孫靜 葛良鵬丁玉春張進威梁浩馬繼登

(1.重慶市畜牧科學院,重慶 402460;2.農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室,重慶 402460;3.國家生豬技術創(chuàng)新中心,重慶 402460;4.重慶市養(yǎng)豬科學重點實驗室,重慶 402460;5.畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室四川農(nóng)業(yè)大學,成都 611130)

SPF 豬制備技術于上世紀50 年代由美國內(nèi)布拉斯加州立大學George Young 博士創(chuàng)立,他運用剖腹產(chǎn)手術方法替代自然分娩方式成功生產(chǎn)出SPF豬。隨后美國、加拿大、英國、丹麥、瑞士、德國、法國、荷蘭、原捷克斯洛伐克、南斯拉夫、澳大利亞、日本等國家和地區(qū)先后在政府支持下,建立SPF 豬審定協(xié)會或認定委員會,制定SPF 豬認定標準,嚴格控制遺傳學質(zhì)量,建立飼養(yǎng)凈化豬群的整套生產(chǎn)體系和管理服務體系,推行SPF 豬生產(chǎn)計劃。目前為止,歐美多個國家成立了SPF 豬認證機構。比如,美國國家SPF 豬認證機構(National SPF Swine Accrediting Agency,NSSAA)通過制定SPF 豬群評估標準,定期對養(yǎng)殖場豬群健康檢查、對上市豬只的屠宰抽查來跟蹤豬群中的特定疾病以及疾病預防等手段來提高豬的生產(chǎn)效率。丹麥培根和肉類理事會(Danish Bacon and Meat Council,DBMC) 自1968 年以來組織了丹麥SPF 豬計劃[1],現(xiàn)有300 多個豬場擁有SPF 核心群及種豬群[2-3]以及SPF 哥廷根小型豬種群(Ellegaard Gottingen 小型豬公司)[4];到2015 年,挪威建立了兩個SPF 核心群和40 多個SPF 豬繁殖封閉群,還建立了20 個生產(chǎn)豬群提供商業(yè)化使用[5]。日本SPF 豬協(xié)會成立于1969 年,70年代開始對外推廣SPF 豬。目前為止,經(jīng)認證的SPF 豬養(yǎng)殖場超過190 個,約占日本豬場數(shù)量的5%,共生產(chǎn)了9.7%的SPF 母豬和約10%的SPF 肉豬(http://www.j-spf.com/)。我國臺灣地區(qū)由徐興镕博士于1982 年建立SPF 實驗室,開展實驗用SPF小型豬和SPF 肉豬的培育;在大陸地區(qū),北京SPF豬育種管理中心最早開展SPF 豬的研究,該中心于1988 年承擔了國家科委七五重點科技攻關“SPF 豬系統(tǒng)開發(fā)與研究”;之后江蘇省農(nóng)業(yè)科學院、重慶市畜牧科學院和中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所等單位先后建立SPF 豬生產(chǎn)繁育系統(tǒng),開展SPF 豬的培育和應用推廣。

1 SPF 豬的質(zhì)量控制

對SPF 豬群實施質(zhì)量控制主要涉及遺傳、病原和環(huán)境3 大方面。

1.1 遺傳質(zhì)量控制

生產(chǎn)過程中,封閉群的管理模式適用于SPF 豬種群的繁育,近交系的管理模式適用于特定實驗用SPF 豬群的選育。“金字塔”生產(chǎn)管理模式可實現(xiàn)SPF 豬種群保種、繁育和生產(chǎn)使用:核心群主要為本品種選育工作,擴繁群主要是擴大繁育良種群體數(shù)量,生產(chǎn)群主要是供給實驗用SPF 仔豬群。

目前,基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記計算個體的基因組育種值,選擇優(yōu)秀個體已成為了現(xiàn)代育種工作的常用手段之一,也適用于SPF核心群的建立。采用個體選配法選留初代SPF 豬群,對所有個體進行親緣關系分析,獲得各自的親緣關系系數(shù)和所有樣本的聚類結果,判斷樣本間血緣的遠近情況;通過逐頭分析,選定與配公/母豬個體。選配計劃執(zhí)行后,在下次配種期來臨之前,應分析個體過去的交配結果,找出生產(chǎn)過優(yōu)良后代的雜交組合繼續(xù)使用,并可增選具有相應品質(zhì)的公母豬與之交配。生產(chǎn)性能是SPF 豬選育的關鍵,公豬個體對種群的影響大。因此,建議按照公豬構建家系,采取家系間相互交配,家系內(nèi)不交配的方式,有計劃地制約SPF 核心群的近交系數(shù)的增長。

1.2 病原微生物質(zhì)量控制

對SPF 豬群健康評估應基于各個疾病的臨床證據(jù),而不僅僅是指標疾病。對所有年齡階段的豬的臨床癥狀進行評估,對豬群生產(chǎn)效率的評估、寄生蟲控制計劃、疫苗接種計劃和藥物使用計劃等,對任何可疑疾病都要進行明確的診斷測試。比如,Safron and Gonder 建議在血清學檢測中,偽狂犬病和布魯氏菌病必須為陰性[6]。另外,對豬繁殖與呼吸綜合征、胸膜肺炎放線桿菌、支原體病和傳染性胃腸炎等疫病進行常態(tài)化檢查。

一般每3 個月臨診1 次,抽樣(群體數(shù)的5%左右)并采集外周血分離血清樣品、采集口鼻黏液、新鮮糞便樣品以及皮屑樣品,按個體和樣品類型標注,由第三方資質(zhì)公司檢測病原。

1.3 環(huán)境質(zhì)量控制

總體上,SPF 豬的生產(chǎn)應落實“外緊內(nèi)松”的生物安全防護原則,并做到制度化和常態(tài)化。根據(jù)GB14925-2010《實驗動物環(huán)境及設施》的規(guī)定,正壓的屏障環(huán)境和隔離環(huán)境適用于SPF 級及無菌級動物的生產(chǎn)、實驗和檢疫,但在實際生產(chǎn)中原則上只要與普通豬群隔開飼養(yǎng),保持在傳染病源不能侵入的環(huán)境中飼養(yǎng),對人員流、空氣流、水流、動物流和物流這“五流”制定詳細而嚴謹?shù)牟僮饕?guī)程,防止病原微生物通過空氣、工作人員、飼料及用品、飲水、蚊蟲和鼠害等途徑感染或污染豬群。也可選擇一些節(jié)能環(huán)保的措施:比如,利用高溫殺菌(>75℃的自來水)并冷卻后的水作為SPF 豬的飲用水,替代純水是可行的;利用微波干燥替代鈷-60 輻照的方式殺滅商品化飼料中微生物,可節(jié)約SPF 豬的飼喂成本。

總之,SPF 豬場的生物安全管理是SPF 豬微生物質(zhì)量控制最有效的措施,也是豬場疫病防控的核心防線。可根據(jù)各豬場的具體情況和SPF 豬的認證或評價要求綜合考慮生產(chǎn)中的關鍵危害控制點,研究部署SPF 豬生產(chǎn)的計劃。

2 國內(nèi)外SPF 豬的病原控制現(xiàn)狀

病原微生物控制是SPF 豬質(zhì)量控制的核心之一,各國(或地區(qū))對SPF 豬的病原控制各不相同(表1)。在參考了丹麥等畜牧業(yè)發(fā)達國家SPF 豬病原控制技術,并結合我國養(yǎng)豬生產(chǎn)的現(xiàn)狀,起草了GB/T 22914-2008《SPF 豬病原的控制與監(jiān)測》[7],推薦我國SPF 豬群臨床檢查應沒有口蹄疫、豬水泡病、豬瘟、非洲豬瘟、布魯氏桿菌、弓形體病、豬痢疾密螺旋體病、流行性乙型腦炎、細小病毒病、豬丹毒、豬肺疫、豬鏈球菌病、旋毛蟲病、豬囊尾蚴病、豬偽狂犬病等15 種病原,實驗室檢測沒有豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒、布魯氏桿菌、豬產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌、豬肺炎支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬痢疾密螺旋體、豬血虱、豬疥螨等12 種病原。十三五期間,在國家重點研發(fā)計劃項目《畜禽疫病防控專用實驗動物開發(fā)》的實施期間,補充了包括乙型腦炎病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、沙門氏菌、豬流感病毒和豬皮膚病原真菌等5 項作為T/CALAS 33-2017《實驗動物SPF 豬微生物學監(jiān)測》的SPF 豬病原控制指標,并更新了SPF 豬的定義,即:經(jīng)過人工培育,對其攜帶的微生物和寄生蟲實行控制,遺傳背景明確或來源清楚的用于科學研究的豬[8]。

表1 各國對SPF 豬的病原控制Table 1 Pathogen control of SPF pigs in different countries

3 SPF 豬的病原凈化方法

SPF 豬的凈化重點是進行病原微生物的凈化,排除其攜帶的相關原核生物(細菌、放線菌、螺旋體和支原體)、真核生物(真菌)和非細胞類(病毒)以及寄生蟲病原。SPF 豬的病原凈化主要分為剖腹產(chǎn)手術法、無菌接產(chǎn)法、逐級凈化法和胚胎移植法,在實際生產(chǎn)中還可使用菌(群)移植技術等手段促進SPF 豬群的腸道健康。

3.1 剖腹產(chǎn)手術法

剖腹產(chǎn)手術法包括子宮切開術和子宮切除術,兩種手術方式都可阻斷母體病原體通過胎盤進入胎兒體內(nèi)。采用子宮切開術可保存優(yōu)良母豬個體,提高其繁殖利用率,但母豬術后護理難度和經(jīng)費需求大幅度增加;子宮切除術無需實施術后護理,但母豬只能利用1 次,術后無害化淘汰。可根據(jù)實際情況選擇手術方式,常用于第1 代(又稱“初代”)SPF 豬群的建立。

手術獲得的新生仔豬通常在隔離環(huán)境或屏障環(huán)境下飼養(yǎng)至斷奶。根據(jù)GB14925-2010《實驗動物環(huán)境及設施》的規(guī)定,屏障環(huán)境和隔離環(huán)境嚴格控制了人員、物品和空氣的進出,對溫度、最大日溫差、相對濕度、換氣次數(shù)、動物籠具處氣流速度、靜壓差、空氣潔凈度、沉降菌濃度、氨濃度、噪聲和照度等環(huán)境技術指標作出了規(guī)定。正壓下屏障環(huán)境和隔離環(huán)境可最大程度地阻斷病原經(jīng)空氣、飲水或物品傳遞等途徑污染舍內(nèi)環(huán)境,適用于SPF 動物的生產(chǎn)、實驗和檢疫。隔離環(huán)境對靜壓差、空氣潔凈度和沉降菌濃度這3 項環(huán)境技術指標的規(guī)定更為嚴格,對隔離籠具、空氣過濾設備的需求更高,程序更復雜、費用更貴。因此,隔離環(huán)境僅推薦用于哺乳期仔豬的人工飼養(yǎng),以提高SPF 仔豬的存活率。

3.2 無菌接產(chǎn)法

為最大化保存和利用優(yōu)良豬種和個體,或從其他豬場或個體散戶購買新生仔豬用于構建或擴大第1 代SPF 豬種群時可采用無菌接產(chǎn)法。該方法涉及新生仔豬的無菌接產(chǎn)、轉(zhuǎn)運、消毒和人工飼養(yǎng)。隨著實驗動物運輸隔離器的研制不斷成熟,目前無菌接產(chǎn)通常采用SPF 動物運輸隔離器或保溫運輸箱等設備[9]進行新生仔豬的轉(zhuǎn)運,有效地保障新生仔豬不受外界病原微生物的污染。此外,隨著無菌動物培育設施的研制成功,亦可利用無菌運輸隔離器[8]等實現(xiàn)新生仔豬的無菌轉(zhuǎn)運。

3.3 逐級凈化法

當母豬群體無烈性或垂直傳播病原,如口蹄疫、豬水泡病、藍耳病、偽狂犬病、細小病毒病、豬瘟等病原時,可通過優(yōu)化飼養(yǎng)設施、加強飼養(yǎng)管理以及藥物治療等方法清除、部分清除或根除場內(nèi)的某些特定豬病病原,建立SPF 豬種群。該方法既能大量地保存優(yōu)良母豬個體,提高仔豬存活率和生長性能,也能有效阻斷外環(huán)境的各類潛在病原的威脅。

3.4 胚胎移植法

豬胚胎移植法主要分為非手術法、腹腔鏡微創(chuàng)手術法和開腹手術法3 種,其中開腹手術是應用最多的豬胚胎移植方法[10]。開腹手術胚胎移植法難度較低,易于學習,受體母豬術后也可再次用于配種或作為受體,但應注意粘連風險。在國內(nèi),戴琦[11]利用胚胎移植培育出了SPF 五指山近交系小型豬群體,實現(xiàn)了對豬瘟、偽狂犬、藍耳病、豬流感病、弓形蟲、布魯氏菌病、衣原體等病原的凈化效果。Niu 等[12]通過基因編輯滅活豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERV)聚合酶基因,通過核移植和胚胎移植手術生產(chǎn)出了具有滅活PERV 的健康仔豬。由此可見,對重要的基因工程豬實施SPF 疫病凈化,不僅能降低異種生物反應器的免疫排斥影響,也防止人畜共患病和重要豬病等病原的傳播,使豬這一物種成為人類異種器官移植最有希望的器官來源[13]。

3.5 菌(群)移植法

仔豬對其周圍環(huán)境的微生物很敏感[14],胃腸道微生物群是通過與母體及其環(huán)境接觸而逐漸形成的[15-16]。因此,對外科手術獲得的新生仔豬盡早接種健康的母源微生物群落來提高SPF 仔豬腸道健康是一個值得嘗試的方向。值得注意的,不少研究揭示了抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene,ARG)隨FMT 沉積到受體動物體內(nèi)并持久存在[17-19],它們提示腸道微生物的早期接種是一種有趣的可能性。通過刺激腸道微生物群在仔豬生長發(fā)育中盡快達到理想的狀態(tài),但是還需要做更多的工作來預測應該使用哪些群落,或更加謹慎地選擇供體、提高對供體來源微生物群的篩選或加工處理,防止?jié)撛诓≡?、ARGs 等從母體或環(huán)境中傳播到幼年動物體內(nèi),影響SPF 豬群的健康。

4 SPF 豬的應用

SPF 豬對飼養(yǎng)設施的要求低于無菌豬和悉生豬,更傾向傳統(tǒng)飼養(yǎng)。因此,在生產(chǎn)中“SPF”這個定義更具商業(yè)價值。

4.1 種豬健康的維持

對種豬進行臨診、病原學和血清學等檢查,通過檢疫和藥物處理等凈化措施淘汰豬瘟、偽狂犬、藍耳病、口蹄疫等重要豬病病原陽性個體;對病原檢查陰性的健康個體保留并按SPF 豬飼養(yǎng)管理策略實施繁育,可有效控制病原的水平傳播和垂直傳染。此外,SPF 狀態(tài)保障了從進口的種豬不會將國家規(guī)定排除的病原體引入本地豬種,但SPF 的狀態(tài)并不能從父母代遺傳給后代,一旦SPF 動物從高生物安全設施中轉(zhuǎn)出,SPF 狀態(tài)將喪失。

4.2 生物安全管理理念的提高

“SPF”突出了豬場生物安全的含義,即通過對病原感染、傳播途徑的控制,降低動物感染、動物產(chǎn)品和環(huán)境的污染,保證養(yǎng)豬生產(chǎn)安全,提高經(jīng)濟效益。生產(chǎn)SPF 豬的農(nóng)場通過精細化管理[2],注重動物福利和生物安全細節(jié),對并借助先進理論和計算機技術對繁育數(shù)據(jù)的分析,將保證SPF 種豬的質(zhì)量。因此,推廣SPF 豬生產(chǎn)管理理念可規(guī)范化養(yǎng)豬生產(chǎn)環(huán)境,保護豬場免遭新發(fā)病原入侵以及防止病原在場內(nèi)不同區(qū)域間的傳播,防止非洲豬瘟等烈性傳染病的再次爆發(fā)和蔓延。

4.3 獸用疫苗和藥物研發(fā)

SPF 豬在疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程中承擔重要作用。利用SPF 豬模型進行臨床藥理學及安全性評價實驗,觀察動物模型對新藥的耐受程度和藥代動力學,可為制定給藥方案提供可靠的且重復性好的結果依據(jù),為新藥或疫苗的批準上市奠定基礎。此外,由于已知的干擾病原體被排除,SPF 豬的血清是豬病檢測試劑盒研發(fā)的理想陰性對照品。

4.4 醫(yī)用豬模型

豬的心血管、泌尿生殖、皮膚、骨骼和消化等系統(tǒng)與人類的相似性促使在研究中更多地使用豬作為研究模型。此外,由于猩猩等靈長類動物在來源、種群規(guī)模、倫理以及經(jīng)費等方面的限制,豬在越來越多的領域用于相關藥品、醫(yī)療器械、化妝品等臨床前動物實驗研究。遺傳、環(huán)境和微生物質(zhì)量均得到控制的SPF 豬作為實驗動物模型可提高相關實驗結果的準確性和穩(wěn)定性,減少實驗誤差和異質(zhì)性問題。

值得注意的是,豬用于生物醫(yī)學研究時可能還要排除流感病毒、腦心肌炎病毒、鉤端螺旋體病、丹毒、旋毛蟲病等其他臨床和亞臨床病原,尤其是作為異種器官移植[20]的醫(yī)用供體豬需要排除的病原微生物檢測指標高達42 種,涉及13 項細菌類、3 項真菌類、9 項寄生蟲類和17 項病毒類指標(BD43/T959.2-2014)。

4.5 生物醫(yī)藥產(chǎn)品原材料

標準化生產(chǎn)的SPF 豬可保證血清、細胞、組織、器官和其他豬源材料的質(zhì)量,具有廣泛的應用價值。比如,SPF 豬的豬皮膠原蛋白提取物適用于生產(chǎn)醫(yī)美注射用膠原蛋白和人軟骨修復產(chǎn)品,豬肺來源的磷脂提取物是治療和預防早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征藥物(商品名“固爾蘇”)的主要成分;SPF 豬的主動脈瓣是心臟瓣膜移植手術中人工生物瓣膜的主要來源;豬骨也可用于制作人種植牙骨粉等。

5 結語

SPF 豬的生產(chǎn)條件低于無菌豬和悉生豬,關鍵是防止特定微生物病原的再感染。但SPF 豬不一定沒有體內(nèi)寄生蟲,可能會發(fā)現(xiàn)蛔蟲、結節(jié)蟲和球蟲的輕度感染,在實驗室使用前可通過糞便或血液等樣本的測試或診斷選擇相關病原陰性SPF 豬個體。未來制定規(guī)范化的SPF 豬生物學特性描述標準,建立規(guī)范而準確的生物學特性數(shù)據(jù)庫,不僅能為我國SPF 豬的繁育和保種提供衡量尺度,更將能提高國產(chǎn)大動物實驗的質(zhì)量水平,為豬源性生物制品的研發(fā)和商品化利用提供基礎性數(shù)據(jù)保障。