陳清蓉，柴胡玲瀟，陳 韜，王冠博

(1. 深圳灣實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞分析研究所，廣東 深圳 518132；2.昌平實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；3. 蘇州有諾真生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215124；4. 北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心，北京 100871)

蛋白質(zhì)常因存在多種修飾而呈現(xiàn)異質(zhì)性。蛋白的糖基化是最常見(jiàn)和多樣化的翻譯后修飾，影響著蛋白質(zhì)的構(gòu)象、穩(wěn)定性和溶解度，同時(shí)在分子識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫防御等方面具有關(guān)鍵作用[1-2]。糖基化蛋白分子中含有分子質(zhì)量及個(gè)數(shù)各不相同的單糖殘基，形成宏觀異質(zhì)性(糖基化位點(diǎn)的占據(jù)程度差異)和微觀異質(zhì)性(各糖基化位點(diǎn)的糖鏈結(jié)構(gòu)差異)，造成較寬的分子質(zhì)量范圍[3]。異質(zhì)性糖蛋白分子質(zhì)量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于分析蛋白結(jié)合關(guān)系、生物技術(shù)產(chǎn)品的批次差異、質(zhì)量濃度和比熱等多種指標(biāo)[4]，以及翻譯后修飾等有著重要意義。凝膠電泳[4]、體積排阻色譜[5]等基于尺寸測(cè)定的傳統(tǒng)技術(shù)對(duì)于異質(zhì)性蛋白的分子質(zhì)量測(cè)定無(wú)法提供足夠的準(zhǔn)確度。質(zhì)譜技術(shù)可通過(guò)測(cè)定離子化糖蛋白的質(zhì)荷比，在已知所測(cè)信號(hào)價(jià)態(tài)的前提下，實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度的分子質(zhì)量測(cè)定。

基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)和電噴霧(ESI)是用于完整蛋白質(zhì)譜分析的2種常用離子化技術(shù)。MALDI離子源主要產(chǎn)生1價(jià)蛋白離子，能夠較直接地將所測(cè)到的質(zhì)荷比信號(hào)轉(zhuǎn)化成蛋白分子質(zhì)量，但其對(duì)糖基化蛋白的離子化效率有限，相應(yīng)商品儀器提供的質(zhì)量檢測(cè)范圍受限，且酸性干燥基質(zhì)的使用不適于檢測(cè)蛋白間非共價(jià)相互作用[6]，因此，MALDI并非糖蛋白體系的最佳離子化方法。雖然ESI已成為分析完整蛋白及其復(fù)合物的有力工具[7-9]，其使蛋白攜帶多重電荷、所得蛋白離子價(jià)態(tài)未知且呈現(xiàn)多價(jià)態(tài)分布的特點(diǎn)增大了分子質(zhì)量測(cè)定的復(fù)雜程度。針對(duì)均質(zhì)化蛋白(分子質(zhì)量明確、分布均一)已有較成熟的算法用于價(jià)態(tài)測(cè)定[10-21]，異質(zhì)性蛋白因其分子質(zhì)量分布較寬而導(dǎo)致信號(hào)峰嚴(yán)重展寬，因不同價(jià)態(tài)信號(hào)間發(fā)生重疊而導(dǎo)致譜圖高度卷積，嚴(yán)重降低了不同價(jià)態(tài)離子信號(hào)的分辨率(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“價(jià)態(tài)分辨率”)。此外，由于糖蛋白不同糖型的質(zhì)子親和勢(shì)存在差異，各糖型的價(jià)態(tài)分布存在差異，因而各價(jià)態(tài)糖蛋白離子信號(hào)的m/z輪廓并不相同。這一現(xiàn)象使得傳統(tǒng)價(jià)態(tài)測(cè)定算法的基本假設(shè)(即不同價(jià)態(tài)信號(hào)的m/z輪廓一致)不再成立。由于糖蛋白離子信號(hào)的分辨率通常不足以達(dá)到同位素級(jí)別的分辨，即使使用超高分辨的質(zhì)量分析器(如軌道阱(Orbitrap)、傅里葉變換離子回旋共振(FTICR))也難以利用針對(duì)同位素分辨水平信號(hào)開(kāi)發(fā)的算法進(jìn)行價(jià)態(tài)測(cè)定[22-26]。因此，提高價(jià)態(tài)分辨率和準(zhǔn)確測(cè)定價(jià)態(tài)是測(cè)定完整異質(zhì)性蛋白分子質(zhì)量的2個(gè)先決條件。

對(duì)全部蛋白離子進(jìn)行價(jià)態(tài)系綜還原可以顯著提升價(jià)態(tài)分辨率，并通過(guò)提升m/z讀數(shù)允差提升價(jià)態(tài)測(cè)定的準(zhǔn)確性[27]。然而，系綜還原無(wú)法解決不同價(jià)態(tài)離子m/z輪廓不一致的問(wèn)題。與之相對(duì)應(yīng)的“有限價(jià)態(tài)還原”[28](本文稱(chēng)為“亞群還原”，便于與系綜還原區(qū)分)方法，首先利用四極桿或離子阱篩選出單一價(jià)態(tài)離子中質(zhì)量分布較窄的亞群，然后利用電子轉(zhuǎn)移[28-30]、電子捕獲[31]或質(zhì)子轉(zhuǎn)移還原(PTCR)反應(yīng)[27]實(shí)現(xiàn)這一亞群離子的價(jià)態(tài)還原。由于還原產(chǎn)物離子各價(jià)態(tài)的質(zhì)量分布(mass profile)與前體離子(precursor ion)相仿，且質(zhì)量分布范圍較窄并可人為控制前體離子篩選階段，這一方法可顯著提升電荷測(cè)定的準(zhǔn)確性，獲取價(jià)態(tài)信號(hào)難以分辨的高度異質(zhì)性蛋白的分子質(zhì)量。但這些方法需依賴(lài)基于電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)模塊，可利用的商品化儀器有限，限制了應(yīng)用。本課題組利用眾多型號(hào)儀器所具備的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)或高能碰撞解離(HCD)功能開(kāi)發(fā)了碎片互補(bǔ)原理的分析策略[4]，可將目標(biāo)蛋白上具有特定質(zhì)量分布的部分解離下來(lái)，利用碎裂反應(yīng)的質(zhì)量守恒關(guān)系(即前體離子分子質(zhì)量=碎片分子質(zhì)量+殘骸分子質(zhì)量)為前體離子的價(jià)態(tài)測(cè)定增加額外的約束條件，從而大幅提升價(jià)態(tài)測(cè)定以及分子質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確度。但相應(yīng)算法僅在抗體分子共價(jià)解離體系中得以證明，尚未在非共價(jià)復(fù)合物體系中應(yīng)用。

抗體蛋白在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且自身或偶聯(lián)產(chǎn)物可作為靶向生物藥物的實(shí)體形式，對(duì)其結(jié)構(gòu)和相互作用表征具有重要意義。質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于抗體分析[32-33]，其中非變性質(zhì)譜因勝任完整蛋白及其復(fù)合物分析、可維系關(guān)鍵非共價(jià)作用的特點(diǎn)，可為抗體分析提供修飾程度、高級(jí)結(jié)構(gòu)及相互作用等方面獨(dú)特的結(jié)構(gòu)信息[34-36]。因既往工作多側(cè)重于IgG類(lèi)抗體，其他類(lèi)型抗體因修飾、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性為質(zhì)譜分析帶來(lái)了更多挑戰(zhàn)。IgA是血清中高豐度抗體，起中和抗體的作用，并可介導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)的替代激活途徑。分泌型IgA為外分泌液中最主要的抗體，可在黏膜上抵御微生物感染，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮不可或缺的作用[37]。此外，IgA還可以母乳作為媒介，實(shí)現(xiàn)免疫功能的母嬰傳遞。新冠病毒感染產(chǎn)婦初乳中病毒特異性IgA的含量顯著提升，為新生兒消化道提供免疫收益[38]。IgA包括IgA1和IgA2亞型，其分子中均含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)[39]，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性[40]。IgA2亞型中，輕、重鏈之間可不以二硫鍵連接，且2種異性體中IgA2m(1)的2條輕鏈之間可直接形成二硫鍵[41]，呈現(xiàn)復(fù)雜的復(fù)合物體系。

本課題組擬針對(duì)含有非共價(jià)亞基的IgA2抗體及其尺寸變異體(size variant)復(fù)合物體系，使用碎片互補(bǔ)法分析完整蛋白復(fù)合物。通過(guò)平行使用碎片互補(bǔ)法、針對(duì)全體蛋白型系綜還原方法及針對(duì)蛋白型亞群有限還原方法的結(jié)果比較和交叉驗(yàn)證，對(duì)方法性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并提出可顯著提升準(zhǔn)確性、有效避免錯(cuò)誤鑒定的分析方案。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

使用Orbitrap Eclipse Tribrid質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品)進(jìn)行基于PTCR的質(zhì)譜測(cè)定，使用Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole Orbitrap質(zhì)譜儀(德國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品)進(jìn)行其他質(zhì)譜測(cè)定，儀器均配備靜態(tài)納升電噴霧離子源(nanoESI)；利用5424R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品)進(jìn)行溶液置換；采用DS-11+光譜儀(美國(guó)Denovix公司產(chǎn)品)測(cè)定蛋白樣品濃度。

1.2 主要材料與試劑

單克隆血清IgA2m(1)抗體(IgA2單抗)：北京愛(ài)博生生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；乙酸三甲基銨(TEAA，色譜級(jí))、間硝基芐醇(m-NBA，質(zhì)譜級(jí))：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；醋酸銨(NH4Ac，色譜級(jí))：阿拉丁(中國(guó))公司產(chǎn)品；截留分子質(zhì)量為50 ku的離心超濾套裝：美國(guó)Merck Millipore公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品制備 利用離心過(guò)濾將抗體樣品的原緩沖液置換為150 mmol/L醋酸銨溶液，制得濃溶液，以150 mmol/L醋酸銨溶液將蛋白濃溶液稀釋至1～2 μmol/L。對(duì)于需進(jìn)行系綜還原的樣品，將溶液中20%(mol/mol)的NH4Ac替換為T(mén)EAA，向需進(jìn)行增電荷處理的樣品溶液中加入1%m-NBA。

1.3.2質(zhì)譜條件 使用靜態(tài)納升電噴霧離子源進(jìn)樣。離子傳輸管溫度設(shè)為250 ℃。使用UHMR儀器測(cè)定時(shí)，分辨率設(shè)為50 000，檢測(cè)范圍設(shè)為m/z500～20 000。除特別說(shuō)明外，串聯(lián)質(zhì)譜隔離窗口寬度均設(shè)置為m/z100；使用高純氮?dú)?純度>99.99%)作為碰撞氣，在不產(chǎn)生非共價(jià)碎裂的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)碰撞能量。使用Eclipse儀器測(cè)定時(shí)，分辨率設(shè)為120 000，檢測(cè)范圍設(shè)為m/z350～8 000。除特別說(shuō)明外，串聯(lián)質(zhì)譜隔離窗口寬度均設(shè)置為m/z100；PTCR使用儀器標(biāo)配模塊，在20～40 ms區(qū)間調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Xcalibur、Biopharma Finder(Thermo Fisher Scientific)和Origin Pro(OriginLab，美國(guó))軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 IgA2單抗一級(jí)質(zhì)譜測(cè)定的誤差

IgA2m(1)單抗單體含由二硫鍵連接的2條輕鏈和2條重鏈，預(yù)期拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示于圖1a，其2條重鏈中每條含4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，數(shù)量為常見(jiàn)IgG1抗體的4倍，呈現(xiàn)高度異質(zhì)性。非變性條件下，高度糖基化蛋白不同價(jià)態(tài)的信號(hào)發(fā)生高度重疊，難以分辨[27]，且蛋白易發(fā)生凝集甚至沉淀，不適于進(jìn)行完整糖蛋白分析。在常規(guī)非變性條件下，本工作使用的IgA2樣品在一級(jí)質(zhì)譜(MS1)中呈現(xiàn)明顯區(qū)分的2簇信號(hào)：其中m/z較小的信號(hào)簇對(duì)應(yīng)物種記為物種Ⅰ，另一簇信號(hào)對(duì)應(yīng)物種記為物種Ⅱ。物種Ⅰ信號(hào)價(jià)態(tài)分辨率較高，其m/z分布范圍略高于IgG1單體[27, 42]，示于圖1b?？紤]到IgA2鏈稍長(zhǎng)于IgG1，且含有更多糖基鏈，每條糖基鏈的質(zhì)量范圍多在1～2 ku之間，IgA2單體的分子質(zhì)量高于IgG1，物種Ⅰ的信號(hào)分布與對(duì)IgA2單體信號(hào)的預(yù)期相符。使用常規(guī)算法對(duì)2簇信號(hào)進(jìn)行價(jià)態(tài)計(jì)算，可得將物種Ⅰ的價(jià)態(tài)+i指定為+24價(jià)，及物種Ⅱ的價(jià)態(tài)+j指定為+39價(jià)時(shí)，對(duì)應(yīng)的殘余(residual)偏差(σ)最低，此時(shí)計(jì)算所得的分子質(zhì)量分別為147.8和359.4 ku，示于圖1c。如前所述，IgA2單體的分子質(zhì)量應(yīng)略高于IgG1，而IgG1分子質(zhì)量多在148～150 ku范圍內(nèi)，因此物種A的分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果較預(yù)期偏小。由于此IgA2樣品按經(jīng)典表達(dá)純化方法制備[43]，推測(cè)不含背景蛋白，且表達(dá)體系中不含J-chain成分，因而推測(cè)物種Ⅱ?yàn)槲锓NⅠ的非J-chain連接二聚體。然而，物種Ⅱ的實(shí)測(cè)分子質(zhì)量顯著大于物種Ⅰ的2倍。上述相悖結(jié)果均表明，常規(guī)非變性條件下基于經(jīng)典算法進(jìn)行價(jià)態(tài)和分子質(zhì)量測(cè)定的可靠性存疑。對(duì)此，可利用TEAA對(duì)樣品進(jìn)行系綜還原，以提高價(jià)態(tài)分辨率、降低用于價(jià)態(tài)計(jì)算的m/z讀數(shù)誤差[27]。物種Ⅰ和Ⅱ的離子價(jià)態(tài)均顯著降低，隨著信號(hào)分布向高m/z端移動(dòng)，二者的價(jià)態(tài)分辨率顯著提升。使用經(jīng)典算法計(jì)算價(jià)態(tài)所得結(jié)果為：物種Ⅰ的價(jià)態(tài)+i指定為+18價(jià)，及物種Ⅱ的價(jià)態(tài)+j指定為+28價(jià)，對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量分別為147.6和352.5 ku，示于圖1d。分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果與系綜還原前接近，且仍然有悖于理論預(yù)期，表明價(jià)態(tài)分辨率的提升并不必然帶來(lái)價(jià)態(tài)和分子質(zhì)量測(cè)定準(zhǔn)確性的提升。

注：+i和+j分別表示物種Ⅰ和Ⅱ價(jià)態(tài)計(jì)算的最高價(jià)態(tài)；分別以黑/藍(lán)色及灰色標(biāo)注偏差最小值數(shù)據(jù)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量數(shù)值及經(jīng)后文所述方法測(cè)定價(jià)態(tài)對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量數(shù)值圖1 IgA2m(1)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖(a)及IgA2單抗在常規(guī)非變性條件下(黑色)及系綜還原條件下(藍(lán)色)的MS1譜圖(b)，使用經(jīng)典算法對(duì)系綜還原前后物種Ⅰ和物種Ⅱ進(jìn)行價(jià)態(tài)計(jì)算所得的殘余偏差分布(c，d)Fig.1 Schematics of the topologic structure of IgA2m(1) (a) and MS1 spectra of IgA2 mAb acquired under normal native condition (black) and ensemble reduction condition (blue) (b), plots of residuals corresponding to charge assignments using the classical approach for species Ⅰ and Ⅱ (c,d)

2.2 利用碰撞解離提升IgA2分子質(zhì)量測(cè)定及尺寸變異體鑒定的準(zhǔn)確性

針對(duì)IgA2復(fù)合物體系，利用基于CID或HCD將亞群有限還原方法及碎片互補(bǔ)策略進(jìn)行整合。對(duì)糖蛋白復(fù)合物離子中分子質(zhì)量分布較窄的一個(gè)亞群進(jìn)行質(zhì)量選擇后碰撞解離，一方面可以將具有特定分子質(zhì)量分布的大碎片從復(fù)合物中解離，碎片帶走大量電荷的同時(shí)使殘骸離子形成價(jià)態(tài)大幅降低的多個(gè)價(jià)態(tài)信號(hào)分布；另一方面，使母離子失去分子質(zhì)量可忽略的單電荷小碎片，產(chǎn)生價(jià)態(tài)逐一遞減的信號(hào)分布。質(zhì)量選擇操作減小了前體離子的蛋白型分布寬度，有利于降低譜圖復(fù)雜程度、提高價(jià)態(tài)分辨率、減小用于價(jià)態(tài)計(jì)算的m/z讀數(shù)誤差，同時(shí)新生成的價(jià)態(tài)內(nèi)，產(chǎn)物離子的質(zhì)量分布均來(lái)自前體離子被分選出的分布較窄的亞群，因而可顯著提升價(jià)態(tài)及分子質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確性。此外，碎裂反應(yīng)的質(zhì)量守恒可為分子質(zhì)量計(jì)算提供更嚴(yán)格的約束條件，有利于提升準(zhǔn)確性。將物種Ⅰ的單一價(jià)態(tài)(重新記為+i)內(nèi)亞群經(jīng)質(zhì)量選擇后進(jìn)行HCD碎裂，獲得2種碎片和相應(yīng)的殘骸產(chǎn)物示于圖2a。其中，較大的碎片分子質(zhì)量分布較均一，分子質(zhì)量為46.2 ku，可作為碎片互補(bǔ)法的強(qiáng)約束條件。這一分子質(zhì)量也與IgA2輕鏈二聚體的理論分子質(zhì)量相符，為非共價(jià)解離產(chǎn)物。較小的碎片分子質(zhì)量分布較寬，呈現(xiàn)似糖基化蛋白離子的異質(zhì)性分布特征，其平均分子質(zhì)量為24.4 ku。由于IgA2內(nèi)輕鏈更容易以非共價(jià)方式整體解離，該碎片應(yīng)為重鏈經(jīng)非共價(jià)鍵解離所得，異質(zhì)性來(lái)源可能為重鏈上的糖基化，或非特異性碎裂位點(diǎn)的空間分布。由于重鏈內(nèi)存在多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵并且與結(jié)構(gòu)域封裝相對(duì)應(yīng)，可檢測(cè)到的碎片應(yīng)為結(jié)構(gòu)域之間短片段內(nèi)斷裂所得的單一結(jié)構(gòu)域碎片。由于Fc結(jié)構(gòu)域更長(zhǎng)且糖基化位點(diǎn)更多，這些碎片的分子質(zhì)量數(shù)值更接近重鏈的(CH+VH)結(jié)構(gòu)域。這些碎片來(lái)自非共價(jià)解離且分子質(zhì)量分布較寬，其對(duì)應(yīng)的殘骸分子質(zhì)量碎片也產(chǎn)生較寬的分子質(zhì)量分布，且有更大可能發(fā)生顯著的中性丟失，因而24.4 ku的數(shù)值在碎片互補(bǔ)算法中僅能用作弱約束條件。平行比較上述2種碎片對(duì)應(yīng)的測(cè)定結(jié)果有助于評(píng)價(jià)碎片互補(bǔ)法的適用條件。

當(dāng)使用46.2 ku解離的約束條件時(shí)，分別以前體離子經(jīng)有限還原所得的價(jià)態(tài)分布(+i系列)和相應(yīng)殘骸離子(分子質(zhì)量記為M(r))的價(jià)態(tài)分布(+j系列)進(jìn)行殘余偏差分析，可得+i指定為25時(shí)，前體離子分子質(zhì)量(記為M(p))偏差最小，M(p)為167.6 ku；相應(yīng)地，+j指定為13時(shí)，殘骸離子分子質(zhì)量偏差最小，M(r)為122.9 ku；引入碎裂反應(yīng)質(zhì)量守恒關(guān)系構(gòu)建矩陣，則僅當(dāng)+i歸屬為25、+j歸屬為13時(shí)，殘余虧損(記為ΔM)最小，價(jià)態(tài)計(jì)算結(jié)果相同，示于圖2b。此時(shí)，物種Ⅰ的分子質(zhì)量測(cè)定值為167.6 ku，符合對(duì)IgA2單體分子質(zhì)量的預(yù)期。而當(dāng)使用24.4 ku解離作為約束條件時(shí)，相應(yīng)殘骸離子最小殘余偏差對(duì)應(yīng)的價(jià)態(tài)(+j’系列)和分子質(zhì)量分別為+18和136.3 ku，引入質(zhì)量守恒關(guān)系矩陣后按最小ΔM指向的物種Ⅰ分子質(zhì)量變?yōu)?60.6 ku，示于圖2c。這一數(shù)值與系綜還原條件下任意價(jià)態(tài)歸屬所對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量均有4 ku以上的偏差，顯著大于因去溶劑化等因素造成的分子質(zhì)量偏移水平，表明這一價(jià)態(tài)歸屬不具有合理性。考慮到譜圖中呈現(xiàn)的減電荷前體離子信號(hào)可能已包含中性碎裂丟失的貢獻(xiàn)，此時(shí)如將MS1條件下的前體離子價(jià)態(tài)分布引入矩陣，則可將物種Ⅰ的分子質(zhì)量定位至168.5 ku，與強(qiáng)約束條件下所得結(jié)果僅相差0.9 ku，示于圖2d。

注：a圖的插圖表示碎片離子信號(hào)的放大譜圖；對(duì)于前體離子、對(duì)應(yīng)46.2 ku和24.4 ku碎片的殘骸離子，分別以+i、+j及+j’表示價(jià)態(tài)計(jì)算的最高價(jià)態(tài)圖2 IgA2單抗樣品中物種Ⅰ的串聯(lián)質(zhì)譜圖(質(zhì)量選擇窗口為m/z 6 680～6 780)(a)，以46.2 ku碎片為約束條件的價(jià)態(tài)計(jì)算矩陣(b)，以24.4 ku碎片為約束條件的價(jià)態(tài)計(jì)算矩陣(c)，以及以24.4 ku碎片為約束條件，并以物種Ⅰ的MS1價(jià)態(tài)分布取代前體離子MS2價(jià)態(tài)分布所得的價(jià)態(tài)計(jì)算矩陣(d)Fig.2 Tandem mass spectra of species I in IgA2 mAb sample (with a mass-selection window of m/z 6 680-6 780) (a), and the charge determination matrix using the 46.2 ku fragment as the constraint (b), the charge determination matrix using the 24.4 ku fragment as the constraint (c), and the charge determination matrix using the 24.4 ku fragment as the constraint, with the charge distribution of the precursor ions in MS2 replaced with that of species 1 ions in MS1

使用同樣方式分析物種Ⅱ，經(jīng)質(zhì)量選擇的亞群在HCD下僅解離出單一碎片，即分子質(zhì)量分布均一的46.2 ku物種，與物種Ⅰ的主要碎片相同，示于圖3a。此處未檢測(cè)到共價(jià)解離產(chǎn)物，可能是由于物種Ⅱ分子質(zhì)量較大，對(duì)于碰撞能量的耐受較強(qiáng)，因而僅優(yōu)先發(fā)生所需能量較少的非共價(jià)解離。分別將前體離子及殘骸離子的價(jià)態(tài)分布引入以46.2 ku碎片為約束條件的價(jià)態(tài)計(jì)算矩陣后，可得物種Ⅱ?qū)?yīng)分子質(zhì)量為337.4 ku時(shí)ΔM最小(絕對(duì)值低于0.5 ku)，示于圖3b。結(jié)合物種Ⅰ的測(cè)定結(jié)果，337.4 ku的數(shù)值較單體分子質(zhì)量167.6或168.5 ku的2倍分別相差2.2和0.4 ku，與IgA2二聚體的分子質(zhì)量預(yù)期相符。對(duì)物種Ⅰ和物種Ⅱ的串聯(lián)質(zhì)譜分析表明，當(dāng)碎片為特異性解離產(chǎn)物且分子質(zhì)量分布較均一時(shí)，可作為強(qiáng)約束條件，在利用碎片互補(bǔ)法進(jìn)行價(jià)態(tài)和分子質(zhì)量測(cè)定時(shí)提供較高的準(zhǔn)確度，結(jié)果穩(wěn)定可靠。當(dāng)碎片特異性較差、分子質(zhì)量存在一定范圍分布時(shí)，其作為約束條件的可靠性減弱，可能會(huì)造成價(jià)態(tài)誤判和相應(yīng)的分子質(zhì)量誤差。采用MS1譜圖中的價(jià)態(tài)分布取代MS2譜圖中前體離子的價(jià)態(tài)分布可在一定程度上彌補(bǔ)價(jià)態(tài)測(cè)定的偏差，但需以MS1譜圖中充分的價(jià)態(tài)分離度為前提。將上述可靠性更高的分子質(zhì)量結(jié)果代入系綜還原條件下基于MS1所得的價(jià)態(tài)歸屬圖，結(jié)果示于圖1d?？梢?jiàn)，雖然物種Ⅰ、Ⅱ經(jīng)系綜還原后的分子質(zhì)量測(cè)定仍存在偏差，但相比于準(zhǔn)確分子質(zhì)量所對(duì)應(yīng)的價(jià)態(tài)歸屬，價(jià)態(tài)偏差由還原前的3個(gè)及2個(gè)單位，減小至還原后的2個(gè)及1個(gè)單位，表明降低價(jià)態(tài)可對(duì)價(jià)態(tài)及分子質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確性提供收益，但僅通過(guò)MS1數(shù)據(jù)難以保證準(zhǔn)確度的提升，仍需借助基于串聯(lián)質(zhì)譜的方案提升結(jié)果的可靠性。

2.3 利用基于質(zhì)子轉(zhuǎn)移的有限還原驗(yàn)證分子質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確性

基于PTCR的亞群有限還原法已被證明是測(cè)定完整糖蛋白分子質(zhì)量準(zhǔn)確性最高的方法[27]。為直接驗(yàn)證利用碎片互補(bǔ)法所得分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基于PTCR反應(yīng)的亞群有限還原法，以更高的準(zhǔn)確度[27]平行測(cè)定IgA2的分子質(zhì)量。由于IgA2在非變性條件下的單體信號(hào)已超過(guò)可提供PTCR功能的商品化儀器的檢測(cè)范圍，無(wú)法檢測(cè)其還原產(chǎn)物信號(hào)。因此，首先利用增電荷試劑對(duì)樣品信號(hào)進(jìn)行提升價(jià)態(tài)、減小m/z的處理。然而，由于增電荷試劑m-NBA在一定程度上會(huì)產(chǎn)生破壞蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的作用[44]，引入1%m-NBA后，IgA2會(huì)發(fā)生解離，MS1譜圖中主要呈現(xiàn)輕鏈二聚體(L2)、重鏈二聚體(H)及疑似重鏈碎片(FH)的信號(hào)，示于圖4a。選取重鏈單一價(jià)態(tài)的2個(gè)亞群分布分別進(jìn)行基于PTCR的有限還原，2個(gè)質(zhì)量選擇窗口(W1及W2)下的前體離子均產(chǎn)生了2個(gè)價(jià)態(tài)系列的還原產(chǎn)物，示于圖4b。這是由于重鏈分子質(zhì)量分布較寬、相鄰價(jià)態(tài)離子的m/z分布發(fā)生重疊，且增電荷處理后信號(hào)重疊程度增大，因此，每個(gè)質(zhì)量選擇窗口下選擇的前體離子均包括相鄰2個(gè)價(jià)態(tài)蛋白型中低價(jià)態(tài)的低分子質(zhì)量部分和高價(jià)態(tài)的高分子質(zhì)量部分，體現(xiàn)了分子質(zhì)量分布的邊界。將2個(gè)價(jià)態(tài)系列所得的邊界分子質(zhì)量取平均值，可得系綜平均分子質(zhì)量。2個(gè)窗口下所得的重鏈系綜平均分子質(zhì)量分別為59.7和59.9 ku，取其平均值59.8 ku計(jì)，則2條重鏈與輕鏈二聚體的分子質(zhì)量之和為165.8 ku?？紤]到大復(fù)合物離子測(cè)定中的去溶劑化誤差[45]，這一結(jié)果與基于碰撞解離的碎片互補(bǔ)法所得的IgA2單體及二聚體結(jié)果吻合較好(偏差超過(guò)相鄰數(shù)值價(jià)態(tài)指認(rèn)造成的分子質(zhì)量偏差)，表明在碎片特異性較好的前提下，基于碰撞解離的碎片互補(bǔ)法足以提供充分的質(zhì)量準(zhǔn)確性。

注：a圖中插圖為碎片離子信號(hào)的放大譜圖；對(duì)于前體離子及對(duì)應(yīng)46.2 ku碎片的殘骸離子，分別以+i及+j表示價(jià)態(tài)計(jì)算的最高價(jià)態(tài)圖3 IgA2單抗樣品中物種Ⅱ的串聯(lián)質(zhì)譜圖(質(zhì)量選擇窗口為m/z 9 150～9 250)(a)以及以46.2 ku碎片為約束條件的價(jià)態(tài)計(jì)算矩陣(b)Fig.3 Tandem mass spectra of species Ⅱ in IgA2 mAb sample (with a mass-selection window of m/z 9 150-9 250) (a) and the charge determination matrix using the 46.2 ku fragment as the constraint (b)

注：a圖中插圖為重鏈單體離子的局部信號(hào)圖，紅、藍(lán)陰影覆蓋區(qū)域指示2個(gè)質(zhì)量選擇窗口W1和W2的范圍；b中箭頭所示為前體離子，還原所得的2個(gè)價(jià)態(tài)系列的信號(hào)峰分別標(biāo)注其對(duì)應(yīng)的價(jià)態(tài)和分子質(zhì)量圖4 IgA2單抗樣品在增電荷條件下所得的M1譜圖(a)以及經(jīng)W1和W2選擇所得亞群的PTCR還原譜圖(b)Fig.4 MS1 spectra of IgA2 mAb acquired under super-charging condition (a) and PTCR spectra of subpopulations of the heavy chain proteoforms with windows W1 and W2 (b)

3 結(jié)論

本工作使用非變性質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜，在完整蛋白復(fù)合物層面表征了IgA2單抗樣本中因高度糖基化導(dǎo)致的異質(zhì)性蛋白型分布及尺寸變異體。針對(duì)因復(fù)雜糖基化導(dǎo)致的價(jià)態(tài)及分子質(zhì)量測(cè)定偏差問(wèn)題，對(duì)全部蛋白型進(jìn)行系綜價(jià)態(tài)還原可提供一定收益，但僅基于MS1數(shù)據(jù)難以保證準(zhǔn)確性。利用串聯(lián)質(zhì)譜針對(duì)特定蛋白型亞群進(jìn)行有限價(jià)態(tài)還原可提供更高的準(zhǔn)確性。當(dāng)不具備進(jìn)行基于電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)條件時(shí)，可采用基于碰撞解離的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合碎片互補(bǔ)原理提升價(jià)態(tài)及分子質(zhì)量測(cè)定的準(zhǔn)確性，且準(zhǔn)確性與碎片特異性和碎片分子質(zhì)量均一性正相關(guān)。這一策略可為復(fù)雜糖蛋白復(fù)合物體系在完整層面的準(zhǔn)確分析提供普適性的方案。

致謝：感謝北京愛(ài)博生生物技術(shù)有限公司(Absea)提供IgA2單抗樣品；感謝昌平實(shí)驗(yàn)室質(zhì)譜平臺(tái)對(duì)本工作的支持。