賽替尼，可以減少巨噬細(xì)胞在NMJ的浸潤(rùn)，保護(hù)突觸末梢施萬(wàn)細(xì)胞并促進(jìn)神經(jīng)再支配。馬賽替尼三期臨床試驗(yàn)顯示，在應(yīng)用利魯唑的基礎(chǔ)上加用該藥，可減緩疾病進(jìn)展，提高患者的生存質(zhì)量[36]。此外，生長(zhǎng)因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子1在保護(hù)NMJ完整性方面也具有一定的作用[37]?；衔颰RVA242可能通過(guò)增加突觸前運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢的鈣離子流入來(lái)促進(jìn)乙酰膽堿的量子釋放，或可有效逆轉(zhuǎn)NMJ的病理?yè)p傷，提高NMJ的傳遞功能[38]。目前以上大部分藥物在人類(lèi)臨床試驗(yàn)中尚未取得成功，這可能與患者疾病進(jìn)展處于不同階段相關(guān)。但未來(lái)對(duì)于ALS的早診斷及早治療，尤其是以NMJ為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)將成為ALS治療的關(guān)鍵與希望。

5 總結(jié)

ALS是復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，多病因多機(jī)制參與其中。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為ALS的發(fā)病起源于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，然而近二十年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在ALS患者和動(dòng)物模型中均可觀察到NMJ結(jié)構(gòu)和功能的異常及骨骼肌代謝的改變，且往往早于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性丟失，提示NMJ解體和能量代謝異常在ALS的起病及發(fā)展中扮演了重要角色。NMJ早期受累在不同類(lèi)型的ALS中是普遍存在的，但其在疾病的發(fā)生發(fā)展中究竟扮演了怎樣重要的角色，目前還尚無(wú)肯定回答。未來(lái)需要更多的以NMJ為靶點(diǎn)的研究，這對(duì)于ALS的早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早干預(yù)都具有重要意義。