何 為 綜述 馬潞林 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院泌尿外科，北京 100191)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系常見的腫瘤之一，腎臟腫瘤發(fā)病率在全美男性及女性分別排名第7、8位，近5年呈持續(xù)上升趨勢[1]。在我國，RCC同樣呈現(xiàn)明顯增長的趨勢[2]。早期診斷及治療對腫瘤的控制尤為重要，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的來臨，傳統(tǒng)影像學(xué)檢查方法再也無法滿足新的需求，液體活檢的價值逐漸提高，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)檢測技術(shù)提供了新的思路。本文對ctDNA在RCC中的應(yīng)用進(jìn)行文獻(xiàn)總結(jié)。

1 ctDNA的特點(diǎn)

游離DNA (cell-free DNA, cfDNA)是指在幾乎所有的體液(包括血液)中均可檢測到的脫細(xì)胞核酸的短片段，參與免疫、凝血、衰老、癌變等各種生理病理現(xiàn)象。在癌癥患者中，一部分血漿中的cfDNA來源于腫瘤，稱為ctDNA，可能與原發(fā)腫瘤具有相同的突變和基因改變。ctDNA的定義為腫瘤細(xì)胞釋放到外周循環(huán)系統(tǒng)中攜帶腫瘤信息的DNA片段，是cfDNA的一種特殊類型，主要來源于腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死、主動釋放、吞噬作用及細(xì)胞脫離[3]。

腫瘤患者血液中ctDNA大小受腫瘤細(xì)胞釋放方式的影響，一般相比于健康人群的cfDNA更片段化，細(xì)胞凋亡釋放的DNA大小為150～180 bp，在壞死過程中，染色質(zhì)鏈以無序的方式降解，可產(chǎn)生50 kbp的片段[3，4]。腫瘤患者血液中線粒體來源cfDNA(mitochondria-originated cfDNA, mt-cfDNA)片段大小與患者腫瘤負(fù)荷及ctDNA濃度呈負(fù)相關(guān)[5]。另外，ctDNA半衰期較短，一般在100～數(shù)百分鐘，可通過其含量的變化監(jiān)測疾病進(jìn)展及治療情況[6，7]。

由于ctDNA攜帶特異的腫瘤信息，且半衰期較短，能夠通過其攜帶的信息和含量的變化提供精準(zhǔn)的治療方案，并對治療情況進(jìn)行跟蹤和隨訪，與組織標(biāo)本相比，ctDNA的優(yōu)點(diǎn)很多：風(fēng)險小、快速、微創(chuàng)、價格便宜，而且從生物學(xué)角度來看，更能代表整個腫瘤，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是ctDNA在外周血液中含量極低，檢測尤其困難，目前檢測方法有：①聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)，包括等位基因特異性PCR(allele specific polymerase chain reaction, AS-PCR)、數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)和數(shù)字PCR結(jié)合流式技術(shù)(beads, emulsion, amplification, magnetics, BEAM-ing PCR)；②二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS),包括全基因組測序、逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增測序和全外顯子測序；③有針對性的NGS技術(shù)，包括基于多重PCR的NGS和基于混合捕獲的NGS；④組合方法[8]。檢測的敏感性取決于所使用的評估技術(shù)和遺傳平臺、腫瘤器官、腫瘤分期、腫瘤異質(zhì)性和克隆性[9]。

2 ctDNA在RCC中的應(yīng)用

目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)cfDNA應(yīng)用在非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌中，分別用于檢測血漿中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的突變情況及SEPTIN9啟動子的甲基化狀態(tài)，并指導(dǎo)靶向藥物的應(yīng)用，在以EGFR為靶點(diǎn)的藥物治療非小細(xì)胞肺癌中，還可以監(jiān)測T790M突變，提示耐藥并更換靶向藥物。在肺癌、卵巢癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌根治術(shù)后，ctDNA的存在被證明與復(fù)發(fā)和不良預(yù)后相關(guān)，甚至通過ctDNA的腫瘤特異性改變預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)率[10, 11]。唐堂等[12]對46例前列腺癌研究顯示，ctDNA中攜帶HR基因突變的患者在診斷時Gleason評分整體更高(P<0.01)，有更多的轉(zhuǎn)移灶(P=0.018)，且腫瘤分期更晚(P=0.031)，此外，胚系HR突變較體系HR突變的患者確診年齡更小(P<0.01)。

同樣，在早期和晚期RCC患者血漿中都能檢測到ctDNA，包括在小腫瘤患者的血漿中[13],而且在RCC患者血漿中cfDNA濃度要明顯高于健康人群[14, 15]。在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(metastatic renal cell carcinoma，mRCC)患者中，ctDNA陽性率為33%，與腫瘤組織NGS檢測結(jié)果的一致性達(dá)到77%[16]。Zengin等[17]報(bào)道839例mRCC中，612例(72.9%)ctDNA基因突變，其中最常見的突變基因?yàn)槟[瘤蛋白53(tumor protein 53, TP53)(36.9%)、von Hippel-Lindau(VHL)(22.2%)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)(7.2%)，腫瘤組織樣本采集時間越近，基因突變與血液ctDNA突變一致性越高。Hahn等[18]比較19例mRCC腫瘤組織和ctDNA的NGS檢測結(jié)果，兩者一致率僅為8.6%，腫瘤組織的基因突變比例更高，尤其是在DNA修復(fù)基因中，也可能是由于2種方式取樣時間不同所致，提示ctDNA的NGS檢測結(jié)果可能更能反映腫瘤基因動態(tài)異質(zhì)性。2種檢測方法應(yīng)相互補(bǔ)充，共同評估腫瘤狀態(tài)。

2.1 ctDNA在RCC診斷中的應(yīng)用

RCC患者血漿中cfDNA水平可作為非侵襲性診斷工具，靈敏度63.0%，特異性78.1%[19]。Hauser等[20]報(bào)道30例RCC血漿中cfDNA甲基化水平較健康人群明顯增高(14.3%～54.3% vs.0～16.7%)，并具有高度的特異性(85.2%～100%)，血清中高甲基化的cfDNA檢測可能有助于RCC的診斷，聯(lián)合多個基因的分析可以明顯提高診斷的準(zhǔn)確性(60%～74.3%)。Skrypkina等[21]對比27例RCC與15例健康人的血漿樣本，結(jié)果顯示血漿中cfDNA水平結(jié)合Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(Ras association domain family 1A gene,RASSF1A)、脆性組氨酸三聯(lián)體和腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatosis polyposis coli，APC)基因的CpG島甲基化可以作為癌癥的非侵襲性診斷標(biāo)志物(AUC=1)[21]。

Zhao等[22]建立小鼠伴有MET突變的乳頭狀腎癌(papillary renal cell carcinoma，pRCC)模型，使用卡博替尼進(jìn)行治療，檢測ctDNA在疾病進(jìn)展及治療后的變化，結(jié)果顯示ctDNA與模型小鼠的疾病進(jìn)程的一致性。Pal等[23]對169例pRCC腫瘤組織NGS檢測，證實(shí)MET突變在pRCC中的突變率較高，達(dá)到33%，及其潛在的治療價值。

2.2 ctDNA判斷RCC患者的預(yù)后

液體活檢(包括ctDNA)另一項(xiàng)有前途的應(yīng)用是確定腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險，并在后續(xù)檢查中作為監(jiān)測的生物標(biāo)志物，以便更早地發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病。在實(shí)性腫瘤中，進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中ctDNA含量高于早期腫瘤患者[24,25]。Wan等[26]在92例RCC的研究中得出類似的結(jié)論，其中17例復(fù)發(fā)，相比無復(fù)發(fā)患者，復(fù)發(fā)者術(shù)前后血漿cfDNA水平更高(P≤0.024)，且在COX多因素分析中明確cfDNA水平可作為復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測因素(P=0.009)。另一項(xiàng)回顧性研究[27](n=100)對比腫瘤組織中矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2， SHOX2)甲基化水平，結(jié)果顯示治療前血漿cfDNA中SHOX2甲基化水平與腎切除術(shù)后高死亡風(fēng)險相關(guān)(P<0.001)。一項(xiàng)44例mRCC的研究[28]顯示，18例ctDNA陽性者相較陰性者腫瘤負(fù)荷更高(均值8.81 cm vs. 4.49 cm，P=0.04)。

Yamamoto等[29]納入53例腎透明細(xì)胞癌，共檢測到16例(30%)38個突變，包括6例TP53突變和5例VHL突變，ctDNA陽性的RCC患者cfDNA片段更小，ctDNA陽性和cfDNA片段化與更差的腫瘤特異性生存率明顯相關(guān)(P<0.001，P=0.011)，提示ctDNA陽性和cfDNA片段大小可以作為RCC的預(yù)后監(jiān)測指標(biāo)。Bacon等[16]研究也證實(shí)ctDNA陽性患者預(yù)后更差，一線治療后無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)更短。

2.3 ctDNA指導(dǎo)個體化用藥

ctDNA水平還可以預(yù)測mRCC患者的治療效果。ctDNA水平的動態(tài)變化與mRCC患者接受一線抗程序性死亡受體1(programmed cell death 1, PD1)和抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4, CTLA4)聯(lián)合療法的治療反應(yīng)相關(guān)，ctDNA可作為接受一線免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的mRCC患者治療反應(yīng)的早期預(yù)測因子[30]。Zhang等[31]報(bào)道在晚期腫瘤中通過治療前后ctDNA的動態(tài)變化能夠預(yù)測是否在免疫治療中獲益，比影像學(xué)檢查更早預(yù)測疾病進(jìn)展。Feng等[32]通過實(shí)時熒光定量PCR對18例轉(zhuǎn)移性透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)在索拉非尼治療期間6個不同時間點(diǎn)的cfDNA進(jìn)行監(jiān)測，治療過程中cfDNA水平越高，藥物反應(yīng)越差。與疾病進(jìn)展的患者相比，緩解期或穩(wěn)定期患者在8～24周cfDNA水平較低。可見，ctDNA可作為免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物，具有潛在的價值。

Pal等[33]納入220例mRCC，78.6%的患者檢出ctDNA突變，最常見的變異為TP53(35%)、VHL(23%)、EGFR(17%)、神經(jīng)纖維瘤蛋白1(neurofibromin 1， NF1)(16%)和AT豐富結(jié)合域1A(AT-rich interaction domain 1A, ARID1A)(12%)，其中38例和64例分別接受一線藥物治療和二線藥物治療，二線藥物治療患者和一線藥物治療患者基因突變頻率差異最大的分別是TP53 (49% vs.24%)、VHL (29% vs.18%)、NF1 (20% vs.3%)、EGFR (15% vs.8%)和磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α基因(phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA) (17% vs.8%)，ARID1A是相同的(13% vs.11%)，如果將一線和二線治療藥物都限制為血管內(nèi)皮生長因子抑制劑，基因突變的差異將會更顯著，這些差異提示治療耐藥的潛在機(jī)制。

目前，正在進(jìn)行的TARIBO研究是一項(xiàng)Ⅲ期多中心臨床研究，通過ctDNA分析評判，mRCC患者在使用靶向藥物治療的前提下，實(shí)施減瘤手術(shù)能否改善患者長期生存及預(yù)后的影響，并探索靶向治療的耐藥機(jī)制[34]。

3 ctDNA檢測面臨的挑戰(zhàn)

盡管取得許多新進(jìn)展，但ctDNA的廣泛應(yīng)用仍面臨一些重要的挑戰(zhàn)：首先，ctDNA本身的特點(diǎn)，包括片段化、濃度低、半衰期短，對臨床應(yīng)用設(shè)置障礙，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。其次，衰老細(xì)胞的生物學(xué)特征也為ctDNA的應(yīng)用增加限制，衰老過程中非癌性病變中體細(xì)胞突變，增加混雜因素，尤其是在非癌組織中發(fā)現(xiàn)與癌組織中非常類似的TP53突變，需要更好地了解健康以及特定生理?xiàng)l件下(例如衰老)外周血中的成分[35]。另外，由于高腫瘤突變負(fù)荷與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的良好反應(yīng)相關(guān)，腫瘤突變負(fù)荷被認(rèn)為是預(yù)測免疫治療療效的重要標(biāo)志物，ctDNA可以作為腫瘤突變負(fù)荷的替代，并預(yù)測患者對免疫治療的反應(yīng)[36]。但免疫系統(tǒng)在腫瘤進(jìn)展的過程對血液中的成分造成改變，需要開發(fā)工具，以便能夠在檢測樣本中研究微環(huán)境和免疫應(yīng)答對腫瘤發(fā)生的影響。最后，ctDNA在腫瘤患者血漿中的濃度較低，需要對診斷工具進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)，以能夠檢測循環(huán)中的少量腫瘤衍生成分。

目前，對于ctDNA的研究大部分為回顧性研究，缺乏前瞻性研究，ctDNA為生物標(biāo)記的癌癥檢測和監(jiān)測方法的開發(fā)需要大規(guī)模的臨床研究和充足的證據(jù)，不僅是為檢測方法的效率和檢測手段的可靠性，而且是為其臨床實(shí)用性。對于每一種腫瘤靶點(diǎn)，可能需要分析數(shù)百名癌癥患者。為驗(yàn)證該變異是否為腫瘤組織所特有，還應(yīng)評估大量健康個體作為對照的cfDNA圖譜，對這2組患者進(jìn)行持續(xù)的臨床隨訪也是必要的，以區(qū)分假陽性和真陽性信號[37]。

ctDNA檢測技術(shù)改變了腫瘤的診斷及治療方案，在個體化精準(zhǔn)治療的時代，為臨床工作提供新的決策思路，其應(yīng)用包括腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與診斷、腫瘤發(fā)展進(jìn)程的監(jiān)測與隨訪、靶向治療的選擇和免疫治療反應(yīng)等方面，具有廣泛的前景和應(yīng)用價值，但因其獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)、檢測方法和技術(shù)的限制，仍需進(jìn)一步的研究和論證。