陳珂彥 綜述 張 靜 丁士剛 審校

(北京大學第三醫(yī)院消化科，北京 100191)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，2020年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計的癌癥發(fā)病率，胃癌位列全球第5位[1]。淋巴結轉移是胃癌最常見的轉移形式，早期胃癌的淋巴結轉移率為4.1%～35.8%[2～4]。隨著內(nèi)鏡技術的發(fā)展，內(nèi)鏡黏膜下剝離術(endoscopic submucosal dissection，ESD)越來越多地應用于早期胃癌患者。ESD應用的前提是無淋巴結轉移。因此，正確評估淋巴結轉移狀態(tài)十分重要。淋巴結陰性的部分患者胃癌根治術后短期內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復發(fā)，有學者認為這一現(xiàn)象和淋巴結微轉移(lymph nodes micro-metastasis，LNM)有關。HE染色中分級為pN0患者中LNM檢測陽性占10%～30%[5]。近年來，LNM對胃癌預后和治療方面的影響逐漸受到重視但仍存在爭議，本文就LNM的相關研究進展進行文獻總結，探討LNM的發(fā)現(xiàn)對早期胃癌治療策略的影響。

1 胃癌LNM概述

根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Cancer Control，AJCC)第8版[6]惡性腫瘤分期，孤立腫瘤細胞(isolated tumor cells，ITCs)和 LNM均屬于隱匿腫瘤細胞(occult tumor cells, OTCs)。OTCs即為常規(guī)HE染色難以發(fā)現(xiàn)的腫瘤細胞或細胞簇。ITC定義為最大直徑<0.2 mm的腫瘤細胞或細胞簇，LNM定義為腫瘤細胞簇最大直徑超過0.2 mm或腫瘤細胞數(shù)不少于200個，并且最大直徑不超過2 mm者。AJCC第8版惡性腫瘤分期延續(xù)了第7版的觀點，即組織學上證實ITC記為pN0(i+)，LNM記為pN1(mi)，若組織學檢查為陰性而逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測陽性，則記為pN0(mol+)[7]。

2 LNM的常見檢測方法

2.1 連續(xù)切片法

目前,臨床上常用的檢測淋巴結轉移狀態(tài)的方法是將淋巴結沿縱軸切開進行常規(guī)HE染色，這種檢測可能會遺漏13.1%～20%的LNM[2,8]。連續(xù)切片法為最早嘗試提高LNM檢出率的檢測方法，隨著送檢切片寬度減小，檢出率也隨之提高[9]。此種方法對設備要求較低，但是單獨使用此法費時費力，檢測效率低下。因此，研究者多選擇將連續(xù)切片法與免疫組化(immunohistochemical staining，IHC)等方法聯(lián)合使用，在提高檢測率的同時兼顧檢測的經(jīng)濟性。

2.2 IHC

由于IHC相比HE染色法能更靈敏地檢測出LNM[10～12]，目前已成為研究胃癌LNM的一種重要檢測手法，常用的標志物有癌胚抗原(CEA)，細胞角蛋白CK(AE1/AE3)、CK(CAM5.2)、CK-19等。IHC最突出的優(yōu)點就是在保證一定靈敏度的同時兼顧經(jīng)濟性，對實驗設備要求不高，可以在鏡下直觀地評估腫瘤細胞或腫瘤細胞簇的形態(tài)和直徑，但與RT-PCR相比，靈敏度稍低，且由于IHC是利用抗原抗體反應進行檢測，結果易受到實驗操作和實驗條件的影響。

2.3 RT-PCR

與IHC相比，將RT-PCR用于LNM狀態(tài)的檢測使檢測靈敏度大大提高，且所需樣本更少，即使107個細胞中僅有1個腫瘤細胞，使用RT-PCR也能將其檢出[9]。由于尚未發(fā)現(xiàn)胃腸道惡性腫瘤特異的基因，目前主要采用在多個惡性腫瘤中均表達的CEA和CK這幾種基因進行LNM檢測。雖然不同研究得出的LNM檢出率存在差異，但使用RT-PCR的檢出率多為27%以上[13]。雖然RT-PCR有更高的靈敏度，但結果也可能出現(xiàn)假陽性和假陰性，常見的假陽性原因主要是基因的不正確轉錄，生物標本污染，操作水平受限等，而標記基因的異質(zhì)表達可能造成假陰性。RT-PCR對設備和實驗人員的技術要求高于前2種檢測方法，通過這種方法無法鏡下觀察到陽性細胞，因此，無法測量引起RT-PCR陽性反應的細胞的大小或評估其形態(tài)，無法判斷是LNM還是ITC，ITC在胃癌患者預后上的意義尚不明確，因此，可能影響醫(yī)師對治療策略的制定。盡管RT-PCR法有上述缺點，但高靈敏度依然使其作為研究上使用較廣的檢測LNM的技術手段之一。

2.4 一步核酸擴增法(one step nucleic acid amplification，OSNA)

OSNA最早是由Tsujimoto等[14]提出用于乳腺癌淋巴結轉移狀態(tài)的一種術中檢測手段，是基于逆轉錄環(huán)介導恒溫核酸擴增技術進行的全自動半定量核酸測定方法，通過檢測CK19 mRNA表達來判定淋巴結轉移狀態(tài)。Shimada等[15]報道以CK19 mRNA 250 拷貝數(shù)/μl為截斷值時，OSNA和術后病理切片一致率為0.97，靈敏度為0.636，特異度為0.988。OSNA檢測陰性但病理檢測陽性的標本多由于CK19 mRNA在標本上分布偏倚以及在某些類型胃癌中低表達所致，meta分析顯示OSNA的診斷比值比(diagnostic odds ration，DOR)可達275.14[16]。以上研究均證實OSNA可用于胃癌淋巴結轉移的術中檢測。

OSNA具有靈敏度高，檢測時間短的優(yōu)勢，可在30 min完成1枚淋巴結的檢測，50 min內(nèi)完成4枚淋巴結的檢測，世界范圍內(nèi)已有290家醫(yī)院采用OSNA作為術中淋巴結轉移狀態(tài)檢測的手段[15,17]。OSNA的結果受限于CK19 mRNA的表達。在某些分化較差的胃癌如印戒細胞癌，Lauren分型混合型等胃癌中CK19mRNA低表達，可能出現(xiàn)假陰性，因此，對于采用OSNA檢測的患者建議術前進行CK19 mRNA表達的評估，CK19mRNA高表達的患者對于此種檢測手段獲益更大[15,18]。

3 LNM檢測的臨床意義

3.1 影響胃癌TNM分期

雖然在第7版AJCC腫瘤分期已將LNM定義為pN1(mi)，提出LNM應當被納入TNM分期進行考慮，但目前是否將LNM納入TNM分期，以及以何種標準納入尚無明確定論。根據(jù)第8版AJCC的TNM分期，當胃癌淋巴結轉移超過15枚均屬于N3b，在這種情況下，新發(fā)現(xiàn)的LNM并不會對分期再造成影響。但當淋巴結轉移不超過15枚時，新發(fā)現(xiàn)的LNM可能會造成腫瘤分期的上調(diào)。Santos等[5]對51例胃癌切除的淋巴結采用AE1和AE3標記進行免疫熒光染色，重新分期，29.4%(15/51)的患者N分期以及23.5%(12/51)患者的腫瘤分期發(fā)生改變；原分級為pN0期的患者，有19.2%(5/26)的患者N分期及腫瘤分期均發(fā)生改變；原分級為pN1或者更高級別的患者中，40.0%(10/25)的患者發(fā)生N分期改變，28.0%(7/25)的患者腫瘤分期發(fā)生改變。有LNM的患者臨床預后更差，與不存在LNM的同一分期患者相比復發(fā)率更高、總體生存率更低[19,20]。TNM作為指導疾病治療以及提示患者預后的重要參考，應盡早統(tǒng)一標準，明確是否需要將LNM納入TNM分期。

3.2 LNM與臨床病理特征之間的關系

自LNM的概念被提出之后，各個實體瘤領域進行大量研究來探究LNM與哪些臨床病理特征相關。Li等[21]回顧172例根治性胃切除術聯(lián)合D2淋巴結清掃被分級為pN0的患者，單因素分析顯示LNM與腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴管浸潤、Lauren分型為彌漫性均顯著相關，多因素分析顯示分化程度差(OR=1.266，95%CI：4.274～37.037，P=0.013)、淋巴管浸潤(OR=2.178, 95%CI：1.635～6.327，P=0.009)、浸潤深度大(OR=3.755，95%CI：1.716～8.218，P=0.004)以及TNM分期較差(OR=3:152，95%CI：1.547～7.589，P=0.002)為LNM發(fā)生的獨立危險因素。Lou等[19]研究106例T1N0早期胃癌，其中22例(20.8%)檢出LNM，進一步分析顯示，LNM的發(fā)生與浸潤深度(P=0.039)及淋巴管浸潤(P=0.009)顯著相關，且14例黏膜內(nèi)癌切除的淋巴結均未發(fā)現(xiàn)LNM。葉嬋娟等[12]對73例pN0胃癌進行研究，結果顯示LNM的發(fā)生與分化類型(P<0.001)和淋巴管浸潤(P=0.044)顯著相關。目前，淋巴管浸潤與LNM的發(fā)生相關已得到共識，其他LNM的危險因素尚無統(tǒng)一定論。因此，Zeng等[22]建議對于進展期胃癌，且出現(xiàn)一些提示預后不好的臨床特征如血管淋巴管浸潤、分化程度差的情況時，應增加送檢淋巴結的切片數(shù)并使用IHC對淋巴結狀態(tài)進行檢測。

3.3 LNM對預后的影響

LNM對胃癌患者預后影響方面的研究結果各異。Zeng等[22]對2014年之前開展的12項隊列研究進行meta分析，與LNM陰性患者相比，LNM陽性患者復發(fā)率更高，5年生存率更低。葉嬋娟等[12]對2010年1月～2015年1月收治的pN0期胃癌進行隨訪，LNM組生存率顯著低于OTC陰性組，多因素回歸分析顯示LNM是影響患者生存率的獨立因素(RR=2.37，95%CI：1.47～3.97，P=0.001)。Yamamoto等[23]報道以淋巴結轉移細胞簇直徑1500 μm作為截斷值，細胞簇直徑<1500 μm的LNM者比>1500 μm的LNM者預后更好，5年生存率分別為0.768、0.528(P=0.012)。Morgagni等[24]在300例中觀察到30例LNM(10%)，但LNM陽性組與陰性組總生存期差異無顯著性(log-rankχ2=0.08，P=0.7797)。我們認為結論差異較大的原因考慮可能有以下幾點：①納入的患者來自不同種族、不同年齡，基礎情況、機體免疫狀態(tài)相差較大，且使用的治療策略也有所不同，患者具有較大的異質(zhì)性。②目前，關于術中切除以及送檢淋巴結的數(shù)量尚無統(tǒng)一標準，可能存在分期偏倚，第8版AJCC建議無論D1淋巴結清掃還是D2淋巴結清掃，術中切除并送檢超過15枚淋巴結能增加分期的準確性，減少分期偏倚，但目前我國許多醫(yī)療中心送檢的淋巴結數(shù)仍難以達到這一標準。

3.4 LNM對治療策略的影響

3.4.1 LNM對淋巴結清掃范圍的影響 胃切除術聯(lián)合擴大淋巴結清掃術被認為是進展期胃癌以及部分發(fā)生淋巴結轉移的早期胃癌患者治療的標準術式，歐美學者認為與D1淋巴結清掃相比，D2淋巴結清掃對預后無顯著改善，但亞洲范圍內(nèi)的研究仍建議D2淋巴結清掃作為胃癌淋巴結清掃的標準術式[25]。隨著對患者術后生活質(zhì)量的重視程度提高，如何決定合適的淋巴結清掃的范圍，避免過度清掃成為一個新的研究熱點。不同于其他腫瘤單個前哨淋巴結活檢，胃癌前哨淋巴結引流區(qū)切除(sentinel basin dissection, SBD)將胃的淋巴結區(qū)域沿胃主要動脈劃分成5個區(qū)域，分別為胃左動脈(No.1,No.7,右側2/3的No.3)，胃右動脈(No.5, No.8a, 左側1/3的No.3)，胃網(wǎng)膜右動脈(No.4d, No.6)，胃網(wǎng)膜左動脈(No.4sa, No.4sb)和胃后動脈(No.11)[8]。采用SBD代替?zhèn)鹘y(tǒng)前哨淋巴結活檢顯著提高跳躍性轉移以及LNM的檢出率[8]?；赟BD活檢進行的手術稱為前哨淋巴結導航手術(sentinel node navigation surgery，SNNS)。韓國近年開展的一項多中心Ⅲ期臨床隨機對照研究(SENORITA)的短期結果顯示，在早期胃癌患者中SNNS的手術安全性與胃癌根治術無顯著差異，遠期腫瘤安全性的評估仍需等待后續(xù)研究結果的公布[8,26,27]。

目前,許多研究表明LNM可能作為一個不良預后因素導致胃癌的復發(fā)率增加。Jo等[28]通過對淋巴結中出現(xiàn)的微轉移進行Ki-67染色，LNM的增殖活性雖顯著低于淋巴結轉移病灶(26.7% vs. 40.5%，P=0.004)，但仍高于其他腫瘤如乳腺癌、黑色素瘤中LNM的增殖活性，基于此提出對于在前哨淋巴結中發(fā)現(xiàn)的LNM應予以清除，并且需要D1+β或更大范圍的淋巴結清掃。

3.4.2 LNM對內(nèi)鏡下治療的影響 由于與傳統(tǒng)手術相比具有更少的術后并發(fā)癥以及更高的術后生活質(zhì)量等優(yōu)勢，近年來內(nèi)鏡下治療逐漸成為治療早期胃癌的主流方式之一，但無淋巴結轉移是施行內(nèi)鏡下治療的前提[29]。如何術前評估淋巴結轉移情況，已有許多學者利用術前胃鏡下組織活檢中的標志物以及血清標志物來對淋巴結轉移情況進行預測[30～34]，針對LNM預測的研究則較少。Eom等[35]對71例胃癌的原發(fā)腫瘤組織及LNM標本進行檢測，除去無法評估的標本后，在原發(fā)腫瘤組織中鈣黏蛋白E與上皮細胞黏附分子(EpCAM)的表達分別為97.1%(67/69)、100%(65/65)，在原發(fā)腫瘤組織和轉移性淋巴結雙陽性率分別為100%(46/46)、98.1%(51/52)，他們認為鈣黏蛋白E、EpCAM是早期胃癌患者LNM的潛在分子標志物，但是否存在更有預測價值的標志物以及如何綜合應用已有標志物進行LNM的預測仍需進一步研究。盡管LNM對預后的影響尚無定論，但若將LNM作為一個潛在的轉移，對于可能出現(xiàn)LNM的患者采用內(nèi)鏡下治療可能帶來更高的復發(fā)率，影響遠期生存。因此，能確定LNM發(fā)生的危險因素以及發(fā)現(xiàn)預測價值更高的血清或者活檢組織標志物對安全地實施內(nèi)鏡下治療至關重要。

4 小結與展望

LNM這一概念的提出至今已10余年，10余年間檢測手段不斷更新，也已有部分醫(yī)院開展LNM快速術中檢測，將LNM作為病理評估的一部分，但這一做法尚未得到推廣。目前，針對LNM的研究仍主要局限于回顧性研究，關于機制方面研究較少。LNM對預后的影響目前學界尚無統(tǒng)一定論。隨著LNM的生物學特性、發(fā)生發(fā)展機制以及特異的分子標志物的進一步研究，將有望為胃癌患者提供個體化，更合適的綜合治療，獲得更好的預后。