何春嫻，陳靖枝，楊靜玲，李舂龍,3，馬曉莉,3，南澤東,3，江志波,3

(1.福州大學化學學院，福建 福州 350108；2.北方民族大學化學與化學工程學院，化工技術基礎國家民委重點實驗室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏低品質(zhì)資源高值化利用技術研發(fā)人才小高地，寧夏 銀川 750021)

寧夏枸杞LyciumbarbarumL.與枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮均作為中藥地骨皮在臨床上使用[1]。地骨皮無毒、味甘、性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有涼血除蒸、清肺降火之功效，臨床上常用于治療陰虛潮熱、骨蒸盜汗、內(nèi)熱消渴等病癥[2]。目前，對地骨皮的化學成分和藥理活性的研究主要集中于枸杞的干燥根皮，而對寧夏枸杞根皮的研究則鮮有報道。研究表明[2-8]，以枸杞干燥根皮為來源的地骨皮粗提物包含萜類、甾醇類、有機酸、生物堿、環(huán)肽類等化學成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒等多種藥理活性。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術因具有高靈敏度、低檢出限等優(yōu)點，在復雜樣品分析檢測中發(fā)揮了重要作用，已成為中草藥研究的重要工具[9]。隨著人們對中藥化學成分研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)的化合物數(shù)量已超過百萬種，發(fā)現(xiàn)新結構、新活性化合物的難度不斷增加[10]。對復雜的海量HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)的高通量分析和處理制約了串聯(lián)質(zhì)譜在中草藥分析中的應用，如果不能將全部數(shù)據(jù)進行解讀，必將造成數(shù)據(jù)浪費[11]。因此，需要開發(fā)新方法分析中草藥中的微量化學成分。

近年來，分子網(wǎng)絡化(MN)作為化合物分析的重要輔助手段，在復雜樣品的化學成分識別、檢測和分離技術等方面得到了廣泛應用[12-13]。它基于不同串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中相似或相同的碎片離子和中性丟失可能代表結構(片段)的相似或相同，從而將結構相關的化合物按照相似程度進行可視化聚類。目前，分子網(wǎng)絡化分析是在GNPS(global natural products social molecular networking, https:∥gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp)網(wǎng)站實現(xiàn)的。GNPS是由全世界質(zhì)譜學家聯(lián)合組織的基于網(wǎng)絡的質(zhì)譜系統(tǒng)，迄今為止已形成包含近70萬種化合物的MS/MS免費數(shù)據(jù)庫，可對樣品的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析比較，將具有相似結構的化合物網(wǎng)絡化聚類[14]，以成簇發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物，為全面研究復雜的HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)提供幫助。因此，分子網(wǎng)絡化可實現(xiàn)對中草藥的常量化合物的結構排重、微量化合物的結構分析和結構類似物的聚類分析。Liang等[12,15-16]將分子網(wǎng)絡化技術應用于微生物化學、天然產(chǎn)物化學和天然藥物化學，分析了不同物種中的微量化學成分，發(fā)現(xiàn)了尿苷肽類、黃酮類、皂苷類和二萜生物堿類等多種化學成分。

本研究擬基于高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF MS)和分子網(wǎng)絡化技術分析寧夏枸杞根皮水提物的化學成分，旨為寧夏枸杞根皮來源地骨皮的質(zhì)量控制提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 6530 Q-TOF系統(tǒng)(包含電噴霧離子源、自動進樣器、柱溫箱)、ZORBAX Extend C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：美國Agilent公司產(chǎn)品；FA1004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

寧夏枸杞根皮：2021年采自寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市中寧縣，由北方民族大學生物科學與工程學院任玉峰教授鑒定為寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的根皮，現(xiàn)保存于北方民族大學植物標本室(標本號為NMUDGP-20190718-1)。

乙腈：色譜純，上海泰坦公司產(chǎn)品；屈臣氏蒸餾水：深圳屈臣氏蒸餾水有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇：分析純，北京化工廠產(chǎn)品；Sep-Pack C18固相萃取柱：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3 供試品溶液的制備

稱取20.0 g干燥寧夏枸杞根皮，浸泡于100 mL純水中，油浴加熱至微沸(油溫控制在100 ℃)，提取2 h后，用紗布過濾，收集濾液。重復提取濾渣3次，合并所有濾液，減壓蒸餾(< 40 ℃)至殘留液體積約為100 mL。取10.0 mL殘留液于15.0 mL離心管，以3 000 r/min離心10 min，上清液轉移至10.0 mL注射器中，連接Sep-Pak C18固相萃取柱，依次使用2 mL純水、50%甲醇水溶液和純甲醇進行洗脫，其中50%甲醇水洗脫液用于HPLC-Q-TOF MS分析。

1.4 實驗條件

1.4.1色譜條件 Agilent ZORBAX Extend C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A為水，B為乙腈；等度洗脫條件：0～40 min (5%～95%B)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正、負離子檢測模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力310 kPa；毛細管電壓4.5 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z100～300、300～2 000。

1.5 分子網(wǎng)絡化分析條件

采用ProteoWizard軟件將HPLC-MS/MS采集得到的原始二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)文件轉化為mzXML格式，在GNPS上建立分子網(wǎng)絡；運用Cytoscape軟件使其可視化，然后借助GNPS平臺分析分子網(wǎng)絡化，得出已知化合物；再根據(jù)分子網(wǎng)絡中節(jié)點與節(jié)點之間的相關性，比較相關節(jié)點間質(zhì)譜數(shù)據(jù)的異同，得出已知化合物的類似物或其他未知物。

計算參數(shù)設置：MS/MS碎片離子容差為0.5 u；母離子的m/z公差為1.0；最小余弦分數(shù)為0.6；最小匹配碎片離子為4個；網(wǎng)絡TOPK為10。使用Cytoscape 3.4.0軟件繪制網(wǎng)絡圖。

2 結果與討論

2.1 總離子流圖分析

寧夏枸杞根皮在正、負離子模式下的總離子流圖示于圖1。可以看出，低質(zhì)量數(shù)(m/z100～300，圖1a,1b)的離子峰數(shù)量比高質(zhì)量數(shù)(m/z300～2 000，圖1c,1d)的少，且正離子模式下最高峰豐度大于負離子模式下最高峰豐度。保留時間主要位于10～30 min，結合固相萃取處理時50%甲醇水溶液洗脫，推測樣品中的化合物以中等極性為主。通過分析二級質(zhì)譜碎片離子和特征丟失數(shù)據(jù)，并借助文獻[15]，鑒定了21個化合物，包括4個有機酸或酯類(1～4)、12個有機含氮化合物(5～16)和5個其他類型結構(17～21)，列于表1。

注：a,b.m/z 100～300；c,d.m/z 300～2 000圖1 寧夏枸杞根皮在正(a,c)、負(b,d)離子模式的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms (TIC) of the root bark of Lycium barbarum L. in positive (a,c) and negative (b,d) modes

表1 HPLC-Q-TOF MS鑒定寧夏枸杞根皮化合物Table 1 Chemical compounds of the root bark of Lycium barbarum L. by HPLC-Q-TOF MS

續(xù)表1

續(xù)表1

2.1.1有機酸類化合物 有文獻[17]報道，利用系統(tǒng)化學分離的方法從枸杞干燥根皮來源的地骨皮提取物中分離得到31個有機酸及其酯類化合物。本研究在寧夏枸杞干燥根皮水提物的50%甲醇洗脫液中提取潛在有機酸化合物離子，根據(jù)二級質(zhì)譜圖的特征碎片離子，確定了4個已知的有機酸，示于圖2?；衔?、3、4為長鏈不飽和脂肪酸，通過中性丟失和特征裂解，發(fā)現(xiàn)負離子模式下m/z59離子可作為脂肪酸存在的證據(jù)之一。在化合物2、3、4中均發(fā)生CO2(44 u)的丟失，表明其結構中存在酰氧基或羧基。

2.1.2有機含氮類化合物 早期人們對枸杞L.chinenseMill.的干燥根皮來源地骨皮的研究表明[17]，其含有豐富的有機含氮活性成分，包括莨菪烷型、吡啶型、精胺型、酰胺型等結構，其中地骨皮甲素、地骨皮乙素、二氫咖啡酰酪胺、咖啡酰酪胺等酰胺類化合物備受關注。但對寧夏枸杞根皮來源地骨皮的有機含氮化合物的報道較少。本研究對寧夏枸杞根皮的地骨皮樣品進行測定并提取數(shù)據(jù)，通過與枸杞干燥根皮含氮化合物的結構對比，發(fā)現(xiàn)了12個化合物的準分子離子峰，以準分子離子為母離子進行二級質(zhì)譜分析，推測它們的裂解途徑，結果示于圖3。在負離子模式下，所有化合物均在酰胺基團附近發(fā)生裂解。化合物5和6分別為線性和支鏈結構，且在化合物6的裂解過程中，支鏈末端依次丟失氨基(m/z514)、甲氨基(m/z499)和乙氨基(m/z485)，可作為區(qū)分二者的差異離子。化合物14、15、16均為環(huán)八肽類結構，中心環(huán)肽結構通過色氨酸吲哚氮原子與甘氨酸的α碳原子以σ鍵關環(huán)形成，三肽支鏈通過甘氨酸氨基與中心環(huán)肽連接。通過分析質(zhì)譜碎裂途徑，發(fā)現(xiàn)支鏈與中心環(huán)連接的部位最容易斷裂，如化合物14和15的m/z501離子，以及化合物16的m/z527離子，均為中心五肽環(huán)的碎片離子。

圖2 寧夏枸杞根皮中有機酸及酯類化合物Fig.2 Organic acids and esters in the root bark of Lycium barbarum L.

2.1.3其他類型化學成分 參考文獻[17]報道的枸杞干燥根皮來源的地骨皮成分，發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞根皮存在一些其他結構類型的物質(zhì)，如香豆素苷(17)、蒽醌苷(18)、木脂素苷(19)、綠原酸(20)和簡單香豆素(21)，示于圖4。在二級質(zhì)譜圖中，都具有糖基特征離子(m/z161或163)或糖基的中性丟失(-162 u)，可據(jù)此確定結構中存在六碳糖基。如化合物19的母離子失去162 u得到苷元離子m/z359，為失去葡萄糖基的特征裂解。對化合物21進行MS2分析，得到二級碎片離子m/z133、105和77，可能是其準分子離子依次失去1個CO分子形成的。

2.2 分子網(wǎng)絡化分析

利用分子網(wǎng)絡化技術對寧夏枸杞根皮50%甲醇水洗脫液在負離子模式下m/z100～300和300～2 000范圍的數(shù)據(jù)進行聚類分析，結果示于圖5。由化合物2、22、23組成的子集表明，化合物22、23為化合物2的結構類似物，根據(jù)二者的二級質(zhì)譜圖推測其結構示于圖6。化合物14和15為早期從地骨皮中發(fā)現(xiàn)的環(huán)八肽類化合物，其準分子離子分別為m/z872.3和895.3?；衔?4的準分子離子為m/z1 035.4，與化合物14具有多個相同的碎片離子，在網(wǎng)絡中具有相關性，提示二者可能具有相似的化學結構。與化合物14中心環(huán)的特征碎片離子m/z501、471、454相比，化合物24的特征碎片離子為m/z664、634、617，分別增加了163 u。而且化合物24的準分子離子(m/z1 035.4[M + H]+)與其碎片離子m/z664之間的差值(Δ371 u)等于化合物14的支鏈質(zhì)量，表明化合物24與14具有相同的支鏈。因此，化合物24比14多的163 u只可能發(fā)生在中心環(huán)上，且為化合物14中心環(huán)插入1個酪氨酸。結合環(huán)肽類化合物16的裂解過程(圖3)，推測化合物24的斷裂位點也是以酰胺鍵裂解為主，通過分析碎片離子特征，確定酪氨酸殘基位于色氨酸與蘇氨酸之間。與化合物14相比，化合物24在氨基酸環(huán)上增加了1個酪氨酸，由環(huán)八肽變?yōu)榄h(huán)九肽。同樣，化合物25(分子離子峰為m/z1 058.4)與化合物15具有相關性，表明二者可能為結構類似物，進而可以確定化合物25的化學結構?；衔?6～30與GNPS數(shù)據(jù)庫收錄的化合物一致。

在由99個離子組成的子集中，化合物5或(和)6的準分子離子為m/z529.1，由于缺乏已知化合物對比，目前無法解析；化合物19(m/z521.3)、31(m/z581.2)、32(m/z683.2)具有直接相關性，表明三者具有相似結構，化合物31的準分子離子比化合物19的大60 u，推測化合物31可能比化合物19多2個甲氧基?；衔?2的準分子離子比化合物19的大162 u，可能為六碳糖基，推測化合物31和32的結構分別為Lyciumboside A和Lyciumboside B。化合物24、25、31和32均為首次從地骨皮中發(fā)現(xiàn)的新結構，且24和25可能為寧夏枸杞根皮中特有的環(huán)九肽類成分。

圖3 寧夏枸杞根皮中含氮化合物Fig.3 Known nitrogenous compounds in the root bark of Lycium barbarum L.

圖4 寧夏枸杞根皮中其他類型化合物Fig.4 Other compounds in the root bark of Lycium barbarum L.

圖6 通過網(wǎng)絡化聚類分析發(fā)現(xiàn)的化合物結構Fig.6 Identified chemical structures by molecular networking analysis

3 結論

本研究利用HPLC-Q-TOF MS技術分析寧夏枸杞根皮水提物，發(fā)現(xiàn)了21個已知化合物，與枸杞根皮具有相似的化學組成。借助分子網(wǎng)絡化技術在負離子模式下發(fā)現(xiàn)并解析了11個化合物，均為首次在地骨皮中報道，其中化合物24和25為首次在地骨皮中檢測到的環(huán)九肽類成分，為進一步研究地骨皮中環(huán)肽類化學成分生物合成機制奠定了基礎。該方法快速、簡便、準確、消耗樣品少，為解析中草藥微量成分的化學結構提供了思路。

致謝：感謝中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院、甘肅省油氣資源研究重點實驗室的房嬛研究員和陳永欣副研究員提供的質(zhì)譜測試工作；感謝北方民族大學生物科學與工程學院任玉峰教授提供的物種鑒定工作。