王雅玲 徐靜 趙鵬 孫偉紅 彭達 馬學真

(青島大學第二臨床醫(yī)學院，山東 青島 266042 1 腫瘤中心； 2 病理科； 3 生物治療中心)

肺癌的發(fā)病率和死亡率在全世界惡性腫瘤中居首位[1]。根據(jù)病理特征肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC約占所有肺癌的85%，主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細胞未分化癌3種類型，肺腺癌是NSCLC最常見的亞型[2]。肺腺癌患者術(shù)后易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預后差[3]。P21活化激酶5(PAK5)是P21活化激酶(PAKs)家族最新發(fā)現(xiàn)的成員，主要定位于細胞線粒體內(nèi)，位于20p12染色體上，編碼相對分子質(zhì)量80 000蛋白質(zhì)[4]。研究發(fā)現(xiàn)PAK5在卵巢癌、骨肉瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均呈高表達，具有潛在的促癌作用[5-8]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是位于細胞膜的跨膜糖蛋白，由16q22.1號染色體上的CDH1基因編碼[9]。研究顯示E-cadherin表達降低可導致細胞間的黏附能力減弱以及腫瘤細胞的運動能力增強，從而導致腫瘤細胞容易脫離、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。PAK5可通過調(diào)控E-cadherin的表達水平參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[11-13]。目前關(guān)于PAK5在肺腺癌中的表達情況及PAK5與E-cadherin的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究通過免疫組織化學(IHC)方法檢測肺腺癌組織中PAK5以及E-cadherin的表達情況，并對PAK5與E-cadherin表達的相關(guān)性及兩者與臨床病理特征的關(guān)系進行分析，旨在探討PAK5和E-cadherin表達與肺腺癌患者預后的關(guān)系，為肺腺癌的治療及預后評估提供新思路或參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取青島大學第二臨床醫(yī)學院2014年1月—2015年12月確診為肺腺癌的患者61例，所有患者臨床資料完整，術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療。男27例，女34例；年齡≤60歲者26例，>60歲者35例；吸煙者19例，未吸煙者42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例，無轉(zhuǎn)移者39例；按照國際抗癌聯(lián)盟第8版TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ期24例；T1～T2期44例，T3～T4期17例。所有患者均行根治性手術(shù)，術(shù)后治療方式相同，均為1個月內(nèi)開始常規(guī)化療，一個化療周期21 d，化療方案為培美曲塞+奈達鉑，共化療4個周期，均未接受放療、抗血管生成及靶向藥物等治療。隨訪時間截至2019年4月1日，記錄所有患者的總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)，OS為從手術(shù)日至與肺癌相關(guān)死亡日或隨訪結(jié)束日或最后一次隨訪日之間的時間，PFS是從手術(shù)日到腫瘤進展的時間，若沒有進展，則終點是死亡日或最后一次隨訪日。本研究通過了青島大學第二臨床醫(yī)學院倫理委員會的審批。

1.2 IHC染色檢測PAK5和E-cadherin的表達

所有患者于手術(shù)過程中留取肺腺癌組織標本，并經(jīng)病理學檢查確診為肺腺癌。標本應用40 g/L甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。采用SP-9000法進行IHC染色檢測PAK5和E-cadherin的表達，操作嚴格按檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書要求進行。兔抗人PAK5多克隆抗體(ab110069，1∶100稀釋)購自英國Abcam公司，兔抗人E-cadherin單克隆抗體(3195s，1∶600稀釋)購自美國CST公司。

1.3 結(jié)果判讀

由兩位病理學專家利用光學顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)對標本染色結(jié)果進行盲評，并取平均值作為最后得分。每個切片隨機選擇5個高倍鏡視野(200倍)，根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比綜合評分進行結(jié)果判讀。以腫瘤細胞的細胞質(zhì)和(或)細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為PAK5染色陽性，以腫瘤細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為E-cadherin染色陽性。染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分；同時陽性細胞百分比評分：0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，綜合得分計算方法為：綜合得分=染色強度評分×陽性細胞百分比評分。PAK5表達綜合得分≥6分為高表達，<6分則為低表達[12]。E-cadherin表達綜合得分>4分為高表達，≤4分則為低表達[14]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0版軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學處理。采用χ2檢驗、Fisher精確檢驗及Spearman相關(guān)性分析進行統(tǒng)計處理；應用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗進行生存分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺腺癌組織中PAK5和E-cadherin的表達水平與患者臨床病理特征間的關(guān)系

PAK5陽性顆粒定位于肺腺癌細胞質(zhì)和(或)細胞核，呈淡黃色或棕黃色；E-cadherin陽性顆粒定位于肺腺癌細胞膜，呈淡黃色或棕黃色(圖1)。61例肺腺癌組織標本中PAK5高表達者38例(62.3%)，E-cadherin高表達者43例(70.5%)；PAK5以及E-cadherin的表達水平均與腫瘤T分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(χ2=4.037～16.108，P<0.05)，但是與患者年齡、性別及是否吸煙無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 PAK5和E-cadherin表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

A:肺腺癌組織中PAK5高表達；B:肺腺癌組織中PAK5低表達；C:肺腺癌組織中E-cadherin高表達；D:肺腺癌組織中E-cadherin低表達。IHC染色，200倍

2.2 PAK5與E-cadherin表達與患者預后的關(guān)系

患者的隨訪時間為10～64個月，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示PAK5高表達及低表達患者3年總生存率分別為71.0%、95.7%，3年無進展生存率分別為67.7%、82.6%；E-cadherin高表達及低表達患者3年總生存率分別為86.0%、67.0%，3年無進展生存率分別為81.4%、52.7%；Log-Rank檢驗顯示，PAK5低表達患者3年總生存率以及3年無進展生存率均大于高表達患者，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.893、3.920,P<0.05)；E-cadherin高表達患者3年總生存率以及3年無進展生存率均大于低表達者，差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.849、7.363,P<0.05)。見圖2。

A、B分別為PAK5表達高低與患者總生存率及無進展生存率的關(guān)系，C、D分別為E-cadherin表達高低與患者總生存率及無進展生存率的關(guān)系

2.3 肺腺癌組織中PAK5與E-cadherin表達水平的相關(guān)性

本研究的分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中PAK5與E-cadherin表達水平呈負相關(guān)(r=-0.355，P<0.05)。見表2。

表2 肺腺癌組織中PAK5與E-cadherin表達水平的相關(guān)性(例)

3 討 論

近年來，隨著分子靶向藥物在肺腺癌中的廣泛應用，肺腺癌的治療取得了實質(zhì)性進展，但由于目前的早期診斷方法缺乏特異度和靈敏度，肺腺癌患者確診時大多已為晚期，5年存活率很低[15]。PAKs家族屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類，同時也是與細胞分裂周期蛋白42(Cdc42)/Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Rac)的下游效應分子[16]。PAKs根據(jù)結(jié)構(gòu)特點被分為兩類，第Ⅰ類包括PAK1、PAK2、PAK3，第Ⅱ類包括PAK4、PAK5、PAK6，均具有激酶結(jié)構(gòu)域和Cdc42/Rac結(jié)合域[17]。PAK5最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)組織中[18]，在小腦、大腦皮質(zhì)以及嗅球組織中均呈高表達[19]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)PAK5在多種惡性腫瘤中高表達，且與骨肉瘤、卵巢癌、宮頸癌以及胃癌等惡性腫瘤遠處轉(zhuǎn)移和預后不良密切相關(guān)[6,11-12,20]。PAK5是多種信號通路的核心分子，參與調(diào)節(jié)細胞骨架、細胞凋亡、細胞增殖、遷移和侵襲等細胞生物學行為[21]。PAK5的激酶結(jié)構(gòu)域與第Ⅱ類中其他PAKs的激酶結(jié)構(gòu)域相似，與PAK6有至少80%的同源性，與PAK4有85%的同源性，但是與第Ⅰ類中的PAKs僅僅有約52%～57%的同源性[19,22]。CAI等[23]研究顯示，PAK4的高表達與NSCLC患者預后不良有關(guān)系。RAJA等[24]研究認為PAK6是一種有前途的新型NSCLC治療靶點。FAWDAR等[25]發(fā)現(xiàn)PAK5在5%～10%的肺癌中發(fā)生了突變，并且通過MEK/ERK信號通路調(diào)節(jié)細胞的增殖與凋亡。HAN等[26]發(fā)現(xiàn)PAK5在骨肉瘤中高表達，可以作為骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的預測指標。上述研究表明PAK5可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用。本研究結(jié)果顯示，有38例(62.3%)肺腺癌組織PAK5高表達，與先前的研究結(jié)果基本一致[12,26]；同時PAK5表達水平與腫瘤T分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期的患者中PAK5高表達率顯著高于T1～T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者，表明PAK5高表達可能促進肺腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。另外本研究中，PAK5低表達患者3年總生存率和3年無進展生存率均顯著高于高表達患者，表明PAK5高表達與肺腺癌患者預后不良有關(guān)，也與先前研究結(jié)果基本一致。因此PAK5高表達在肺腺癌中可能起促癌作用，PAK5有望成為肺腺癌治療的潛在靶點。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細胞失去極性，成為具有浸潤能力和游走遷移能力的間質(zhì)細胞的過程，EMT會促進包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)及化療耐藥，E-cadherin是維持上皮細胞極性及細胞間黏附連接的主要分子，在EMT中表達下調(diào)[27]。既往研究發(fā)現(xiàn)PAK5會促進宮頸癌、卵巢癌和結(jié)腸癌細胞發(fā)生EMT[11-13]，E-cadherin的表達水平與肺腺癌分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示，有43例(70.5%)肺腺癌組織E-cadherin高表達，在T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ期的患者中E-cadherin高表達率顯著低于T1～T2期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期的患者，考慮可能與E-cadherin表達降低使癌細胞間的黏附能力減弱有關(guān)，從而引起肺腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。本研究還顯示E-cadherin低表達與肺腺癌患者的不良預后密切相關(guān)，這與既往的研究結(jié)果基本一致[29]。PAK5與E-cadherin的表達水平呈顯著負相關(guān)，提示PAK5高表達可能也與肺腺癌的EMT有關(guān)，并間接影響肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后。

總之，PAK5高表達和E-cadherin低表達與肺腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及預后不良有關(guān)，且PAK5可能是通過調(diào)控EMT促進肺腺癌的進展。未來應進一步探討PAK5和E-cadherin在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為肺腺癌的防治提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：所有作者共同參與了論文的研究設計、寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：All the authors have participated in the research design, writing and revision of the manuscript.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.