陳清蓉，柴胡玲瀟，陳 韜，王冠博

(1. 深圳灣實驗室細胞分析研究所，廣東 深圳 518132；2.昌平實驗室，北京 102206；3. 蘇州有諾真生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215124；4. 北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心，北京 100871)

蛋白質(zhì)常因存在多種修飾而呈現(xiàn)異質(zhì)性。蛋白的糖基化是最常見和多樣化的翻譯后修飾，影響著蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性和溶解度，同時在分子識別、信號傳導和免疫防御等方面具有關鍵作用[1-2]。糖基化蛋白分子中含有分子質(zhì)量及個數(shù)各不相同的單糖殘基，形成宏觀異質(zhì)性(糖基化位點的占據(jù)程度差異)和微觀異質(zhì)性(各糖基化位點的糖鏈結(jié)構(gòu)差異)，造成較寬的分子質(zhì)量范圍[3]。異質(zhì)性糖蛋白分子質(zhì)量的準確測定對于分析蛋白結(jié)合關系、生物技術產(chǎn)品的批次差異、質(zhì)量濃度和比熱等多種指標[4]，以及翻譯后修飾等有著重要意義。凝膠電泳[4]、體積排阻色譜[5]等基于尺寸測定的傳統(tǒng)技術對于異質(zhì)性蛋白的分子質(zhì)量測定無法提供足夠的準確度。質(zhì)譜技術可通過測定離子化糖蛋白的質(zhì)荷比，在已知所測信號價態(tài)的前提下，實現(xiàn)高準確度的分子質(zhì)量測定。

基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)和電噴霧(ESI)是用于完整蛋白質(zhì)譜分析的2種常用離子化技術。MALDI離子源主要產(chǎn)生1價蛋白離子，能夠較直接地將所測到的質(zhì)荷比信號轉(zhuǎn)化成蛋白分子質(zhì)量，但其對糖基化蛋白的離子化效率有限，相應商品儀器提供的質(zhì)量檢測范圍受限，且酸性干燥基質(zhì)的使用不適于檢測蛋白間非共價相互作用[6]，因此，MALDI并非糖蛋白體系的最佳離子化方法。雖然ESI已成為分析完整蛋白及其復合物的有力工具[7-9]，其使蛋白攜帶多重電荷、所得蛋白離子價態(tài)未知且呈現(xiàn)多價態(tài)分布的特點增大了分子質(zhì)量測定的復雜程度。針對均質(zhì)化蛋白(分子質(zhì)量明確、分布均一)已有較成熟的算法用于價態(tài)測定[10-21]，異質(zhì)性蛋白因其分子質(zhì)量分布較寬而導致信號峰嚴重展寬，因不同價態(tài)信號間發(fā)生重疊而導致譜圖高度卷積，嚴重降低了不同價態(tài)離子信號的分辨率(以下簡稱“價態(tài)分辨率”)。此外，由于糖蛋白不同糖型的質(zhì)子親和勢存在差異，各糖型的價態(tài)分布存在差異，因而各價態(tài)糖蛋白離子信號的m/z輪廓并不相同。這一現(xiàn)象使得傳統(tǒng)價態(tài)測定算法的基本假設(即不同價態(tài)信號的m/z輪廓一致)不再成立。由于糖蛋白離子信號的分辨率通常不足以達到同位素級別的分辨，即使使用超高分辨的質(zhì)量分析器(如軌道阱(Orbitrap)、傅里葉變換離子回旋共振(FTICR))也難以利用針對同位素分辨水平信號開發(fā)的算法進行價態(tài)測定[22-26]。因此，提高價態(tài)分辨率和準確測定價態(tài)是測定完整異質(zhì)性蛋白分子質(zhì)量的2個先決條件。

對全部蛋白離子進行價態(tài)系綜還原可以顯著提升價態(tài)分辨率，并通過提升m/z讀數(shù)允差提升價態(tài)測定的準確性[27]。然而，系綜還原無法解決不同價態(tài)離子m/z輪廓不一致的問題。與之相對應的“有限價態(tài)還原”[28](本文稱為“亞群還原”，便于與系綜還原區(qū)分)方法，首先利用四極桿或離子阱篩選出單一價態(tài)離子中質(zhì)量分布較窄的亞群，然后利用電子轉(zhuǎn)移[28-30]、電子捕獲[31]或質(zhì)子轉(zhuǎn)移還原(PTCR)反應[27]實現(xiàn)這一亞群離子的價態(tài)還原。由于還原產(chǎn)物離子各價態(tài)的質(zhì)量分布(mass profile)與前體離子(precursor ion)相仿，且質(zhì)量分布范圍較窄并可人為控制前體離子篩選階段，這一方法可顯著提升電荷測定的準確性，獲取價態(tài)信號難以分辨的高度異質(zhì)性蛋白的分子質(zhì)量。但這些方法需依賴基于電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移的反應模塊，可利用的商品化儀器有限，限制了應用。本課題組利用眾多型號儀器所具備的碰撞誘導解離(CID)或高能碰撞解離(HCD)功能開發(fā)了碎片互補原理的分析策略[4]，可將目標蛋白上具有特定質(zhì)量分布的部分解離下來，利用碎裂反應的質(zhì)量守恒關系(即前體離子分子質(zhì)量=碎片分子質(zhì)量+殘骸分子質(zhì)量)為前體離子的價態(tài)測定增加額外的約束條件，從而大幅提升價態(tài)測定以及分子質(zhì)量測定的準確度。但相應算法僅在抗體分子共價解離體系中得以證明，尚未在非共價復合物體系中應用。

抗體蛋白在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用，且自身或偶聯(lián)產(chǎn)物可作為靶向生物藥物的實體形式，對其結(jié)構(gòu)和相互作用表征具有重要意義。質(zhì)譜技術廣泛應用于抗體分析[32-33]，其中非變性質(zhì)譜因勝任完整蛋白及其復合物分析、可維系關鍵非共價作用的特點，可為抗體分析提供修飾程度、高級結(jié)構(gòu)及相互作用等方面獨特的結(jié)構(gòu)信息[34-36]。因既往工作多側(cè)重于IgG類抗體，其他類型抗體因修飾、結(jié)構(gòu)的復雜性為質(zhì)譜分析帶來了更多挑戰(zhàn)。IgA是血清中高豐度抗體，起中和抗體的作用，并可介導補體系統(tǒng)的替代激活途徑。分泌型IgA為外分泌液中最主要的抗體，可在黏膜上抵御微生物感染，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮不可或缺的作用[37]。此外，IgA還可以母乳作為媒介，實現(xiàn)免疫功能的母嬰傳遞。新冠病毒感染產(chǎn)婦初乳中病毒特異性IgA的含量顯著提升，為新生兒消化道提供免疫收益[38]。IgA包括IgA1和IgA2亞型，其分子中均含有多個糖基化位點[39]，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性[40]。IgA2亞型中，輕、重鏈之間可不以二硫鍵連接，且2種異性體中IgA2m(1)的2條輕鏈之間可直接形成二硫鍵[41]，呈現(xiàn)復雜的復合物體系。

本課題組擬針對含有非共價亞基的IgA2抗體及其尺寸變異體(size variant)復合物體系，使用碎片互補法分析完整蛋白復合物。通過平行使用碎片互補法、針對全體蛋白型系綜還原方法及針對蛋白型亞群有限還原方法的結(jié)果比較和交叉驗證，對方法性能進行評價，并提出可顯著提升準確性、有效避免錯誤鑒定的分析方案。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

使用Orbitrap Eclipse Tribrid質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品)進行基于PTCR的質(zhì)譜測定，使用Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole Orbitrap質(zhì)譜儀(德國Thermo Fisher公司產(chǎn)品)進行其他質(zhì)譜測定，儀器均配備靜態(tài)納升電噴霧離子源(nanoESI)；利用5424R臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司產(chǎn)品)進行溶液置換；采用DS-11+光譜儀(美國Denovix公司產(chǎn)品)測定蛋白樣品濃度。

1.2 主要材料與試劑

單克隆血清IgA2m(1)抗體(IgA2單抗)：北京愛博生生物技術有限公司產(chǎn)品；乙酸三甲基銨(TEAA，色譜級)、間硝基芐醇(m-NBA，質(zhì)譜級)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；醋酸銨(NH4Ac，色譜級)：阿拉丁(中國)公司產(chǎn)品；截留分子質(zhì)量為50 ku的離心超濾套裝：美國Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.3 實驗條件

1.3.1樣品制備 利用離心過濾將抗體樣品的原緩沖液置換為150 mmol/L醋酸銨溶液，制得濃溶液，以150 mmol/L醋酸銨溶液將蛋白濃溶液稀釋至1～2 μmol/L。對于需進行系綜還原的樣品，將溶液中20%(mol/mol)的NH4Ac替換為TEAA，向需進行增電荷處理的樣品溶液中加入1%m-NBA。

1.3.2質(zhì)譜條件 使用靜態(tài)納升電噴霧離子源進樣。離子傳輸管溫度設為250 ℃。使用UHMR儀器測定時，分辨率設為50 000，檢測范圍設為m/z500～20 000。除特別說明外，串聯(lián)質(zhì)譜隔離窗口寬度均設置為m/z100；使用高純氮氣(純度>99.99%)作為碰撞氣，在不產(chǎn)生非共價碎裂的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)碰撞能量。使用Eclipse儀器測定時，分辨率設為120 000，檢測范圍設為m/z350～8 000。除特別說明外，串聯(lián)質(zhì)譜隔離窗口寬度均設置為m/z100；PTCR使用儀器標配模塊，在20～40 ms區(qū)間調(diào)節(jié)反應時間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Xcalibur、Biopharma Finder(Thermo Fisher Scientific)和Origin Pro(OriginLab，美國)軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 IgA2單抗一級質(zhì)譜測定的誤差

IgA2m(1)單抗單體含由二硫鍵連接的2條輕鏈和2條重鏈，預期拓撲結(jié)構(gòu)示于圖1a，其2條重鏈中每條含4個N-糖基化位點，數(shù)量為常見IgG1抗體的4倍，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性。非變性條件下，高度糖基化蛋白不同價態(tài)的信號發(fā)生高度重疊，難以分辨[27]，且蛋白易發(fā)生凝集甚至沉淀，不適于進行完整糖蛋白分析。在常規(guī)非變性條件下，本工作使用的IgA2樣品在一級質(zhì)譜(MS1)中呈現(xiàn)明顯區(qū)分的2簇信號：其中m/z較小的信號簇對應物種記為物種Ⅰ，另一簇信號對應物種記為物種Ⅱ。物種Ⅰ信號價態(tài)分辨率較高，其m/z分布范圍略高于IgG1單體[27, 42]，示于圖1b?？紤]到IgA2鏈稍長于IgG1，且含有更多糖基鏈，每條糖基鏈的質(zhì)量范圍多在1～2 ku之間，IgA2單體的分子質(zhì)量高于IgG1，物種Ⅰ的信號分布與對IgA2單體信號的預期相符。使用常規(guī)算法對2簇信號進行價態(tài)計算，可得將物種Ⅰ的價態(tài)+i指定為+24價，及物種Ⅱ的價態(tài)+j指定為+39價時，對應的殘余(residual)偏差(σ)最低，此時計算所得的分子質(zhì)量分別為147.8和359.4 ku，示于圖1c。如前所述，IgA2單體的分子質(zhì)量應略高于IgG1，而IgG1分子質(zhì)量多在148～150 ku范圍內(nèi)，因此物種A的分子質(zhì)量測定結(jié)果較預期偏小。由于此IgA2樣品按經(jīng)典表達純化方法制備[43]，推測不含背景蛋白，且表達體系中不含J-chain成分，因而推測物種Ⅱ為物種Ⅰ的非J-chain連接二聚體。然而，物種Ⅱ的實測分子質(zhì)量顯著大于物種Ⅰ的2倍。上述相悖結(jié)果均表明，常規(guī)非變性條件下基于經(jīng)典算法進行價態(tài)和分子質(zhì)量測定的可靠性存疑。對此，可利用TEAA對樣品進行系綜還原，以提高價態(tài)分辨率、降低用于價態(tài)計算的m/z讀數(shù)誤差[27]。物種Ⅰ和Ⅱ的離子價態(tài)均顯著降低，隨著信號分布向高m/z端移動，二者的價態(tài)分辨率顯著提升。使用經(jīng)典算法計算價態(tài)所得結(jié)果為：物種Ⅰ的價態(tài)+i指定為+18價，及物種Ⅱ的價態(tài)+j指定為+28價，對應的分子質(zhì)量分別為147.6和352.5 ku，示于圖1d。分子質(zhì)量測定結(jié)果與系綜還原前接近，且仍然有悖于理論預期，表明價態(tài)分辨率的提升并不必然帶來價態(tài)和分子質(zhì)量測定準確性的提升。

注：+i和+j分別表示物種Ⅰ和Ⅱ價態(tài)計算的最高價態(tài)；分別以黑/藍色及灰色標注偏差最小值數(shù)據(jù)點對應的分子質(zhì)量數(shù)值及經(jīng)后文所述方法測定價態(tài)對應的分子質(zhì)量數(shù)值圖1 IgA2m(1)的拓撲結(jié)構(gòu)示意圖(a)及IgA2單抗在常規(guī)非變性條件下(黑色)及系綜還原條件下(藍色)的MS1譜圖(b)，使用經(jīng)典算法對系綜還原前后物種Ⅰ和物種Ⅱ進行價態(tài)計算所得的殘余偏差分布(c，d)Fig.1 Schematics of the topologic structure of IgA2m(1) (a) and MS1 spectra of IgA2 mAb acquired under normal native condition (black) and ensemble reduction condition (blue) (b), plots of residuals corresponding to charge assignments using the classical approach for species Ⅰ and Ⅱ (c,d)

2.2 利用碰撞解離提升IgA2分子質(zhì)量測定及尺寸變異體鑒定的準確性

針對IgA2復合物體系，利用基于CID或HCD將亞群有限還原方法及碎片互補策略進行整合。對糖蛋白復合物離子中分子質(zhì)量分布較窄的一個亞群進行質(zhì)量選擇后碰撞解離，一方面可以將具有特定分子質(zhì)量分布的大碎片從復合物中解離，碎片帶走大量電荷的同時使殘骸離子形成價態(tài)大幅降低的多個價態(tài)信號分布；另一方面，使母離子失去分子質(zhì)量可忽略的單電荷小碎片，產(chǎn)生價態(tài)逐一遞減的信號分布。質(zhì)量選擇操作減小了前體離子的蛋白型分布寬度，有利于降低譜圖復雜程度、提高價態(tài)分辨率、減小用于價態(tài)計算的m/z讀數(shù)誤差，同時新生成的價態(tài)內(nèi)，產(chǎn)物離子的質(zhì)量分布均來自前體離子被分選出的分布較窄的亞群，因而可顯著提升價態(tài)及分子質(zhì)量測定的準確性。此外，碎裂反應的質(zhì)量守恒可為分子質(zhì)量計算提供更嚴格的約束條件，有利于提升準確性。將物種Ⅰ的單一價態(tài)(重新記為+i)內(nèi)亞群經(jīng)質(zhì)量選擇后進行HCD碎裂，獲得2種碎片和相應的殘骸產(chǎn)物示于圖2a。其中，較大的碎片分子質(zhì)量分布較均一，分子質(zhì)量為46.2 ku，可作為碎片互補法的強約束條件。這一分子質(zhì)量也與IgA2輕鏈二聚體的理論分子質(zhì)量相符，為非共價解離產(chǎn)物。較小的碎片分子質(zhì)量分布較寬，呈現(xiàn)似糖基化蛋白離子的異質(zhì)性分布特征，其平均分子質(zhì)量為24.4 ku。由于IgA2內(nèi)輕鏈更容易以非共價方式整體解離，該碎片應為重鏈經(jīng)非共價鍵解離所得，異質(zhì)性來源可能為重鏈上的糖基化，或非特異性碎裂位點的空間分布。由于重鏈內(nèi)存在多個鏈內(nèi)二硫鍵并且與結(jié)構(gòu)域封裝相對應，可檢測到的碎片應為結(jié)構(gòu)域之間短片段內(nèi)斷裂所得的單一結(jié)構(gòu)域碎片。由于Fc結(jié)構(gòu)域更長且糖基化位點更多，這些碎片的分子質(zhì)量數(shù)值更接近重鏈的(CH+VH)結(jié)構(gòu)域。這些碎片來自非共價解離且分子質(zhì)量分布較寬，其對應的殘骸分子質(zhì)量碎片也產(chǎn)生較寬的分子質(zhì)量分布，且有更大可能發(fā)生顯著的中性丟失，因而24.4 ku的數(shù)值在碎片互補算法中僅能用作弱約束條件。平行比較上述2種碎片對應的測定結(jié)果有助于評價碎片互補法的適用條件。

當使用46.2 ku解離的約束條件時，分別以前體離子經(jīng)有限還原所得的價態(tài)分布(+i系列)和相應殘骸離子(分子質(zhì)量記為M(r))的價態(tài)分布(+j系列)進行殘余偏差分析，可得+i指定為25時，前體離子分子質(zhì)量(記為M(p))偏差最小，M(p)為167.6 ku；相應地，+j指定為13時，殘骸離子分子質(zhì)量偏差最小，M(r)為122.9 ku；引入碎裂反應質(zhì)量守恒關系構(gòu)建矩陣，則僅當+i歸屬為25、+j歸屬為13時，殘余虧損(記為ΔM)最小，價態(tài)計算結(jié)果相同，示于圖2b。此時，物種Ⅰ的分子質(zhì)量測定值為167.6 ku，符合對IgA2單體分子質(zhì)量的預期。而當使用24.4 ku解離作為約束條件時，相應殘骸離子最小殘余偏差對應的價態(tài)(+j’系列)和分子質(zhì)量分別為+18和136.3 ku，引入質(zhì)量守恒關系矩陣后按最小ΔM指向的物種Ⅰ分子質(zhì)量變?yōu)?60.6 ku，示于圖2c。這一數(shù)值與系綜還原條件下任意價態(tài)歸屬所對應的分子質(zhì)量均有4 ku以上的偏差，顯著大于因去溶劑化等因素造成的分子質(zhì)量偏移水平，表明這一價態(tài)歸屬不具有合理性?？紤]到譜圖中呈現(xiàn)的減電荷前體離子信號可能已包含中性碎裂丟失的貢獻，此時如將MS1條件下的前體離子價態(tài)分布引入矩陣，則可將物種Ⅰ的分子質(zhì)量定位至168.5 ku，與強約束條件下所得結(jié)果僅相差0.9 ku，示于圖2d。

注：a圖的插圖表示碎片離子信號的放大譜圖；對于前體離子、對應46.2 ku和24.4 ku碎片的殘骸離子，分別以+i、+j及+j’表示價態(tài)計算的最高價態(tài)圖2 IgA2單抗樣品中物種Ⅰ的串聯(lián)質(zhì)譜圖(質(zhì)量選擇窗口為m/z 6 680～6 780)(a)，以46.2 ku碎片為約束條件的價態(tài)計算矩陣(b)，以24.4 ku碎片為約束條件的價態(tài)計算矩陣(c)，以及以24.4 ku碎片為約束條件，并以物種Ⅰ的MS1價態(tài)分布取代前體離子MS2價態(tài)分布所得的價態(tài)計算矩陣(d)Fig.2 Tandem mass spectra of species I in IgA2 mAb sample (with a mass-selection window of m/z 6 680-6 780) (a), and the charge determination matrix using the 46.2 ku fragment as the constraint (b), the charge determination matrix using the 24.4 ku fragment as the constraint (c), and the charge determination matrix using the 24.4 ku fragment as the constraint, with the charge distribution of the precursor ions in MS2 replaced with that of species 1 ions in MS1

使用同樣方式分析物種Ⅱ，經(jīng)質(zhì)量選擇的亞群在HCD下僅解離出單一碎片，即分子質(zhì)量分布均一的46.2 ku物種，與物種Ⅰ的主要碎片相同，示于圖3a。此處未檢測到共價解離產(chǎn)物，可能是由于物種Ⅱ分子質(zhì)量較大，對于碰撞能量的耐受較強，因而僅優(yōu)先發(fā)生所需能量較少的非共價解離。分別將前體離子及殘骸離子的價態(tài)分布引入以46.2 ku碎片為約束條件的價態(tài)計算矩陣后，可得物種Ⅱ?qū)肿淤|(zhì)量為337.4 ku時ΔM最小(絕對值低于0.5 ku)，示于圖3b。結(jié)合物種Ⅰ的測定結(jié)果，337.4 ku的數(shù)值較單體分子質(zhì)量167.6或168.5 ku的2倍分別相差2.2和0.4 ku，與IgA2二聚體的分子質(zhì)量預期相符。對物種Ⅰ和物種Ⅱ的串聯(lián)質(zhì)譜分析表明，當碎片為特異性解離產(chǎn)物且分子質(zhì)量分布較均一時，可作為強約束條件，在利用碎片互補法進行價態(tài)和分子質(zhì)量測定時提供較高的準確度，結(jié)果穩(wěn)定可靠。當碎片特異性較差、分子質(zhì)量存在一定范圍分布時，其作為約束條件的可靠性減弱，可能會造成價態(tài)誤判和相應的分子質(zhì)量誤差。采用MS1譜圖中的價態(tài)分布取代MS2譜圖中前體離子的價態(tài)分布可在一定程度上彌補價態(tài)測定的偏差，但需以MS1譜圖中充分的價態(tài)分離度為前提。將上述可靠性更高的分子質(zhì)量結(jié)果代入系綜還原條件下基于MS1所得的價態(tài)歸屬圖，結(jié)果示于圖1d?？梢?，雖然物種Ⅰ、Ⅱ經(jīng)系綜還原后的分子質(zhì)量測定仍存在偏差，但相比于準確分子質(zhì)量所對應的價態(tài)歸屬，價態(tài)偏差由還原前的3個及2個單位，減小至還原后的2個及1個單位，表明降低價態(tài)可對價態(tài)及分子質(zhì)量測定的準確性提供收益，但僅通過MS1數(shù)據(jù)難以保證準確度的提升，仍需借助基于串聯(lián)質(zhì)譜的方案提升結(jié)果的可靠性。

2.3 利用基于質(zhì)子轉(zhuǎn)移的有限還原驗證分子質(zhì)量測定的準確性

基于PTCR的亞群有限還原法已被證明是測定完整糖蛋白分子質(zhì)量準確性最高的方法[27]。為直接驗證利用碎片互補法所得分子質(zhì)量測定結(jié)果的準確性，采用基于PTCR反應的亞群有限還原法，以更高的準確度[27]平行測定IgA2的分子質(zhì)量。由于IgA2在非變性條件下的單體信號已超過可提供PTCR功能的商品化儀器的檢測范圍，無法檢測其還原產(chǎn)物信號。因此，首先利用增電荷試劑對樣品信號進行提升價態(tài)、減小m/z的處理。然而，由于增電荷試劑m-NBA在一定程度上會產(chǎn)生破壞蛋白高級結(jié)構(gòu)的作用[44]，引入1%m-NBA后，IgA2會發(fā)生解離，MS1譜圖中主要呈現(xiàn)輕鏈二聚體(L2)、重鏈二聚體(H)及疑似重鏈碎片(FH)的信號，示于圖4a。選取重鏈單一價態(tài)的2個亞群分布分別進行基于PTCR的有限還原，2個質(zhì)量選擇窗口(W1及W2)下的前體離子均產(chǎn)生了2個價態(tài)系列的還原產(chǎn)物，示于圖4b。這是由于重鏈分子質(zhì)量分布較寬、相鄰價態(tài)離子的m/z分布發(fā)生重疊，且增電荷處理后信號重疊程度增大，因此，每個質(zhì)量選擇窗口下選擇的前體離子均包括相鄰2個價態(tài)蛋白型中低價態(tài)的低分子質(zhì)量部分和高價態(tài)的高分子質(zhì)量部分，體現(xiàn)了分子質(zhì)量分布的邊界。將2個價態(tài)系列所得的邊界分子質(zhì)量取平均值，可得系綜平均分子質(zhì)量。2個窗口下所得的重鏈系綜平均分子質(zhì)量分別為59.7和59.9 ku，取其平均值59.8 ku計，則2條重鏈與輕鏈二聚體的分子質(zhì)量之和為165.8 ku?？紤]到大復合物離子測定中的去溶劑化誤差[45]，這一結(jié)果與基于碰撞解離的碎片互補法所得的IgA2單體及二聚體結(jié)果吻合較好(偏差超過相鄰數(shù)值價態(tài)指認造成的分子質(zhì)量偏差)，表明在碎片特異性較好的前提下，基于碰撞解離的碎片互補法足以提供充分的質(zhì)量準確性。

注：a圖中插圖為碎片離子信號的放大譜圖；對于前體離子及對應46.2 ku碎片的殘骸離子，分別以+i及+j表示價態(tài)計算的最高價態(tài)圖3 IgA2單抗樣品中物種Ⅱ的串聯(lián)質(zhì)譜圖(質(zhì)量選擇窗口為m/z 9 150～9 250)(a)以及以46.2 ku碎片為約束條件的價態(tài)計算矩陣(b)Fig.3 Tandem mass spectra of species Ⅱ in IgA2 mAb sample (with a mass-selection window of m/z 9 150-9 250) (a) and the charge determination matrix using the 46.2 ku fragment as the constraint (b)

注：a圖中插圖為重鏈單體離子的局部信號圖，紅、藍陰影覆蓋區(qū)域指示2個質(zhì)量選擇窗口W1和W2的范圍；b中箭頭所示為前體離子，還原所得的2個價態(tài)系列的信號峰分別標注其對應的價態(tài)和分子質(zhì)量圖4 IgA2單抗樣品在增電荷條件下所得的M1譜圖(a)以及經(jīng)W1和W2選擇所得亞群的PTCR還原譜圖(b)Fig.4 MS1 spectra of IgA2 mAb acquired under super-charging condition (a) and PTCR spectra of subpopulations of the heavy chain proteoforms with windows W1 and W2 (b)

3 結(jié)論

本工作使用非變性質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜，在完整蛋白復合物層面表征了IgA2單抗樣本中因高度糖基化導致的異質(zhì)性蛋白型分布及尺寸變異體。針對因復雜糖基化導致的價態(tài)及分子質(zhì)量測定偏差問題，對全部蛋白型進行系綜價態(tài)還原可提供一定收益，但僅基于MS1數(shù)據(jù)難以保證準確性。利用串聯(lián)質(zhì)譜針對特定蛋白型亞群進行有限價態(tài)還原可提供更高的準確性。當不具備進行基于電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移的反應條件時，可采用基于碰撞解離的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合碎片互補原理提升價態(tài)及分子質(zhì)量測定的準確性，且準確性與碎片特異性和碎片分子質(zhì)量均一性正相關。這一策略可為復雜糖蛋白復合物體系在完整層面的準確分析提供普適性的方案。

致謝：感謝北京愛博生生物技術有限公司(Absea)提供IgA2單抗樣品；感謝昌平實驗室質(zhì)譜平臺對本工作的支持。