王淑林 張長(zhǎng)平 翁崇雙

不育癥是指由于男性因素引起的不育，常與染色體異常、內(nèi)分泌疾病、生殖道感染和輸精道梗阻等因素有關(guān)，主要表現(xiàn)為無(wú)法使女性受孕，少部分患者可能存在性功能障礙、睪丸疼痛等[1-3]。近年來(lái)隨著生活壓力的增大及生活方式的改變，發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)。臨床常通過(guò)精液常規(guī)參數(shù)分析評(píng)估男性生育能力，包括精子密度和精子形態(tài)等[4]。隨著生殖醫(yī)學(xué)發(fā)展，人們對(duì)受精能力的評(píng)估由精子外在形態(tài)向內(nèi)在機(jī)制逐步轉(zhuǎn)變。既往研究顯示，男性不育癥與精子凋亡調(diào)控失衡密切相關(guān)[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）作為一種蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中起著重要作用[6]。B 細(xì)胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）具有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞凋亡作用[7]。由此推測(cè)Caspase-3、Bcl-2 表達(dá)水平與男性不育有關(guān)。因此，本文旨在探究男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2 表達(dá)水平及其與精液常規(guī)參數(shù)及精子DNA 完整性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年5 月-2021 年5 月于上饒市婦幼保健院確診的100 例男性不育癥患者，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）標(biāo)準(zhǔn)[8]將患者分為少精組58 例（精子濃度＜20×106/mL）和弱精組42 例（精子濃度≥20×106/mL），另隨機(jī)選取在本院進(jìn)行健康體檢的56 例正常男性作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：少精組和弱精組符合文獻(xiàn)[9]臨床對(duì)不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，婚后性生活正常、未采取避孕措施，＞1 年不育。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并生殖道外傷；（2）合并器質(zhì)性疾?。唬?）超聲檢查下睪丸、附睪、精索靜脈和輸精管未見明顯異常；（4）臨床資料不完整；（5）存在精神疾病。醫(yī)院倫理委員會(huì)對(duì)本研究予以審核批準(zhǔn)通過(guò)，患者及其家屬了解本研究并知情同意。

1.2 方法

1.2.1 Caspase-3、Bcl-2 水平 觀察組患者于入院當(dāng)天，對(duì)照組患者于入院體檢當(dāng)天采集空腹靜脈血3 mL，將標(biāo)本放置在-40 ℃的條件下保存，待血液完全凝固后進(jìn)行離心分離血清（離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心10 min），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)患者Caspase-3，試劑盒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2。所有檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 精液采集與處理 所有患者禁欲3～7 d 后于醫(yī)院留取精液并置于室溫下液化，并取部分進(jìn)行精液常規(guī)檢查。稱量精液質(zhì)量并計(jì)算精液體積，采用計(jì)算機(jī)精液分析系統(tǒng)（西班牙CASA 系統(tǒng)）計(jì)算精子濃度、精子存活率和精子前向運(yùn)動(dòng)率。

1.2.3 精子DNA 完整性 采用美國(guó)Irvine Scientific公司生產(chǎn)的ISOLATE 梯度液進(jìn)行密度梯度離心，離心棄上層清液后留取0.5 mL 沉淀，上游法優(yōu)選精子。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)精子DNA 碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI），儀器選擇美國(guó)貝克曼FC500 生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，試劑盒為儀器配套的，操作過(guò)程嚴(yán)格按儀器與試劑說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)精子流動(dòng)速度2 min 后收集數(shù)據(jù)，精子核經(jīng)過(guò)酸和染色處理后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算精子DNA 完整性（DFI值），DFI＜15%為精子DNA 完整性較好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究中所涉及的數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布且方差齊的Caspase-3、Bcl-2、精液常規(guī)參數(shù)及DFI 值等計(jì)量資料采用（）表示，采用單因素方差分析比較三組間差異，采用Bonferroni 檢驗(yàn)比較三組間兩兩差異；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)性分析Caspase-3、Bcl-2 表達(dá)水平與精液常規(guī)參數(shù)及精子DNA 完整性的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 三組年齡、體重指數(shù)、禁欲時(shí)間、學(xué)歷及吸煙史比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組一般資料比較

2.2 三組Caspase-3、Bcl-2 水平及DFI 比較 少精組及弱精組的Caspase-3、DFI 水平均高于對(duì)照組，Bcl-2 均低于對(duì)照組（P＜0.05），少精組Caspase-3、DFI 水平均高于弱精組，Bcl-2 水平低于弱精組（P＜0.05），見表2。

表2 三組Caspase-3、Bcl-2水平及DFI比較（）

表2 三組Caspase-3、Bcl-2水平及DFI比較（）

*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與弱精組相比，P＜0.05。

2.3 三組精液參數(shù)比較 少精組及弱精組的精液量、濃度、前向運(yùn)動(dòng)率及精子存活率均低于對(duì)照組（P＜0.05），少精組精液量、濃度、前向運(yùn)動(dòng)率及精子存活率均低于弱精組（P＜0.05），見表3。

表3 三組精液參數(shù)比較（）

表3 三組精液參數(shù)比較（）

*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與弱精組相比，P＜0.05。

2.4 少精組與弱精組Caspase-3、Bcl-2 與精液常規(guī)參數(shù)及精子DNA 完整性的關(guān)系 少精組與弱精組精液Caspase-3 與精液量、濃度、前向運(yùn)動(dòng)率及精子存活率均呈負(fù)相關(guān)，與DFI 呈正相關(guān)（P＜0.05）。Bcl-2 與精液量、濃度、前向運(yùn)動(dòng)率及精子存活率均呈正相關(guān)，與DFI 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 少精組與弱精組Caspase-3、Bcl-2與精液常規(guī)參數(shù)及精子DNA完整性的關(guān)系

3 討論

引起男性不育癥的病因較為復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制也尚未完全明確，現(xiàn)已成為男科領(lǐng)域中極其重要的研究熱點(diǎn)。研究證實(shí)，男性不育與精液常規(guī)參數(shù)如精液量、濃度及活力有關(guān)[10]。另有研究表明，男性不育癥的發(fā)病機(jī)制和病因與Caspase-3 及Bcl-2 緊密相連[11-12]。但臨床關(guān)于Caspase-3 及Bcl-2 與精液常規(guī)參數(shù)和精子DNA 完整性具體關(guān)系的探討尚存在一定爭(zhēng)議。故本文旨在就其相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析研究。

細(xì)胞凋亡是指機(jī)體為維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而出現(xiàn)由基因控制的細(xì)胞自主且有序的死亡現(xiàn)象，可將機(jī)體內(nèi)發(fā)育不良及變異的細(xì)胞主動(dòng)從體內(nèi)清除，嚴(yán)格控制正常細(xì)胞的增殖和衰老[13-14]。但凋亡過(guò)程中的紊亂可能會(huì)直接或間接導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，其中較為常見的即男性不育癥，其是由于各種因素的影響使精細(xì)胞凋亡異常，精子含量減少而引起的[15]。細(xì)胞凋亡過(guò)程中受到多種蛋白的調(diào)控，最為關(guān)鍵且重要的是Caspase-3、Bcl-2。本研究中，少精組及弱精組的Caspase-3 水平均高于對(duì)照組，Bcl-2 均低于對(duì)照組（P＜0.05）。少精組Caspase-3水平高于弱精組，Bcl-2 水平低于弱精組（P＜0.05），提示男性不育癥患者的精子含量越少，Caspase-3越高，Bcl-2 越低。Caspase-3 作為介導(dǎo)凋亡信號(hào)的關(guān)鍵下游分子，在多種凋亡過(guò)程中起著承上啟下的作用。既往研究顯示，Caspase-3 水平增加與男性不育癥患者精子密度減低有關(guān)[16]。在正常情況下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在對(duì)Caspase 酶的抑制劑，以降低其被激活時(shí)對(duì)細(xì)胞造成的損傷。但當(dāng)Caspase-3水平異常升高或抑制劑的水平不足時(shí)，會(huì)造成細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，引起精子含量減少，促使男性不育癥的發(fā)生發(fā)展。Bcl-2 作為一種癌基因，可抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2 可與Bcl-2 家族的抑制細(xì)胞凋亡基因（Bcl-X1）、凋亡相關(guān)基因Bcl-X 的突變微基因（Bcl-Xs）等形成同源的蛋白二聚體，而特定的同源二聚體可作為細(xì)胞凋亡信號(hào)通路上的分子開關(guān)[17]。因Bcl-2 可與促凋亡BaX 形成二聚體，若Bcl-2 水平降低，則BaX 相對(duì)量高于Bcl-2，BaX 同二聚體的數(shù)量增多，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，引發(fā)男性不育。

本研究中，少精組及弱精組患者的DFI 水平均高于對(duì)照組，精液量、濃度、前向運(yùn)動(dòng)率及精子存活率均低于對(duì)照組（P＜0.05）。說(shuō)明男性不育癥患者精子DNA 受到損傷，精子發(fā)育水平及線粒體功能下降。臨床常用DFI 表示精子DNA 的完整性，精子DNA 完整性是保證遺傳物質(zhì)成功傳遞的重要前提，但由于環(huán)境與基因改變、染色體異常等常導(dǎo)致精子魚精蛋白缺乏，造成精子DNA 損傷，出現(xiàn)DNA 碎片化的現(xiàn)象，使DFI 水平升高[18]。精子在進(jìn)入附睪的過(guò)程中會(huì)逐漸成熟，但也伴隨著精子的氧化受損和細(xì)胞凋亡，精子在附睪內(nèi)停留的時(shí)間越長(zhǎng)，精子氧化受損程度越嚴(yán)重，使精子活力下降，線粒體功能減退[19]。而精子線粒體代謝功能下降會(huì)加重DNA 損傷并影響精子前向運(yùn)動(dòng)水平，故引起精液常規(guī)參數(shù)水平的下降。本研究中，精液量、濃度、前向運(yùn)動(dòng)率及精子存活率與Caspase-3 呈負(fù)相關(guān)，與Bcl-2 呈正相關(guān)，DFI 與Caspase-3 呈正相關(guān)，與Bcl-2 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。提示男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2 表達(dá)水平及與精液常規(guī)參數(shù)、精子DNA 完整性密切相關(guān)。因Caspase-3 及Bcl-2表達(dá)水平異常均會(huì)造成細(xì)胞凋亡的發(fā)生，損傷睪丸生精功能。而細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，導(dǎo)致精子數(shù)量的產(chǎn)生減少，活力降低。而研究表明，精子活力與DFI 水平呈負(fù)相關(guān)，且精子DNA 完整性異常會(huì)降低精子存活率[20]，進(jìn)一步說(shuō)明男性不育癥患者Caspase-3、Bcl-2 表達(dá)水平可反映精子DNA 完整性及精液常規(guī)參數(shù)。

綜上所述，男性不育癥患者Caspase-3 水平呈現(xiàn)高表達(dá)，Bcl-2 呈低表達(dá)，且Caspase-3 與精液常規(guī)參數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，與DFI 呈正相關(guān)；Bcl-2 與精液常規(guī)參數(shù)均呈正相關(guān)，與DFI 呈負(fù)相關(guān)。臨床可通過(guò)檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2 水平評(píng)估男性不育癥患者的精液質(zhì)量和生育能力。本研究不足之處在于納入樣本量偏少，結(jié)果存在單一性，臨床應(yīng)擴(kuò)大樣本量深入研究證實(shí)。