朱博文 黃煜 俞冬熠 顏莉莉 張清宇 宋黃貝

(1 青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院婦科中心，山東 青島 266034； 2 洛陽市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科；3 青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院遺傳科)

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)曾定義為：妊娠20周前的連續(xù)3次或3次以上孕齡婦女妊娠物的丟失，在育齡婦女中約占1%～3%[1]。目前研究人員及臨床醫(yī)生將RSA重新定義為：與同一性伴侶發(fā)生連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)[2]，在育齡期婦女中所占的比例約為4.1%[3]。目前已知其病因復(fù)雜多樣，其中已被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的因素包括：染色體異常、生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常、免疫功能缺陷、內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、感染因素、男方精液異常、血栓形成傾向及環(huán)境因素等。在世界范圍內(nèi)，因染色體異常而反復(fù)流產(chǎn)的夫婦有2%～8%[4]，流行病學(xué)上最常見的原因是胎兒染色體異常，約占RSA病因的50%～60%[5]。研究表明每多一次連續(xù)自然流產(chǎn)會(huì)增加再次妊娠流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，連續(xù)3次自然流產(chǎn)，再次妊娠流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)達(dá)45%[6-7]。由于目前尚缺乏大樣本RSA絨毛組織染色體研究，且現(xiàn)常用的絨毛染色體檢測方法存在不足之處，因此，選擇一種全面、精確的檢測方法對(duì)在基因水平上進(jìn)一步診斷RSA病因來說，顯得尤為重要。本研究采用高通量基因測序技術(shù)即下一代測序技術(shù)(NGS)對(duì)RSA患者絨毛組織進(jìn)行遺傳學(xué)分析，旨在探討RSA相關(guān)因素與絨毛染色體異常之間可能存在的關(guān)系，以及NGS在RSA遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床上合理指導(dǎo)下次妊娠提供依據(jù)和參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象及分組

1.1.1研究對(duì)象 選取2017年7月—2018年2月就診于青島市婦女兒童醫(yī)院的RSA患者29例。納入標(biāo)準(zhǔn)為:①平時(shí)月經(jīng)規(guī)律；②無停經(jīng)后藥物服用史；③無內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)疾??；④無TORCH感染史；⑤無生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常及器質(zhì)性病變；⑥無有害物質(zhì)接觸史；⑦臨床病史、體征、B超及血HCG檢測均提示難免流產(chǎn)或胚胎停育；⑧排除人工流產(chǎn)及藥物流產(chǎn)。病人平均年齡(32.55±5.34)歲，妊娠時(shí)間(73.52±11.92)d。本研究已獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病人及家屬均知情同意。

1.1.2分組 ①依據(jù)是否原發(fā)性RSA分組：Ⅰ組為原發(fā)性RSA組，Ⅱ組為繼發(fā)性RSA組；②依據(jù)年齡分組：Ⅰ組為22～34歲，Ⅱ組為35歲及以上；③依據(jù)流產(chǎn)次數(shù)分組：Ⅰ組為連續(xù)2次自然流產(chǎn)，Ⅱ組為2次以上自然流產(chǎn)；④依據(jù)孕周分組：Ⅰ組為妊娠周數(shù)≤10周，Ⅱ組為妊娠周數(shù)>10周。

1.2 樣本準(zhǔn)備及絨毛染色體檢測方法

所有患者術(shù)前均簽訂知情同意書，行清宮術(shù)無菌獲取絨毛組織，生理鹽水清洗血污，于我院遺傳科BGISEQ-1000測序儀(基于CG測序平臺(tái))上行高通量測序。具體操作如下：提取絨毛組織全基因組DNA，超聲打斷儀將提取的DNA打斷成小片段核酸，構(gòu)建小片段DNA文庫，上機(jī)測序并進(jìn)行遺傳信息分析，通過軟件轉(zhuǎn)換及計(jì)算，得到異常染色體圖譜。檢測結(jié)果參考人類基因組hg19版本和DGV、DECIPHER、OMIM及PubMed等公共數(shù)據(jù)庫已公布的數(shù)據(jù)而確定的。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，染色體檢測率用百分比表示，組間比較采用Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胚胎絨毛染色體核型分析

應(yīng)用NGS 技術(shù)29例絨毛組織染色體均檢測成功，成功率為100%。檢出正常的染色體標(biāo)本7例(24.1%)，異常的標(biāo)本22例(75.9%)；異常的22例中染色體數(shù)目異常21例(95.5%)，其中三體型17例(77.3%)，單體4例(18.2%)，結(jié)構(gòu)異常1例(4.5%)，三體以16-三體最多見(22.7%)。異常核型見表1。

表1 胚胎絨毛組織染色體核型分析

2.2 RSA與其相關(guān)因素分析

29例患者中胚胎染色體異常發(fā)生率與其是否原發(fā)性RSA、年齡、流產(chǎn)次數(shù)及其孕周無關(guān)(P>0.05)，但繼發(fā)、高齡、多次流產(chǎn)史、孕周小等因素可能與RSA的發(fā)生相關(guān)，此類患者其胚胎染色體異常發(fā)生率有較高趨勢。染色體核型分析見表2。

表2 不同組間胚胎染色體核型分析[例(χ/%)]

3 討 論

RSA是孕齡期婦女妊娠期常見的并發(fā)癥之一。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，連續(xù)2次流產(chǎn)史的育齡婦女再次成功妊娠的概率約為75%，連續(xù)3次約為70%，4次以上的成功率僅為50%[8]。染色體異常是RSA最常見的原因，包括流產(chǎn)病人夫妻雙方的染色體異常、胚胎來源染色體異常及其他因素如遺傳印記異常、單親二倍體(UPD)、偏斜X-染色體失活等，而胚胎染色體異常是主要原因。研究指出，染色體異常率隨著流產(chǎn)次數(shù)增多而增高[9]。本研究的29例RSA絨毛組織中，流產(chǎn)2次者18例(62.1%，18/29)，染色體異常率為66.7%(12/18)；流產(chǎn)2次以上者11例(37.9%，11/29),染色體異常率為90.9%(10/11)，與該報(bào)道相符。但有研究卻表明，正常發(fā)育胚胎染色體異常率為3.33%，發(fā)生1次自然流產(chǎn)、2次自然流產(chǎn)、3次及以上流產(chǎn)的染色體異常率分別為44.44%、57.50%、34.88%，認(rèn)為隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，染色體核型異常率反而降低，與本研究不符[10]。這可能與檢測手段的靈敏性、精確性以及樣本量大小有關(guān)。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)不同流產(chǎn)次數(shù)RSA患者間染色體異常率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與相關(guān)研究結(jié)果一致[11-12]，表明多次自然流產(chǎn)史可能并不是影響胎兒染色體異常的主要因素，考慮更多其他因素如解剖、免疫、內(nèi)分泌、感染等因素參與了RSA的發(fā)生。

本研究中入組的29例RSA患者絨毛染色體異常率為76%,高于之前研究報(bào)道的29%～50%的結(jié)果[13]。其中，以染色體數(shù)目異常為主，最常見的是染色體三體。三體性通常來源于母體減數(shù)分裂過程中的不分離，與產(chǎn)婦的年齡密切相關(guān)[14]。許多報(bào)道表明，高齡產(chǎn)婦的年齡是一個(gè)與染色體非整倍性有關(guān)的重要因素，基于高齡產(chǎn)婦染色體異常率大于年輕產(chǎn)婦，分析認(rèn)為高齡是單次和RSA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[15]。KROON等[16]的研究表明，35歲以上婦女的胚胎非整倍體發(fā)生率明顯高于35歲以下婦女。本研究結(jié)果也顯示，高齡產(chǎn)婦(≥35歲)染色體非整倍體發(fā)生率高于低齡產(chǎn)婦，即隨著產(chǎn)婦年齡的增長，胚胎染色體非整倍體率亦升高，與以往報(bào)道結(jié)果一致[17]。研究表明，在異常非整倍體中，16三體占比最高，稱為“流產(chǎn)染色體”，其后是X單體和22單體，且在高齡產(chǎn)婦(≥35歲)和年輕產(chǎn)婦(<35歲)中絨毛染色體異常發(fā)生率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本研究結(jié)果是一致的[18]。而STEPHENSON等[19]報(bào)道自然流產(chǎn)最常見的三體征是15三體，其次是16、22三體，與本研究結(jié)果不一致，這些差異可能是由于樣本中產(chǎn)婦的年齡和孕周較小(小于6周)造成的。為了確定絨毛染色體非整倍體是否是RSA的主要原因，有研究比較了RSA和散發(fā)性流產(chǎn)絨毛染色體非整倍體率的情況，發(fā)現(xiàn)兩組之間無顯著差異，表明可能有其他更多的因素造成RSA[18]。

以自然流產(chǎn)而告終的臨床確診患者中，80%處于胚胎發(fā)育早期，且染色體異常占有相當(dāng)大的比例[20]。據(jù)報(bào)道絕大多數(shù)RSA發(fā)生在妊娠早期，一般在孕10周以內(nèi)[21],本研究中發(fā)生在10周以內(nèi)的RSA患者占41.4%(12/29)，染色體核型異常率為83.3%(10/12)，不排除樣本量較小造成的統(tǒng)計(jì)誤差。本研究還顯示，繼發(fā)性RSA胚胎染色體異常率高于原發(fā)性RSA，與以往的研究結(jié)果一致[22-23]。其中母體因素如凝血、免疫功能紊亂以及解剖異?？赡馨l(fā)揮更顯著的作用，使繼發(fā)性RSA胚胎更易出現(xiàn)異常形態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)可能為RSA患者提供預(yù)后信息，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了原發(fā)性、繼發(fā)性RSA潛在的病因不同。在繼發(fā)性RSA中，由于異常核型的高復(fù)發(fā)率，可將植入前基因篩查作為一種治療選擇提供給患者[24]。陳潔等[25]對(duì)原發(fā)性、繼發(fā)性早期RSA患者進(jìn)行臨床分析，繼發(fā)性患者內(nèi)分泌水平、夫妻雙方染色體及解剖因素均與原發(fā)性早期RSA患者有差異(P<0.05)，提示繼發(fā)性RSA者可能存在遺傳外的因素造成早期胚胎發(fā)育異常而導(dǎo)致自然流產(chǎn)。

針對(duì)RSA的病因，染色體檢測結(jié)果對(duì)于臨床工作者的診斷及患者的妊娠結(jié)局尤為重要。雖然傳統(tǒng)核型分析是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)失敗、樣本微生物感染、產(chǎn)婦細(xì)胞污染和染色體制備不良等因素常常導(dǎo)致常規(guī)核型分析失敗,總體失敗率為21%[26]，尤其在RSA婦女中，無論是通過金標(biāo)準(zhǔn)還是分子遺傳學(xué)測試技術(shù)，染色體異常的患病率大不相同[27]，這可能與樣本污染、陳舊、培養(yǎng)失敗降低檢測成功率有關(guān)。目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為在早期流產(chǎn)中絨毛染色體異常率約50%，也有學(xué)者認(rèn)為染色體異常率的實(shí)際情況可能明顯高于既往報(bào)道數(shù)據(jù)，這是由于常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法分辨率有限，檢出率較低。使用基于DNA的方法，包括熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QFPCR)、染色體微陣列分析(CMA)或NGS，可以避免一些技術(shù)難題。本研究中29例RSA樣本行NGS檢測的成功率高達(dá)100%，異常率為75.9%，高于李書平[28]、袁宏濤等[29]傳統(tǒng)染色體核型分析方法檢測的異常率63.2%、60.8%的結(jié)果，其中分別有5例及2例絨毛培養(yǎng)失敗。李亞麗等[10]對(duì)比分析了絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、NGS技術(shù)等3種方法對(duì)絨毛細(xì)胞染色體的檢測結(jié)果，認(rèn)為NGS技術(shù)可作為常規(guī)染色體核型分析失敗的補(bǔ)充檢測手段，特別是胚胎停止發(fā)育時(shí)間長、絨毛組織陳舊、形態(tài)極差的樣本可以進(jìn)行NGS技術(shù)檢測，以提高檢測成功率。

值得提出的是，雖然QFPCR相對(duì)容易實(shí)施，而且價(jià)格相對(duì)便宜，但并不能檢測大部分異常染色體(如染色體15、16和22)。與之相比，CMA或NGS方法的優(yōu)勢在于能夠生成更完整的基因圖。然而，這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)不僅是成本過高，而且分析結(jié)果較耗時(shí)[30]。同時(shí)，在檢測低水平的嵌合體以及三倍體或四倍體時(shí)，NGS技術(shù)的能力可能受到限制,但是其檢測結(jié)果的精確性仍是值得肯定的。

總之，本研究表明，NGS技術(shù)可以用于檢測RSA絨毛組織，且成功率高，在一定范圍內(nèi)能夠發(fā)現(xiàn)染色體微缺失、微重復(fù)。一個(gè)結(jié)構(gòu)良好的產(chǎn)前診斷，包括臨床、遺傳學(xué)以及植入前遺傳學(xué)診斷，尤其是對(duì)異常染色體核型的檢測，不僅能夠協(xié)助臨床工作者做出準(zhǔn)確診斷，而且也能夠指導(dǎo)RSA患者實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，改善妊娠結(jié)局。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：所有作者共同參與了論文的研究設(shè)計(jì)、寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：All the authors have participated in the research design, writing and revision of the manuscript.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.