李凱欣 陳歡劉方鄰 劉勇侯宏衛(wèi)?胡清源?

(1.國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,煙草生物學(xué)效應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,轉(zhuǎn)化神經(jīng)生物學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450001;2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué),合肥 230026;3.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院,合肥 230031)

藥物依賴涉及社會科學(xué)、心理學(xué)、藥理學(xué)、精神病學(xué)、遺傳學(xué)、行為學(xué)等多個(gè)學(xué)科[1]。煙堿依賴(nicotine dependence,ND)是藥物依賴中影響最廣泛的一類,《2020 年中國吸煙危害健康報(bào)告》顯示,全世界大約有10 億煙民,2018 年中國15 歲以上吸煙率為26.6%,人數(shù)超3 億[2]。煙氣成分非常復(fù)雜,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7000 多種物質(zhì),其產(chǎn)生的神經(jīng)生物效應(yīng)目前主要利用煙堿或煙氣冷凝物等進(jìn)行動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來揭示[3]。煙草具有雙重效應(yīng),積極強(qiáng)化作用主要發(fā)生在依賴的開始階段,包括輕度欣快感、記憶力增強(qiáng)和情緒放松,而吸煙的消極影響則由戒斷引起,包括情緒低落、焦慮和記憶受損,兩者結(jié)合最終導(dǎo)致煙草使用和依賴[4]。

建立具有相應(yīng)表型特征的動物模型是分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)。相較于其他模式生物,嚙齒類動物具有體型較小、性情溫順、易于飼養(yǎng)、繁殖周期短等優(yōu)點(diǎn),且結(jié)構(gòu)、功能、代謝及依賴特點(diǎn)也與人類高度類似,其中煙堿依賴模型的嚙齒類動物以小鼠和大鼠為主。通過模擬煙堿依賴環(huán)境構(gòu)建動物模型,有助于研究腦部組成結(jié)構(gòu)的改變與行為變化的關(guān)系和發(fā)生機(jī)制,包括相關(guān)腦區(qū)的激活、腦部神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化、腦部高級功能的改變等。本文針對各類行為學(xué)測試在ND 研究中的應(yīng)用及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)分析,為ND 動物模型的成癮機(jī)制、腦部功能損傷及行為障礙研究提供有益的參考。

1 煙堿依賴行為的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)

ND 的形成產(chǎn)生了心理障礙和行為障礙雙重影響。而在煙堿成癮的分子機(jī)制的研究中以人為研究對象多有不便,因此動物模型憑借其飼養(yǎng)簡單、繁殖速度快與人類同源性高、可訓(xùn)練等優(yōu)勢成為了較好可替代的研究對象,在煙堿依賴的研究中發(fā)揮著重要作用。在之前的研究中基于多種ND 動物模型的建立,通過微透析、病毒示蹤、光遺傳等技術(shù)發(fā)現(xiàn)煙堿可以引起中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)、前額葉皮層(prefrontal cortex,PFC)、海馬(hippocampus,HP)等與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的變化[5-6]。主要涉及3 大神經(jīng)系統(tǒng):多巴胺能系統(tǒng)、5-羥色胺系統(tǒng)、谷氨酸系統(tǒng),其投射通路如圖1 所示[7]。煙堿作用于煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs),引起腦中相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的變化,激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路,導(dǎo)致神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)及腦部高級功能改變,最終導(dǎo)致ND 形成[8]。

圖1 3 大神經(jīng)系統(tǒng)在大腦相關(guān)腦區(qū)的部分投射Figure 1 Three major nervous systems project to related areas of the brain

1.1 煙堿依賴的獎賞效應(yīng)

ND 引起的獎賞效應(yīng)主要由多巴胺能系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)DA 介導(dǎo),其中DA 主要由中腦基底核的黑質(zhì)(substantia nigra,SN)和VTA 區(qū)產(chǎn)生。煙堿攝入后通過引起NAc 區(qū)DA 的大量釋放使得機(jī)體產(chǎn)生愉悅感,是引起依賴性的主要原因[9]。多巴胺引起獎賞效應(yīng)的通路稱為中腦邊緣通路(mesolimbic pathway)或獎賞通路(reward way)[10]。此外,從黑質(zhì)投射到紋狀體的黑質(zhì)-紋狀體通路,也與ND 行為有關(guān)[11]。因此煙堿導(dǎo)致多巴胺能系統(tǒng)中的DA 釋放異常是形成ND 生理上的主要誘因[12]。心理上主要跟強(qiáng)化作用有關(guān),會逐漸增加產(chǎn)生獎勵感覺的煙堿劑量,即精神依賴行為,是引發(fā)復(fù)吸行為的原因[13-14]。大鼠ND 動物模型微透析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),急性給予煙堿注射或慢性長期煙堿暴露均顯著增加NAc中DA 釋放水平,表明DA 在ND 過程中起到重要作用[15]。煙堿的獎勵作用類似于多巴胺受體的激動劑,可以激活D1 受體來促進(jìn)ND[16]。在嚙齒類動物中煙堿引起的獎賞效應(yīng)主要表現(xiàn)為對煙堿的自主性使用偏好,也是ND 行為的一個(gè)核心特征[17-18]。

1.2 煙堿依賴的戒斷效應(yīng)

煙堿戒斷后引起的戒斷效應(yīng)主要與5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān),在解剖學(xué)上5-羥色胺能神經(jīng)元起源于腦干中縫核群,通常與情感性疾病、自殺、沖動和藥物濫用有關(guān)[19]。該系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)為5-羥色胺,是一種單胺類的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),其在維持突觸的可塑性、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、情緒等方面發(fā)揮了重要作用[8]。5-HT 還可以通過調(diào)節(jié)多巴胺神經(jīng)元上的5-HT 受體來調(diào)節(jié)多巴胺釋放[20],NAc 的多巴胺神經(jīng)元上的5-HT1A 受體可以促進(jìn)DA 釋放[21],而其戒斷效應(yīng)的產(chǎn)生主要是紋狀體和中腦的多巴胺能神經(jīng)元上的5-HT2A 和5-HT2C 受體可以抑制DA 釋放,從而增加焦慮癥狀[22-23]。研究表明慢性煙堿暴露可以引起大腦5-HT 水平升高,可能是易成癮和復(fù)吸的另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素[24],戒斷后其水平下降,提高5-HT 水平有助于減弱復(fù)吸等ND 行為[8],這也解釋了戒煙后會引起焦慮抑郁癥狀與5-HT 神經(jīng)元活動下降有關(guān)[25]。ND 導(dǎo)致的情緒不穩(wěn)定、亢奮不安等現(xiàn)象都與5-HT受體在引起情緒行為異常有關(guān)[26],該效應(yīng)在嚙齒類動物中主要表現(xiàn)為過度梳理、咀嚼、震顫、濕狗抖動(wet-dog shakes)和牙齒打顫,可通過這些行為特征來評價(jià)動物模型產(chǎn)生地戒斷行為[27]。

1.3 煙堿依賴行為的形成

煙堿依賴行為的形成還依賴于谷氨酸能系統(tǒng),其主要參與大腦突觸可塑性、認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶以及發(fā)育過程[23],其中谷氨酸(glutamic acid,Glu)是最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),50%的Glu 參與突觸傳遞,離子型Glu 受體參與學(xué)習(xí)、記憶、藥物依賴及神經(jīng)退行性疾病等多種病理生理過程[28]。嚙齒類動物模型在評價(jià)其煙堿成癮后學(xué)習(xí)和記憶的能力上也有很好的應(yīng)用。煙堿進(jìn)入大腦后可以作用到PFC通過引起Glu 釋放興奮多巴胺神經(jīng)元,產(chǎn)生獎賞效應(yīng)[5]。另一方面,煙堿可以作用到興奮性Glu 神經(jīng)元,形成長時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation,LTP),大腦由神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成并互相連接,煙堿通過谷氨酸能系統(tǒng)增強(qiáng)這些連接,引起大腦的結(jié)構(gòu)的改變。這也是煙堿依賴行為的另一大神經(jīng)基礎(chǔ)。

1.4 煙堿依賴與其他神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系

煙堿在腦中還與其它神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)有相互作用。研究發(fā)現(xiàn),對嚙齒類動物模型給予急性或慢性煙堿處理后,大鼠中腦的去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)釋放都會增多[29]。煙堿通過兩個(gè)途徑來調(diào)控NE 的分泌,一是直接作用到藍(lán)斑末梢的nAChRs;二是間接作用通過GABA 來調(diào)節(jié)NE 的分泌[5]。另外,煙堿通過代謝性GABAB 受體(ABABRs)介導(dǎo)緩慢抑制,調(diào)節(jié)整個(gè)大腦的突觸可塑性[30]。GABA 受體激動劑會降低煙堿誘導(dǎo)的NE釋放增加,阻礙條件位置偏愛(conditioned place preference,CPP)的形成和煙堿的自給藥行為[31]。內(nèi)源性大麻受體也與煙堿的成癮有關(guān)[32]。內(nèi)源大麻受體拮抗劑會減弱中腦邊緣系統(tǒng)多巴胺的活動,從而減弱煙堿獎賞效應(yīng)[33]?？偟膩碚f,多種神經(jīng)遞質(zhì)均參與調(diào)節(jié)了ND 行為的形成。

2 煙堿依賴模型行為學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)煙堿成癮的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ),大腦結(jié)構(gòu)和功能的異?？梢钥偨Y(jié)為精神依賴性、軀體依賴性以及耐藥性3 個(gè)特征。精神依賴性主要體現(xiàn)在初始階段,即動物情緒愉悅、自主活動增加、記憶力增強(qiáng)等促使動物產(chǎn)生心理上渴求。軀體依賴性和耐藥性主要表現(xiàn)為動物的精神活動刺激反應(yīng)增強(qiáng),停止煙堿暴露會導(dǎo)致煙堿戒斷癥狀,如軀體戒斷體征、焦慮和抑郁樣行為、學(xué)習(xí)和記憶缺陷、煩躁不安等。ND 動物模型的行為學(xué)測試包括行為偏好、學(xué)習(xí)與記憶、認(rèn)知和決策功能、情緒、運(yùn)動協(xié)調(diào)能力等5 大方面,通過這些實(shí)驗(yàn)有助于建立及評估ND 模型(見圖2)。

圖2 嚙齒類動物煙堿依賴模型行為學(xué)評價(jià)Figure 2 Behavioral evaluation of nicotine dependence models in rodents

2.1 行為偏好訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)

行為偏好訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)主要通過特定的儀器及模擬成癮過程的訓(xùn)練方式給予動物致癮性藥物或?qū)φ瘴?使動物將致癮性物質(zhì)和環(huán)境建立聯(lián)系,最終產(chǎn)生偏好。利用嚙齒類動物建立與人類一致的ND行為,從而進(jìn)一步研究該動物模型的依賴程度及分子機(jī)制。行為偏好訓(xùn)練主要分為自身給藥模型、自給光模型、條件性位置偏愛模型、行為敏化模型等[34]。嚙齒動物對煙堿的依賴可以通過反復(fù)注射煙堿、通過滲透微泵長期輸注煙堿、口服煙堿、卷煙煙氣暴露、煙堿霧化暴露和含煙堿電子煙氣溶膠暴露等不同的給藥方式來獲得。行為偏好訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要從可靠性、測試效度、實(shí)用性和敏感性4 個(gè)方面來進(jìn)行評估。

2.1.1 自給藥實(shí)驗(yàn)

自給藥實(shí)驗(yàn)(self-administration test,SA)是通過操作性條件反射測試箱(operant conditioning test box)對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行自我給藥訓(xùn)練,其最顯著的特征是其獲取煙堿的方式是完全自主行為(壓桿或者鼻觸)[35]。大小鼠煙堿的靜脈給藥濃度范圍為0.03～0.1 mL/kg,過低不足以形成藥物依賴,過高會導(dǎo)致煙堿厭惡[36]。訓(xùn)練的程序設(shè)定有固定比率和累進(jìn)比率兩種,比較動物在每個(gè)階段的壓桿或鼻觸次數(shù)在不同程序中的變化[37],成癮后的戒斷階段即斷點(diǎn)可以評價(jià)其成癮性的高低及動物覓藥渴求程度的高低[38]。靜脈自給藥模型中實(shí)驗(yàn)動物能夠很好的模擬用藥者主動覓藥過程和用藥行為,可以精準(zhǔn)掌握藥物的攝入劑量,是研究藥物成癮的經(jīng)典模型,但缺點(diǎn)是動物手術(shù)難度高、操作難度大,失敗率較高[39-40]。目前已經(jīng)開發(fā)出了更能模擬煙氣吸入方式的煙堿自給藥模型,如新型氣溶膠吸入式的煙堿自給藥模型[41],通過動物自主鼻觸釋放含有不同濃度煙堿的電子煙氣溶膠(20,40,80 mg/mL)[42]。用于評價(jià)含煙堿或煙堿鹽等不同類型的煙堿產(chǎn)品,氣溶膠自給藥模型還可用于評價(jià)卷煙煙氣和電子煙氣溶膠中其他復(fù)雜的化學(xué)成分和添加劑等對煙堿依賴的增強(qiáng)特性,但氣溶膠釋放穩(wěn)定性的精準(zhǔn)控制和動物實(shí)際攝入藥物劑量的準(zhǔn)確評價(jià)仍是技術(shù)難點(diǎn)。

自身給藥訓(xùn)練能夠準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)用藥次數(shù)。在結(jié)構(gòu)效度上與人類成癮機(jī)制類似,充分反映了動物的主觀要求,可信度高,但是也有局限性,不能很好的反映無藥可用時(shí)的強(qiáng)烈渴求狀態(tài)。

2.1.2 條件位置偏愛實(shí)驗(yàn)

條件位置偏好實(shí)驗(yàn)(conditional position preference,CPP)是根據(jù)巴普洛夫條件反射原理建立起來的動物模型,主要通過給予動物獎賞或厭惡刺激或者對照溶劑,使得動物對注射的物和環(huán)境之間建立聯(lián)系。其通常由3 個(gè)隔間構(gòu)成,兩個(gè)隔間的環(huán)境必須具有差異性,在空間配置、顏色、地板甚至其他感覺上都要形成對比,中間的隔間用于適應(yīng)環(huán)境。煙堿訓(xùn)練時(shí)選擇在白箱注射煙堿,黑箱注射生理鹽水,多次操作后可以讓動物對環(huán)境和煙堿形成條件性匹配[43]。目前已成功建立的煙堿CPP 模型,在0.1～1.4 mg/kg 的劑量范圍內(nèi)均可誘發(fā)大鼠CPP[44]。此外利用CPP 訓(xùn)練給予獎勵性刺激來研究獎賞系統(tǒng)的相關(guān)神經(jīng)通路也是研究成癮的重要手段[44]。嚙齒類動物可以通過CPP 訓(xùn)練來構(gòu)建ND 模型后進(jìn)而評價(jià)其對學(xué)習(xí)記憶的影響[45]以及對性別差異造成的偏好差異進(jìn)行評價(jià)[46-47]。

CPP 動物模型的構(gòu)建原理依托于低級神經(jīng)系統(tǒng)支配的低級反射活動,訓(xùn)練更為簡易且廉價(jià),實(shí)驗(yàn)周期也較短,因此其在成癮行為模型構(gòu)建中也有十分廣泛的應(yīng)用,比較適用于數(shù)據(jù)量較大的實(shí)驗(yàn),且數(shù)據(jù)較離散。

2.1.3 行為敏化訓(xùn)練

行為敏化訓(xùn)練主要基于“神經(jīng)激勵敏化”理論,即對成癮藥物從“喜歡”到“需要”的心理活動的一種轉(zhuǎn)變[8],行為敏化的建立過程包括3 個(gè)階段,即形成期、轉(zhuǎn)換期和表達(dá)激發(fā)期。形成期每天對動物進(jìn)行煙堿注射,持續(xù)5～7 d;轉(zhuǎn)換期停止給藥,戒斷4～7 d,在這一期間動物行為轉(zhuǎn)變?yōu)槊艋?表達(dá)激發(fā)期動物接受煙堿注射后可激發(fā)動物行為敏化,其自發(fā)性活動明顯的增加。通過3 個(gè)時(shí)期的訓(xùn)練,動物從對煙堿的高活動性轉(zhuǎn)變?yōu)樾袨槊艋?。動物行為敏化?xùn)練后會產(chǎn)生運(yùn)動行為增加等成癮性運(yùn)動效應(yīng)[48],煙堿通過直接或間接方式引起腦內(nèi)DA 水平升高后,直接表現(xiàn)是動物活動性增加[49]。嚙齒類動物通常表現(xiàn)為在相對狹窄的空間內(nèi)運(yùn)動行為增加和反復(fù)行為的增加(如咀嚼、搖頭和撓癢),實(shí)驗(yàn)中可以進(jìn)一步用運(yùn)動協(xié)調(diào)能力實(shí)驗(yàn)來評價(jià)成癮性高低。

目前成癮致敏理論已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同,具有良好的理論和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),并且操作簡單易行,實(shí)驗(yàn)周期較短,評價(jià)方法直觀,是一種良好的ND 以及抗成癮藥效評價(jià)。

2.2 決策與認(rèn)知實(shí)驗(yàn)

長期煙堿暴露會導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,影響與決策有關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和大腦功能,可以利用風(fēng)險(xiǎn)決策實(shí)驗(yàn)來檢測動物的決策能力受損程度。嚙齒類動物決策和認(rèn)知評價(jià)實(shí)驗(yàn)包括大鼠博弈任務(wù)(rat gambling task,RGT)、概率折扣任務(wù)(probability discounting task,PDT)、延遲獎勵任務(wù)以及大鼠氣球模擬風(fēng)險(xiǎn)決策任務(wù)(rat balloon analog risk task,RBART)等[50]。良好決策行為的基礎(chǔ)包括了獎賞、情緒、學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動執(zhí)行等多個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)[8]。大腦功能損傷可能導(dǎo)致認(rèn)知障礙、行為異常等現(xiàn)象,“從認(rèn)知改善到復(fù)發(fā)預(yù)防”已經(jīng)被作為成癮障礙輔助治療的思路[51]。神經(jīng)遞質(zhì)如DA、5-HT 等也參與調(diào)節(jié)風(fēng)險(xiǎn)決策及多種認(rèn)知功能[52]。通過PDT 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),成癮會導(dǎo)致眶額皮層和額葉皮質(zhì)受損,進(jìn)而影響決策。決策認(rèn)知測試可以評價(jià)大小鼠煙堿偏好訓(xùn)練中的決策行為及認(rèn)知水平[53],延遲獎勵任務(wù)中的沖動選擇可以預(yù)測煙堿戒斷后的再次使用情況[54]。

2.3 動物情緒測試實(shí)驗(yàn)

由戒煙導(dǎo)致的身體、情感和認(rèn)知癥狀組成的戒斷綜合征,是復(fù)吸的危險(xiǎn)因素[55]。這些戒斷癥狀在停止煙堿暴露后的第1 周內(nèi)最為明顯,其中焦慮和抑郁樣的行為,以及學(xué)習(xí)和記憶缺陷甚至?xí)掷m(xù)數(shù)月[56]。嚙齒類動物的情感癥狀比軀體癥狀更微妙,因此評估需要一系列行為分析來揭示與戒斷相關(guān)的情感變化(單一測試不行)。情緒測試主要包括高架迷宮(elevated plus maze,EPM)、零迷宮(zero maze)或O 型迷宮(O Maze)、蔗糖偏好測試(sucrose preference test,SPT)、懸尾測試(tail suspension test,TST)、強(qiáng)迫游泳測試(forced swim test,FST),顱內(nèi)自我刺激(intracranial self-stimulation,ICSS)等[57],通過ND 動物的情緒狀態(tài)可以反映戒斷癥狀的嚴(yán)重程度。EPM 用來測試動物煙堿暴露后的焦慮情況[58],EPM 容易測試和記錄,不需要預(yù)訓(xùn)練,但依賴于嚙齒動物的探索性[59]。小鼠在O 迷宮開放臂探索的時(shí)間減少反映了其在攝入煙堿后的焦慮行為[60]。SPT 和FST 用于煙堿戒斷期間動物快感缺乏和抑郁的測試[61-62],小鼠在煙堿戒斷過程中,蔗糖偏好程度下降[63]。FST 測試表明煙堿戒斷模型中其絕望行為增加表現(xiàn)為不運(yùn)動,為了排除運(yùn)動性能不足,可以補(bǔ)充耐力游泳測試[62]?？旄腥狈κ墙鋽嗟陌Y狀之一,ICSS 可用于評估戒斷過程中的快感缺乏[64],也作為評估煙堿暴露和急性、慢性戒斷煙堿給藥的方法[65]。

2.4 學(xué)習(xí)記憶能力實(shí)驗(yàn)

大腦中α7 和α4β2 的nAChRs 在與學(xué)習(xí)和記憶至關(guān)重要的腦區(qū)如海馬和大腦皮層中大量表達(dá)[66],小鼠接觸電子煙氣溶膠或戒煙后,其戒斷癥狀如學(xué)習(xí)和記憶缺陷會從第1 天持續(xù)到第90 天[67]。煙堿長期作用于nAChRs 會導(dǎo)致其脫敏,對動物的學(xué)習(xí)和記憶能力有一定的影響。迷宮類實(shí)驗(yàn)是研究嚙齒類動物學(xué)習(xí)、記憶和空間定向以及認(rèn)知能力常用的實(shí)驗(yàn)儀器,主要包括T 迷宮、Y 迷宮、水迷宮、八壁迷宮等類型[68],在評估ND 動物模型的認(rèn)知下降、海馬結(jié)構(gòu)損傷和煙堿對空間記憶的影響時(shí)常使用此迷宮進(jìn)行測試,已發(fā)現(xiàn)煙堿暴露模型中雄性小鼠的注意力和工作記憶有顯著缺陷[69]。運(yùn)用八臂迷宮評估發(fā)現(xiàn)小鼠煙堿暴露后存在空間記憶和參考記憶缺陷[70]。此外還可以采用不同的學(xué)習(xí)記憶方式,如改進(jìn)的高架迷宮測試、情境恐懼條件反射測試、被動回避測試和物體識別測試評價(jià)ND 及戒斷過程中的學(xué)習(xí)記憶能力。

2.5 運(yùn)動協(xié)調(diào)能力實(shí)驗(yàn)

低劑量的煙堿會增加小鼠和大鼠的運(yùn)動活性并引起運(yùn)動敏化。通過對嚙齒類動物進(jìn)行感覺測試、運(yùn)動測試、反射測試和梁平衡測試,來評估其神經(jīng)缺陷和神經(jīng)損傷的級別[71]。其評價(jià)測試包括:曠場實(shí)驗(yàn)(open-field test,OFT)、轉(zhuǎn)棒測試(rotarod test,RRT)、橫梁行走、握力測試和網(wǎng)格行走測試(grid walk test,GWT)等。OFT 用來評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物在空闊的環(huán)境中的各種行為發(fā)生情況[72],通過記錄分析發(fā)現(xiàn)煙堿戒斷后動物存在顫抖、搖晃、跳躍、后退、點(diǎn)頭、咀嚼、站立、抓撓、梳理、打轉(zhuǎn)、挖洞、腹部收縮、舔舐等狀態(tài)的異常[56]。RRT 和橫梁行走可以測量運(yùn)動協(xié)調(diào)和平衡,用于測試攝入煙堿形成依賴后對運(yùn)動協(xié)調(diào)可能產(chǎn)生的副作用,評估其感覺運(yùn)動神經(jīng)功能缺損[73]。通過橫梁行走測試能夠檢測ND帶來的精細(xì)運(yùn)動缺陷[73]。抓力測試評價(jià)了煙堿對動物肢體肌肉的影響,網(wǎng)格行走測試主要可以對運(yùn)動異常和行為缺陷進(jìn)行評估[74];這些測試大多數(shù)都需要自動化設(shè)備和軟件來進(jìn)行視頻分析。

2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集及分析方法

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)需要對指標(biāo)進(jìn)行客觀判斷,觀察過程中不能影響動物的正常活動,盡量保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。目前對于動物行為學(xué)的測試可以借助儀器設(shè)備進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,包括數(shù)據(jù)信息、視頻信息、聲音信息等[75](見圖3)。圖像處理法能夠?qū)游镄袨檫M(jìn)行更靈活、精細(xì)、全面的測量,目前已成為最受歡迎的行為識別技術(shù)[76]。Peleh 等[77]發(fā)明一種跟蹤和分析工具,用于小鼠組的行為觀察?，F(xiàn)已開發(fā)了多種軟件分析系統(tǒng)及算法設(shè)計(jì),基本流程如下圖所示,可以在線對運(yùn)動軌跡、劃分區(qū)域內(nèi)嚙齒類動物各種行為特征進(jìn)行分析,生成運(yùn)動軌跡熱圖和各類圖表,提高動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)效率。

圖3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集及分析流程Figure 3 Experimental data acquisition and analysis process

3 小結(jié)

煙堿成癮機(jī)制非常復(fù)雜,如何評價(jià)動物模型的依賴程度高低及其戒斷癥狀是值得深入探討的問題。開展ND 的形成、維持和復(fù)吸等相關(guān)機(jī)制研究,首要挑戰(zhàn)是開發(fā)具有更高更有效性的依賴和戒斷的動物模型及行為學(xué)評價(jià)模型。通過多種暴露方法建立ND 模型及煙堿戒斷動物模型,可以從成癮程度的高低、戒斷癥狀的輕重、藥物治療的效果等多個(gè)方面進(jìn)行評價(jià)。

在行為學(xué)測試中,除檢測方法、技術(shù)參數(shù)外,還有很多因素會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響,應(yīng)得到足夠的重視。首先給藥方式的選擇上應(yīng)更接近于煙草產(chǎn)品的實(shí)際使用情況。其次應(yīng)不斷開發(fā)更完善的測試方法及行為學(xué)自動化記錄分析儀器設(shè)備,以減少外界影響,提升數(shù)據(jù)采集分析的客觀性和準(zhǔn)確性。另外現(xiàn)有研究大部分只使用成年雄性嚙齒類動物來評估煙堿戒斷及藥物治療的影響。為了提高各種ND 模型的預(yù)測效度,可以開發(fā)更有效的動物依賴和戒斷模型研究ND 及戒斷后的癥狀。此外探究ND 與性別和年齡的差異將對人類ND 的治療有更大的意義,可能會促進(jìn)新的藥物療法的發(fā)展,減輕ND 及戒斷的癥狀。將有望全面揭示相關(guān)腦區(qū)和神經(jīng)環(huán)路,神經(jīng)遞質(zhì)等分子機(jī)制。