羅瑞靜, 劉 杰, 彭 勇, 王英杰, 武宗琴, 姜珠倩, 李 淑

(上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 皮膚科, 上海, 201899)

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種機體免疫失衡導(dǎo)致的慢性炎癥性皮膚病[1], 中醫(yī)學(xué)稱其為“四彎風(fēng)”。研究[2]證實，腸道菌群可以通過免疫、代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌途徑參與AD的發(fā)病，而中藥則可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來治療AD[3]。本課題組前期研究[4]顯示，健脾祛風(fēng)湯治療脾虛型AD總有效率為82.11%。本研究探討健脾祛風(fēng)湯對AD患者腸道菌群的影響，以闡明其可能治療機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共納入57例志愿者。將2015年4月—2017年4月在上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院皮膚科門診就診的30例AD 患者納入治療組(治療前簡稱TB組，治療后簡稱TA組)，其中男18例，女12例; 平均年齡8.6歲。將27例健康兒童納入健康對照組(簡稱N組)，其中男17例，女10例，平均年齡8.0歲，均來自上海市嘉定區(qū)城中路小學(xué)和普通小學(xué)。2組入選者年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，且研究對象及家長或監(jiān)護人均知情同意。

治療組納入標準: ① 符合WILLIAMS HC[5]診斷AD 標準者; ② 6～12 歲兒童; ③參照歐洲AD特別工作組確定的SCORAD系統(tǒng)[6], 病情嚴重度分級屬輕、中度者; ④ 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(2002年)》[7], 符合濕瘡脾虛證者(主癥: 皮膚瘙癢，皮損以丘疹或丘皰疹為主，皮膚色暗淡或有鱗屑，少許滲出；次癥: 食少乏力，腹脹便溏，小便清長或微黃); ⑤ 病程1年以上，每年緩解期≤3個月者; ⑥ 同意服用中藥并簽署知情同意書(監(jiān)護人簽字)者。排除標準: ① 患有其他皮膚疾病者; ② 近2 個月內(nèi)服過糖皮質(zhì)激素或近2 周內(nèi)外用過此類藥品者; ③ 近2個月內(nèi)系統(tǒng)使用其他有效治療藥物者; ④ 在參加或入選前4周內(nèi)，曾參加過其他藥物臨床試驗者; ⑤ 心、肝、腎等臟器嚴重異常者; ⑥ 精神疾病、殘疾、智力障礙者; ⑦ 近2周患腹瀉等腸道疾病或使用抗生素者; ⑧ 近2周服用含益生菌等微生物制劑者; ⑨ 對已知試驗藥物過敏者; ⑩ 有可能無法完成本研究全過程者。健康對照組納入標準: 6～12歲健康兒童。排除標準: ① 近2周患腹瀉等腸道疾病或使用抗生素者; ② 近2周服用含益生菌等微生物制劑者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法: 治療組口服健脾祛風(fēng)湯(炒白術(shù)15 g、白茯苓10 g、荷葉10 g、炒白芍10 g、升麻6 g、炒枳殼6 g、荊芥10 g、防風(fēng)10 g、徐長卿12 g、白鮮皮15 g、黃芩12 g、苦參10 g、地黃10 g、甘草6 g), 水煎內(nèi)服，1劑/d, 100 mL/次, 2次/d, 由本院中藥煎藥室制備; 同時外涂尿素乳膏(浙江康恩貝制藥股份有限公司，國藥準字H33022524), 使用時先用溫水清洗患處，輕輕擦干后，將藥物均勻涂于患處, 2次/d; 皮損滲出較重者，予生理鹽水濕敷患處。共計觀察6周。

1.2.2 樣本采集: 治療組在治療前后采集糞便，健康對照組僅在納入研究時采集糞便。將糞便放在糞便收集盒中，要求避免尿液、灰塵等污染，選取中段無污染的部分，糞便標本量>1 g。標本采集后標記姓名，并進行編號，標記后存儲于-20 ℃冰箱，干冰運送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行檢測。

1.2.3 主要儀器及試劑: IlluminaMiseq型MISEQ測序儀購自美國Illumina公司; DNA抽提試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司; TruSeqTM DNA SamplePrepKit型Illumina MiSeq platform購自美國Illumina公司。

1.2.4 DNA提取及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增: 根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進行總DNA抽提, DNA 濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量; 用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對16S rDNA V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增。

1.2.5 Illumina MiSeq測序及分析: 應(yīng)用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司Illumina MiSeq測序平臺對研究對象糞便細菌的16SrRNA 基因V3～V4區(qū)進行高通量測序及分析。

1.3 觀察指標

主要療效評價指標: 采用歐洲特應(yīng)性皮炎研究組(ETFAD)提出的評分標準(SCORAD評分)進行評估。

臨床療效評價標準: 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中的療效標準進行評定。有效率=(治療前SCORAD分值-治療后SCORAD分值)/治療前SCORAD分值×100%。痊愈: 皮損全部消退，瘙癢癥狀消失，有效率≥90%; 顯效: 皮損大部分消退，瘙癢明顯減輕，有效率為60%～<90%; 進步: 皮損部分消退，瘙癢癥狀有所改善，有效率為20%～<60%; 無效: 皮損消退不明顯，瘙癢未見減輕，或臨床癥狀惡化，有效率<20%?？傆行?(痊愈+顯效+進步)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P=0.05為檢驗標準。計量資料采用t檢驗，若不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗。借助I-Sanger生物信息云平臺(http: //www.i-sanger.com), 應(yīng)用R的stats包和python的scipy包進行分析。選擇2組豐度排名前15的門、屬、種分別比較物種差異，采用Wilcoxon秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 通過計算物種之間的斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)，構(gòu)建物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，借助Networkx網(wǎng)絡(luò)分析工具包進行單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié) 果

2.1 中藥干預(yù)臨床療效及SCORAD評分結(jié)果

治療組共納入30例符合標準的患者，其中痊愈0例、顯效18例、進步11例、無效1例，總有效率為96.67%。治療后SCORAD評分(18.02±1.63)分，低于治療前的(42.23±1.42)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.2 樣本信息統(tǒng)計

治療組共采集60個糞便樣本，其中8個樣本經(jīng)檢測不合格予以剔除，最終保留52個合格樣本; 健康對照組共采集27個合格樣本; 2組總計采集79個合格糞便樣本。對樣本物種注釋分類后, 79個樣本共獲得1個域, 20個門, 36個綱, 60個目, 98個科, 262個屬, 472個種, 643個可操作分類單元(OTU)。

2.3 物種組成分析

通過在門、屬水平物種組成分析發(fā)現(xiàn): TB組、TA組與N組腸道菌群組成主要為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)共5門，各組間相同門、屬水平物種豐度比較存在一定差異，主要表現(xiàn)為TA組較TB組厚壁菌門、屬水平物種豐度升高，以及擬桿菌門、屬水平物種豐度降低，提示健脾祛風(fēng)湯治療后腸道菌群豐度發(fā)生變化，見圖1。

A: 3組門水平物種組成圖; B: 3組屬水平物種組成圖。

2.4 治療前后門、屬、種水平重要物種豐度比較

2.4.1 治療前后門水平物種豐度比較: 治療后厚壁菌門(Firmicutes)呈升高趨勢，擬桿菌門(Bacteroidetes)呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); 與TB組比較，綠屈撓菌門(Chloroflexi)治療后豐度增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1、圖2。

2.4.2 治療前后屬水平物種豐度比較: 治療后厚壁菌門下Faecalibacterium、[Eubacterium]_rectale_group、Blautia呈升高趨勢。與TB組比較,Blautia豐度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 擬桿菌門下Bacteroides呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表2、圖3。

表1 治療前后門水平物種豐度比較 %

2.4.3 治療前后種水平物種豐度比較: 厚壁菌門下unclassified_g_Faecalibacterium、unclassified_g_[Eubacterium]_rectale_group、Ruminococcus_sp._5_1_39BFAA呈升高趨勢。排名靠后物種Dialister_invisus_DSM_15470呈降低趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01); 擬桿菌門下Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482、Bacteroides_xylanisolvens_g_Bacteroides、Bacteroides_uniformis呈降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，致病菌unclassified_g_Klebsiella治療后豐度降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4、表3。

2.5 物種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)屬性圖及單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

通過屬、種水平網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)屬性圖可以看出: AD患者腸道菌群不同屬、種之間具有顯著相互作用(綠色連線表示正相關(guān)，紅色連線表示負相關(guān)，連線的粗細代表相關(guān)性系數(shù)的大小)，見圖5A、圖6A。

表2 治療前后屬水平物種豐度比較 %

表3 治療前后種水平物種豐度比較 %

物種相關(guān)性Heatmap圖分析結(jié)果顯示: 在屬水平，重要物種厚壁菌門下Blautia與擬桿菌門下Bacteroides呈負相關(guān)(R=-0.41,P<0.01), 見圖5B。在種水平，重要物種擬桿菌門下Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482與Bacteroides_xylanisolvens_g_Bacteroides呈正相關(guān)(R=0.70,P<0.001); 擬桿菌門下Bacteroides_uniformis與Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482呈正相關(guān)(R=0.61,P<0.001), 與厚壁菌門下Ruminococcus_sp._5_1_39BFAA(R=-0.43,P<0.001)、unclassified_g_Fusicatenibacter(R=-0.44,P<0.001)呈負相關(guān)，見圖6B。提示菌群之間存在復(fù)雜的正、負相關(guān)作用，其中厚壁菌門與擬桿菌門下屬菌群存在顯著負相關(guān)。

A: 屬水平物種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)屬性圖; B: 屬水平單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析。分類水平為屬，顏色顯示水平為門。圖中節(jié)點的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種; 連線的顏色表示正負相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負相關(guān);線的粗細表示相關(guān)性系數(shù)的大小，線越粗，表示物種之間的相關(guān)性越高; 線越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切。X軸和Y軸均為物種，通過計算獲得相關(guān)系數(shù)R值和P值, R值在圖中以不同顏色展示。

3 討 論

AD 作為一種世界范圍內(nèi)常見的炎癥性皮膚病，可發(fā)生于任何年齡，近年來，兒童AD的患病率呈上升趨勢[8]。目前，關(guān)于AD的發(fā)病機制仍未完全闡明, Th1、Th2、Th17、Treg等細胞因子在AD的發(fā)生發(fā)展中為異質(zhì)性且動態(tài)變化[9-10]。研究[11]證實，皮膚及腸道微生物可以通過多條途徑參與AD的發(fā)病，而中藥則可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群治療AD[3]。

人體內(nèi)95%的微生物群存在于腸道，且主要集中在結(jié)腸，這些腸道微生物可以通過多條途徑影響機體功能，當(dāng)其發(fā)生變化時，可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生[11]。研究[12]證實，人在5歲以后，其腸道微生物組的組成趨于相對穩(wěn)定狀態(tài)，故本研究選取6～12歲人群為研究對象; 此外，應(yīng)用Illumina Miseq測序平臺對研究對象糞便細菌的16SrRNA基因V3～V4區(qū)進行高通量測序檢測腸道菌群[13]。雙歧桿菌、鏈球菌、乳球菌和乳酸桿菌被認為是人類幼年時最豐富的細菌種類之一，而擬桿菌和厚壁菌則在成年期更為豐富[14]。本研究發(fā)現(xiàn), TB組、TA組與N組腸道菌群組成中占優(yōu)勢的菌有厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門，與相關(guān)研究[15]結(jié)果相一致，提示整個實驗過程中腸道菌群檢測結(jié)果相對穩(wěn)定，具有可比性。

A: 種水平物種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)屬性圖; B: 種水平單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析 。分類水平為種，顏色顯示水平為屬。圖中節(jié)點的大小表示物種豐度大小，不同顏色表示不同的物種; 連線的顏色表示正負相關(guān)性，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負相關(guān);線的粗細表示相關(guān)性系數(shù)的大小，線越粗，表示物種之間的相關(guān)性越高; 線越多，表示該物種與其他物種之間的聯(lián)系越密切。X軸和Y軸均為物種，通過計算獲得相關(guān)系數(shù)R值和P值, R值在圖中以不同顏色展示。

腸道微生物群組成及其與宿主關(guān)系的失衡可能與過敏性疾病的發(fā)生有關(guān)。微生物群組成與特應(yīng)性癥狀和(或)過敏之間存在關(guān)聯(lián)，但無法確定哪些微生物與過敏性疾病的發(fā)生相關(guān)[16]。MELLI L C等[17]發(fā)現(xiàn)過敏性疾病腸道菌群表現(xiàn)為擬桿菌屬(Bacteroides)豐度增加。PETERSEN E B M等[18]對PubMed中相關(guān)文章分析發(fā)現(xiàn)，所有研究主要集中在探討AD患者腸道菌群中雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、擬桿菌和乳酸桿菌等的變化情況，但報道結(jié)果不一，且具體作用機制仍未闡明。2018年本課題組在AD患者與健康人群腸道菌群差異研究中發(fā)現(xiàn)AD患者與健康人腸道菌群存在差異，推測擬桿菌可能在AD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[19]。此外，本課題組前期在進行AD患兒與正常兒童腸道菌群Network 網(wǎng)絡(luò)分析研究中還發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門與厚壁菌門存在負相關(guān)作用[20]。近來, YE S Q等[21]研究發(fā)現(xiàn), AD患者腸道菌群中Porphyromonadaceae、Blautia、Parabacteroides、Bacteroidesovatus、Bacteroidesuniformis、Prevotellastercorea豐度增高,ClostridiumandP.stercorea豐度降低; 推測Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae可以區(qū)分AD患者與健康人。基于本課題組前期研究成果，結(jié)合已有研究報道，提示腸道菌群中擬桿菌及厚壁菌物種豐度變化參與AD的發(fā)病。本研究顯示，治療后擬桿菌及厚壁菌物種豐度在門、屬、種不同水平發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為擬桿菌門及其下屬、種水平豐度呈現(xiàn)降低趨勢，而厚壁菌門及其下屬、種水平豐度呈現(xiàn)升高趨勢；物種相關(guān)性分析顯示，擬桿菌門及厚壁菌門相關(guān)屬、種物種存在負相關(guān)，同時network網(wǎng)絡(luò)研究顯示擬桿菌門下Bacteroides_uniformis與Bacteroides_vulgatus_ATCC_8482發(fā)揮重要作用，提示擬桿菌門物種豐度降低具有重要意義。此外，有研究[22]認為Faecalibacteriumprausnitzii降低是AD診斷標記物。本研究中,Faecalibacterium[TB: (13.20±8.19), TA: (16.71±11.48)]及其下種unclassified_g_Faecalibacterium[TB: (13.2±8.19), TA: (16.71±11.48)]治療后豐度增加明顯，進一步驗證了這一研究結(jié)果。

綜上所述，健脾祛風(fēng)湯的治療作用可能與厚壁菌門及擬桿菌門物種豐度的變化相關(guān)。但本研究存在樣本量相對不足，健康對照組的設(shè)定方法不夠嚴謹?shù)葐栴}，今后將進一步完善，并深入開展以代謝組學(xué)為主的機制研究。