陳晨 田甜 于嘯 孫文瑜 婁艷輝

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266100 1 婦科； 2 護(hù)理院感部)

高級別漿液性卵巢癌(high-grade serous ova-rian cancer, HGSOC)是上皮性卵巢癌最常見的病理類型，腫瘤具有較高的惡性生物學(xué)行為，極易發(fā)生廣泛的盆腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅卵巢癌患者的生命安全。因此，探討HGSOC侵襲轉(zhuǎn)移的可能分子機制具有重要意義[1]。微小核糖核酸(miRNA)作為調(diào)節(jié)性短非編碼核糖核酸，通過調(diào)節(jié)多種信號通路進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[2]。miR-181a-5p是miR-181家族的重要成員之一，研究表明miR-181a在肝癌及乳腺癌等多種實體腫瘤及血液腫瘤中異常表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)特性，并且在Wnt/β-連環(huán)蛋白和TGF-β信號通路當(dāng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[2-3]。然而，有關(guān)miR-181a-5p在HGSOC中的表達(dá)特點及功能尚不十分明確。中胚層特異性轉(zhuǎn)錄基因(MEST)是一種父源性印記基因，位于染色體7q32，在胎兒組織中表現(xiàn)出來自父系等位基因的優(yōu)先表達(dá)，MEST啟動子的異常甲基化與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p與MEST之間存在靶向結(jié)合位點，因此推測二者之間可能存在一定的功能調(diào)控關(guān)系。本研究通過檢測miR-181a-5p與MEST在卵巢癌組織中的表達(dá)，旨在初步探討二者的表達(dá)特征及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1一般資料 選取2019年7月—2021年11月我院因HGSOC行手術(shù)治療的卵巢癌患者56例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放療及化學(xué)治療，患者的最終診斷均經(jīng)病理檢查證實。術(shù)前簽署患者知情同意書，留取患者術(shù)中新鮮的卵巢癌組織作為研究樣本。收集同期因子宮肌瘤行子宮+雙附件手術(shù)切除的56例患者的正常的卵巢及輸卵管傘端組織作為對照。分別取卵巢癌患者的卵巢癌組織及對照組正常卵巢組織、正常輸卵管傘端組織各約1 cm×1 cm×1 cm大小，在離體30 min內(nèi)置于裝有RNA保存液的凍存管中轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測卵巢癌組織、正常卵巢組織及正常輸卵管傘端組織中miR-181a-5p和MEST的表達(dá) 各取卵巢癌組織、正常卵巢組織及正常輸卵管傘端組織100 mg于勻漿器中，利用研磨器研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol試劑處理，轉(zhuǎn)移勻漿至無RNAase的EP管中，在4 ℃下離心20 min后取上清液，之后步驟均嚴(yán)格按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作。使用紫外分光光度計測定260、280 nm波長處的RNA樣本濃度以及吸光度(A)值，當(dāng)1.8

表1 引物名稱及其序列

1.1.3一般資料的收集 收集卵巢癌患者的一般資料，包括年齡、體質(zhì)量、術(shù)前血清中CA125水平、腫瘤臨床分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.2 基礎(chǔ)研究

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞SKOV3(購自美國典型微生物菌種保藏中心)接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1～2 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到約80%且生長良好時，用胰蛋白酶消化后每瓶細(xì)胞以1∶3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，或直接加入細(xì)胞凍存液置于-80 ℃冰箱凍存，用于后續(xù)雙熒光素酶實驗。

1.2.2雙熒光素酶報告基因驗證miR-181a-5p與MEST的靶向關(guān)系 ①采用TargetScan(www.targetscan.org)和miRanda(www.microrna.org)生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-181a-5p與MEST是否存在靶向結(jié)合位點。②利用雙熒光素酶試劑盒(購自大連美倫生物科技有限公司)進(jìn)行驗證：采用PCR技術(shù)將含miR-181a-5p結(jié)合位點的MEST核苷酸序列片段插入野生型(WT)熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建MEST-WT質(zhì)粒；同時，應(yīng)用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點突變后，插入突變型(MUT)熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建MEST-MUT質(zhì)粒。將miR-181a-5p分子模擬物(mimics)以及其陰性對照序列(NC mimics)分別與MEST-WT、MEST-MUT質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，分為4組：MEST-WT+NC mimics、MEST-WT+miR-181a-5p mimics、MEST-MUT+NC mimics及MEST-MUT+miR-181a-5p mimics組；在轉(zhuǎn)染前24 h，首先取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞在24孔板鋪板(確保轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度在50%～70%)；按照脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen 公司)說明書要求向1.5 mL EP管中先后加入10 μL無血清培養(yǎng)基、適量待轉(zhuǎn)染的試劑以及脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑，靜置10 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入24孔板中，充分混勻，培養(yǎng)6～8 h后換成有血清的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，參照雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測試劑盒的說明書檢測熒光素酶活性，熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 3種組織miR-181a-5p及MEST表達(dá)量比較

測定miR-181a-5p在卵巢癌、輸卵管傘端及正常卵巢組織中的相對表達(dá)量分別為0.383±0.165、0.987±0.036和0.996±0.050，MEST在卵巢癌、輸卵管傘端以及正常卵巢組織中的相對表達(dá)量分別為4.016±0.182、0.993±0.045和1.004±0.048，3種組織中miR-181a-5p和MEST相對表達(dá)量比較差異均有顯著性(F=123.236、234.764，P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果則顯示，miR-181a-5p與MEST的相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.985，P<0.01)。

2.2 卵巢癌組織中miR-181a-5p及MEST表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

卵巢癌組織中miR-181a-5p及MEST的表達(dá)與患者年齡及體質(zhì)量無關(guān)(P>0.05)；miR-18a-5p及MEST的表達(dá)與腫瘤FIGO分期有關(guān)，其中Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者miR-181a-5p的表達(dá)高于Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者M(jìn)EST的表達(dá)低于Ⅲ～Ⅳ期(χ2=15.002、33.547,P<0.05)；miR-181a-5p及MEST表達(dá)與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=7.844、11.187,P<0.05)；miR-181a-5p以及MEST表達(dá)與患者血清中CA125的表達(dá)水平有關(guān)(χ2=19.575、4.548，P<0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組織中miR-181a-5p、MEST的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 雙熒光素酶實驗驗證miR-181a-5p與MEST靶向結(jié)合位點

通過生物信息學(xué)分析預(yù)測到miR-181a-5p與MEST存在靶向結(jié)合位點，見圖1。miR-181a-5pmimics+MEST-WT組SKOV3細(xì)胞的熒光素酶的活性為0.41±0.23，NC mimics+MEST-WT組為0.98±0.04，兩組比較差異有顯著性(t=8.726,P<0.05)；miR-181a-5p mimics+MEST-MUT組SKOV3細(xì)胞的熒光素酶活性為0.97±0.01，NC mi-mics+MEST-MUT組為0.98±0.04，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-181a-5p 能抑制MEST-WT的熒光素酶活性，而對MEST-MUT無影響，驗證了miR-181a-5p與MEST存在靶向結(jié)合位點。

圖1 miR-181a-5p與MEST的核苷酸序列結(jié)合位點

3 討 論

HGSOC是上皮性卵巢癌中最常見的一種病理類型，因其惡性程度高、侵襲性強，早期無明顯臨床癥狀及體征，70%～80%的患者診斷時已為晚期，居女性生殖系統(tǒng)疾病患者病死率的首位。廣泛盆腹腔轉(zhuǎn)移是HGSOC臨床進(jìn)展的主要特征，也是最終導(dǎo)致病人死亡的主要原因，然而有關(guān)其侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制仍不十分明確。由于其具有極易發(fā)生轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的特性，在治療上依然面臨著極大的難題[6-7]。因此，探討卵巢癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能分子機制，尋找其治療靶點顯得尤為重要。

miRNA作為調(diào)節(jié)性短非編碼核糖核酸，通過調(diào)節(jié)多種信號通路參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。miR-181家族現(xiàn)有8個成熟序列[8]。近年來的研究結(jié)果顯示，miR-181a-5p在多種實體腫瘤組織如宮頸癌[9]、直腸癌[10]、肝癌[11]等組織中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-181家族受Wnt/β-catenin信號通路以及競爭性內(nèi)源性RNA等多種機制的調(diào)節(jié)，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2,12]。研究顯示，miR-181a-5p在宮頸癌組織中受CCAT1的調(diào)控而表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而上調(diào)MMP14表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲[9]。在直腸癌中，miR-181a-5p的表達(dá)受到癌基因CRNDE的抑制，進(jìn)而激活Wnt通路，促進(jìn)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[10]。然而，有關(guān)miR-181a-5p在卵巢癌中的表達(dá)尚存在不一致的報道[13-14]，其在卵巢癌中的表達(dá)和功能調(diào)控可能存在較為復(fù)雜的分子機制。本研究結(jié)果顯示，miR-181a-5p在卵巢癌組織中低表達(dá)，Ⅰ～Ⅱ期的卵巢癌患者miR-181a-5p的表達(dá)高于Ⅲ～Ⅳ期,而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miR-181a-5p在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，但相關(guān)分子調(diào)控機制目前尚不明確。

MEST是一種父源性印記基因，主要通過組織特異性及啟動子甲基化調(diào)控的印記丟失參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。有研究表明，MEST在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖過程。敲除乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MEST的表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，MEST的過度表達(dá)可以降低ZFP57對Wnt/β-catenin途徑的抑制作用[15-17]。然而，有關(guān)MEST在卵巢癌表達(dá)及臨床意義尚少見報道。本研究通過檢測HGSOC組織中MEST表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MEST表達(dá)水平明顯增高并與miR-181a-5p表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，且Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者M(jìn)EST的表達(dá)低于Ⅲ～Ⅳ期患者。結(jié)果表明，卵巢癌組織中miR-181a-5p與MEST間似乎存在某種調(diào)控關(guān)系。本研究再通過生物學(xué)分析預(yù)測并驗證了miR-181a-5p與MEST之間存在有意義的靶向結(jié)合位點，低表達(dá)的miR-181a-5p可能失去了對MEST表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。有研究顯示，miR-181a-5p作為抑癌基因可抑制Wnt信號通路的活性，通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[18-19]，而MEST的高甲基化通過維持β-catenin蛋白穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生，也與Wnt/β-catenin信號通路的激活密切相關(guān)[5]。另有研究顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的內(nèi)皮細(xì)胞釋放的同家族成員miR-181c可以下調(diào)MEST表達(dá)，使Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，可以推測miR-181a-5p與MEST間的互作調(diào)控可能與Wnt/β-catenin信號通路的活性密切相關(guān)，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

本研究還顯示，miR-181a-5p及MEST的表達(dá)水平均與血清中CA125的表達(dá)相關(guān)，從而為進(jìn)一步探討兩者聯(lián)合血清中CA125檢測在卵巢癌診斷、治療以及隨訪中的作用奠定了基礎(chǔ)。

總之，本研究結(jié)果顯示，miR-181a-5p在高級別漿液性卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，可能通過調(diào)控MEST表達(dá)在腫瘤進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑癌基因的功能。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(zhǔn)(文件號QYFYWZLL26953)。所有試驗過程均遵照《人體醫(yī)學(xué)研究的倫理準(zhǔn)則》的條例進(jìn)行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent：All experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Document No.QYFYWZLL26953).All experiments were conducted in accor-dance with The Regulations of The Code of Ethics for Human Medical Research.Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻(xiàn)：陳晨、田甜、孫文瑜參與了研究設(shè)計；陳晨、于嘯、婁艷輝參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：The study was designed byCHENChen,TIANTian, andSUNWenyu.The manuscript was drafted and revised byCHENChen,YUXiao, andLOUYanhui.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.