莊小禹，邊新宇，劉 舒，劉志強，宋鳳瑞

(1.上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201303；2.中國科學院長春應用化學研究所，長春質譜中心&吉林省中藥化學與質譜重點實驗室，吉林 長春 130022)

蛋白質為動態(tài)實體，要全面了解蛋白質的結構與功能之間的關系，以及蛋白質與配體相互作用對其空間構象的影響，需要能夠及時捕捉其構象轉變，這對許多“經典”的高分辨結構生物學工具(如X射線晶體學、核磁共振和電子顯微鏡等)提出挑戰(zhàn)。這些方法雖然各具優(yōu)點，但通常只能提供樣品的總體信息，難以對復雜體系中各類蛋白質構象或蛋白質聚集前體進行研究，且無法直接獲取關于蛋白質及其復合物相對分子質量及蛋白質復合物結合計量比方面的信息。離子淌度譜(ion mobility spectrometry, IMS)[1]可以分離質量相同而形狀不同的離子，與準生理條件下分析和研究生物大分子高級結構、相互作用和動力學的非變性質譜(native mass spectrometry, native MS)聯(lián)用，不僅可以表征單體蛋白的動態(tài)構象，還能夠對蛋白復合體功能、結構和組裝形式，以及蛋白-配體相互作用進行研究。近年來，由于非變性離子淌度質譜(native ion mobility-mass spectrometry, native IM-MS)可以高靈敏、快速地分析蛋白質混合物中的構象變化，已逐漸成為結構生物學研究的有力工具，并被應用于蛋白質構象、蛋白質-配體相互作用、蛋白質錯誤折疊、聚集的動力學研究等領域[2-6]，為傳統(tǒng)的結構生物學研究提供了豐富的互補信息。

1 離子淌度質譜的基本原理及特點

離子淌度譜(IMS)又稱離子遷移譜，是根據(jù)氣相離子在電場和氣流形成的漂移區(qū)內遷移率不同而分離離子的方法。傳統(tǒng)IMS測定的是離子在漂移管中的漂移時間(drift time,tD)，不僅取決于離子的質量、帶電荷數(shù)，還與其大小和形狀相關。氣相離子進入漂移管后，在電場驅動過程中與惰性漂移氣體(通常為氦氣、氬氣或氮氣)不斷發(fā)生碰撞。通常體積較大的離子比體積較小的離子與漂移管中氣體發(fā)生碰撞的機會更多，因此遷移得更慢。由于碰撞次數(shù)與離子的表面積成正比，IMS測定的漂移時間可用于確定離子旋轉時的平均碰撞截面積(collision cross section, CCS)，其反映了離子的形狀和大小。在蛋白質等生物大分子的結構研究中，離子的碰撞截面積可以直接反映蛋白質的三維形狀和復合物堆疊方式。

目前，已有多種離子淌度技術被開發(fā)并應用[7-9]，較為常見的有漂移時間離子淌度譜(drift-time ion mobility spectrometry, DTIMS)、行波離子淌度譜(travelling-wave ion mobility spectrometry, TWIMS)、捕集離子淌度譜(trapped ion mobility spectrometry, TIMS)、高場非對稱離子淌度譜(field-asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)，示于圖1。按照電場強度劃分，上述前3種可稱為低場離子淌度，最后一種為高場離子淌度。使用低場離子淌度的優(yōu)勢是可以確定離子遷移率與CCS之間的關系，因此可以根據(jù)實驗中測定的漂移時間推導離子的碰撞截面積，這對于研究未知結構的蛋白單體和復合物尤為重要。

除上述幾種離子淌度技術，目前正在開發(fā)或已投入使用的還有回旋離子淌度、串聯(lián)離子淌度、超長路徑-無損離子淌度。這些新技術都使離子淌度向著高分辨、高靈敏的方向發(fā)展。

2 離子淌度質譜可獲取的數(shù)據(jù)及信息形式

2.1 漂移時間

離子的漂移時間是離子淌度譜直接獲取的數(shù)據(jù)形式，反映了離子的碰撞截面積大小?；陔x子的漂移時間分離離子，為傳統(tǒng)質譜增加了一個分離維度，獲得包含離子質荷比 (m/z)、離子豐度和漂移時間的三維信息譜圖。因此，IM-MS不僅可以提供結構信息，還可通過將數(shù)據(jù)分布到第三維來分離重疊峰，從而分析組成高度相似的異質或多分散復合物。

2.2 漂移時間分布

漂移時間分布(arrival time distribution, ATD)峰半高處的漂移時間寬度可以反映蛋白質和復合物的結構異質性，尖而窄的峰表示單一構象，而較寬的峰則表明共存多種狀態(tài)的構象，溶液中蛋白質組裝體的構象多樣性。因此，可以通過ATD確定蛋白質相互作用和/或底物結合對所分析蛋白質構象分布的影響。

圖1 4種離子淌度技術的基本結構與原理[7]Fig.1 Principle and structure of four main types of ion mobility instruments[7]

2.3 碰撞截面積

通過測定每個電荷狀態(tài)下的ATD，可以直接或間接計算CCS。CCS也被稱為旋轉平均碰撞截面積，代表離子與漂移氣體碰撞的有效截面積，類似于投影面積。CCS可用于反映離子的結構特征。實驗中測得的CCS是分析離子構型的重要評分指標，可以與其他由已知或推測結構計算的CCS進行對比[10]。

2.4 碰撞誘導去折疊

通過對氣相離子的碰撞活化作用，可以豐富IM-MS實驗的數(shù)據(jù)量。當需要區(qū)分結構上具有細微差異的蛋白質，以及研究蛋白質構象穩(wěn)定性時，可以通過碰撞誘導去折疊(CIU)實驗進行分析。在CIU實驗中，逐步升高碰撞能量(collision energy, CE)使蛋白離子活化，并由于庫侖斥力的作用誘導蛋白構型發(fā)生變化或部分展開，之后經過淌度分離和質譜檢測，能夠區(qū)分同一質荷比下緊湊和伸展的蛋白構象，使用CCS即可判別和量化構象變化[11]。通過CIU指紋圖譜可以更清晰直觀地觀察蛋白活化時的構象變化，不僅可以識別配體或蛋白伴侶鍵合對蛋白結構的影響，還可以區(qū)分源于蛋白多樣性(如可變剪接、基因復制、翻譯后修飾)的蛋白質異構體。

3 非變性離子淌度質譜在蛋白質結構相關研究領域中的應用

3.1 鑒定單體蛋白折疊結構

蛋白表面的不穩(wěn)定修飾可以通過動態(tài)調控蛋白表面的化學微環(huán)境而影響蛋白的局域結構，從而可能介導目標蛋白的特定功能，但一直缺乏合適的結構化學分析手段。Li等[12]利用非變性離子淌度方法，使用非靶向全離子去折疊(AIU)和碎裂(AIF)的方式，高通量無損操控蛋白的氣相結構，快速有效剖析糖基化中唾液酸化修飾對轉鐵蛋白化學、構象、拓撲穩(wěn)定性的影響。將開發(fā)的AIU技術用于對差異唾液酸化修飾的轉鐵蛋白進行構象穩(wěn)定性分析，雖然在所有的唾液酸化糖蛋白中都存在多次構象轉變，但在相同的活化能范圍內，這些轉鐵蛋白會經歷不同的去折疊軌跡。因此，根據(jù)不同的3D展開軌跡圖可以很好地分辨3種轉鐵蛋白。

在生物制藥領域，離子淌度質譜可在單克隆抗體(mAb)和抗體偶聯(lián)藥物(ADC)等藥用蛋白的生產過程中提供完整蛋白的修飾信息和其他特征[13]。如人免疫球蛋白G2(IgG2)具有多種二硫鍵差異導致的異構體形式，這些異構體具有不同的功能、活性。Bagal 等[14]利用離子淌度質譜解析了這些異構體，并通過分析去糖基化以及二硫鍵相關位點突變的各種變體，證實了二硫鍵是引起這些異構體結構差異的關鍵因素。ADC藥物通常存在因小分子藥物與抗體偶聯(lián)位置不同而產生的位置異構體。變性實驗條件會破壞ADC子域之間的非共價相互作用，因此半胱氨酰連接的ADC難以通過液相色譜-質譜聯(lián)用分析抗體比率(DAR)值。Marcoux等[15]將非變性離子淌度譜結合高分辨質譜應用于ADC分析，并給出了指導性建議，包括從去糖基化ADC的非變性離子淌度譜獲得藥物的平均偶聯(lián)量和通過計算CCS得到的微小結構變化來區(qū)分載藥量的差異。對于一些結構差異太細微，不能通過直接比較碰撞截面積(或漂移時間)區(qū)分的蛋白質，通過對氣相離子的碰撞活化作用，可以豐富離子淌度質譜的實驗數(shù)據(jù)，示于圖2。Tian等[16]在對ADC的離子淌度譜分析中引入了CIU方法，成功區(qū)分了CCS十分相近的IgGk亞型1～4的mAb。

3.2 應用于蛋白質錯誤折疊、聚集及與配體相互作用的研究

蛋白質或多肽特定的空間構象對于其發(fā)揮正常的生物功能至關重要，結構穩(wěn)定性的改變會引發(fā)蛋白質或多肽的錯誤折疊及聚集，形成淀粉樣原纖維，并最終導致相關疾病的發(fā)生[17]，如肌萎縮側索硬化癥(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)及朊蛋白病等神經退行性疾病和糖尿病(DM)等，這些疾病又稱蛋白構象病[18]。而銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)、β淀粉樣蛋白(Aβ)、突觸核蛋白、朊病毒蛋白、人胰淀素(hIAPP)的錯誤折疊及聚集，分別與ALS、AD、PD、瘋牛病及糖尿病等疾病相關。但由于淀粉樣原纖維形成過程的中間體具有分散性、多態(tài)性和瞬時態(tài)的特性，分析和識別這些短暫存在的低聚態(tài)中間體一直是一項挑戰(zhàn)。

蛋白質通常在原纖維形成之前發(fā)生去折疊和錯誤折疊，因此表征蛋白質的構象特點是研究淀粉樣纖維形成的關鍵問題[19]。IM-MS能夠將某一種蛋白單體共存的多種構型(質荷比相同，物理尺寸或形狀略有差異)分離開。Zhuang等[20]利用IM-MS及其串聯(lián)質譜的方法研究了不同溶液體系對SOD1構象的影響，以及SOD1二聚體在氣相中的構型變化和分解過程，發(fā)現(xiàn)在非變性離子淌度質譜條件下，SOD1二聚體可以保持完整和緊湊構型，在氣相中經碰撞活化后構型會逐漸由緊湊變得伸展，同時伴隨二聚體解離成單體。該實驗共檢測到3種構型的二聚體(緊湊、部分伸展、伸展)及2種構型的單體(緊湊和伸展)，根據(jù)CCS及離子淌度串聯(lián)質譜實驗，確定了SOD1二聚體離子在氣相中的3種分解和去折疊途徑，示于圖3。

圖2 離子淌度質譜法測定去糖基化曲妥珠單抗emtansine的藥物-抗體比[15]Fig.2 Determination of the drug-to-antibody ratio (DAR) of deglycosylated trastuzumab emtansined by IM-MS[15]

圖3 SOD1二聚體離子[Di]11+(m/z 2 858)的解離及去折疊途徑[20]Fig.3 Dissociation and unfolding pathways of SOD1 dimer ion [Di]11+ (m/z 2 858)[20]

此外，由于淀粉樣蛋白形成的早期階段具有高度異質性，多種且快速相互轉化的物種共存于溶液中，除研究有聚集傾向的蛋白質單體，識別和表征短暫存在的低聚態(tài)中間體是分析淀粉樣原纖維形成途徑時的難點。非變性離子淌度質譜既可以保留非共價結合的復合物，又可以高靈敏度監(jiān)測復雜混合樣品中低濃度的物種，分離不同的寡聚物而不影響整體平衡，并且能夠提供淀粉樣蛋白組裝方式的信息以及確認有毒低聚體的種類[21]。Illes-Toth等[22]利用IM-MS發(fā)現(xiàn)了能夠誘導體內聚集的α-突觸核蛋白寡聚體的不同構象，雖然低階低聚物相對非結構化，且主要以線性排列方式結合，但高階低聚物(如五聚體和六聚體)會形成環(huán)狀組裝體。作者推測這種緊湊的寡聚體可能會促進其他非結構化蛋白質的朊病毒樣細胞傳播。Leney等[23]比較了β-微球蛋白與它的1個D鏈單點突變體H51A在體外形成纖維過程的差異，發(fā)現(xiàn)H51A會更快地形成高聚體，然而二者所形成低聚體的CCS沒有明顯差異。近年來，Bowers課題組一直致力于利用離子淌度質譜研究疾病相關的淀粉樣蛋白/多肽的聚集過程，如β淀粉樣蛋白(Aβ)、突觸核蛋白、朊病毒蛋白、人胰淀素樣多肽(hIAPP)[24-30]。他們利用IM-MS研究了tau蛋白的PHF核心結構域，證明溶液條件決定了tau蛋白單體和寡聚體的蛋白內和蛋白間相互作用，因此該結構域在tau蛋白的聚集中起決定性作用。通過IM-MS表征tau蛋白的可溶性低聚物，在聚集過程中發(fā)現(xiàn)了多達八聚體的可溶性低聚物，這些低聚物會逐漸向不溶性原纖維轉移。此外，他們探索了Aβ40和Aβ42的寡聚狀態(tài)和組裝動力學，發(fā)現(xiàn)Aβ40主要形成單體和二聚體，同源四聚體豐度較低。因此，推測原纖維是由二聚體形成的四聚體產生的，而缺乏高階結構限制了Aβ40原纖維的生長。相反，Aβ42形成展開的四聚體，并進一步結合二聚體形成六聚體，2個六聚體相互作用形成有毒的十二聚體[29]。雖然人胰淀素樣多肽(hIAPP)與鼠胰淀素樣多肽(rIAPP)只有6個氨基酸位點的差異，但rIAPP卻不具有聚集傾向。通過離子淌度質譜發(fā)現(xiàn)，帶有相同電荷數(shù)的hIAPP單體具有緊實構象(漂移時間較短)和伸展構象(漂移時間較長)，比rIAPP單體多了1個更伸展的構象[30]。分子動力學模擬顯示，hIAPP單體的伸展構象由β-發(fā)夾結構組成，而rIAPP更緊湊的構象為α-螺旋結構，這與hIAPP纖維形成起始于β-發(fā)夾結構中間體的結論接近。

對蛋白質錯誤折疊疾病的治療策略研究是在明確蛋白錯誤折疊、聚集機制的基礎之上，通過穩(wěn)定蛋白質結構，減少、阻止其寡聚體的形成或促進其纖維化，以形成毒性很小或無毒的無定形聚集體等方法來抑制或消除淀粉樣蛋白的細胞毒性。Nshanian等[31]利用IM-MS探索了一種鑷子分子CLR01抑制tau蛋白聚集的機制，研究顯示，tau蛋白與抑制劑結合的化學計量比為1∶1。在CLR01存在的情況下，tau蛋白明顯向緊湊構象轉變，并且當tau蛋白被磷酸化時效果更加突出，tau蛋白的這種結構重塑抑制了具有聚集能的蛋白質構象異構體的形成。

大量研究發(fā)現(xiàn)，各種天然產物可以對淀粉樣蛋白的聚集產生顯著影響，從而降低聚集誘導的毒性。Zhao等[32]基于離子淌度質譜的碰撞誘導去折疊指紋圖譜，證明表沒食子IU茶素沒食子酸酯(EGCG)能夠穩(wěn)定SOD1二聚體的結構，減緩其去折疊；結合光譜及細胞實驗，證明EGCG能夠抑制脫金屬輔基SOD1(apo-SOD1)的體外聚集，減少聚集過程中疏水區(qū)暴露及β層含量的增加，并減少細胞損傷。離子淌度質譜也被用于區(qū)分天然小分子配體異構體，以及SOD1與黃酮異構體相互作用的研究[33-34]。Zhuang等[33]利用電噴霧-離子淌度質譜結合光譜方法研究SOD1與黃酮化合物及其異構體之間的非共價相互作用，發(fā)現(xiàn)SOD1與黃酮配體結合后其二聚體構型的穩(wěn)定性得以提升，并根據(jù)分子對接方法推測二聚體界面處是黃酮配體主要的結合位點，證實橙皮苷、柚皮苷等黃酮苷類成分具有較好的抑制apo-SOD1體外聚集的能力。此外，該課題組[34]還利用離子淌度質譜研究了白藜蘆醇及其衍生物提升SOD1二聚體結構穩(wěn)定性的作用，示于圖4。

SOD1的錯誤折疊和神經毒性聚集可由突變、金屬缺陷和翻譯后修飾引起[35]。Bian等[36]

圖4 利用native IM-MS研究虎杖苷與SOD1的相互作用[34]Fig.4 Research of interactions between SOD1 and polydatin by native IM-MS[34]

利用非變性離子淌度質譜揭示了鋅缺乏SOD1的氧化損傷風險。銅離子在氧化前期被釋放，這可能是其結合位點被氧化的結果。另一方面，缺鋅SOD1比脫輔基SOD1具有更快的解離傾向。碰撞誘導去折疊表明，缺鋅SOD1氧化后更易轉變?yōu)橥耆煺箻嬒?。黃豆黃苷能抑制鋅缺乏SOD1的氧化，并抑制氧化鋅缺乏SOD1構象的轉變及聚集，示于圖5。

體外研究表明[37-39]，EGCG可以改變多種淀粉樣蛋白的聚集途徑，并將已形成的聚集體解聚，形成無毒性的無定形聚集體。Bleiholder等[39]基于IM-MS方法研究了Aβ淀粉樣纖維的形成及其與抑制劑EGCG的相互作用，發(fā)現(xiàn)EGCG可有效抑制β構象的寡聚體形成，并將淀粉樣纖維轉變?yōu)榫o湊的顆粒狀沉淀。Young等[40]證明了IM-MS在篩選和表征Aβ抑制劑方面的能力，確定了小分子與淀粉樣蛋白前體(hIAPP)和Aβ-40結合的抑制劑，表征了相互作用的蛋白質種類(單體或寡聚體)并闡明聚集抑制機制，包括抑制劑結合的性質(特異性、非特異性或膠體)、抑制模式-單體結合、單體構象平衡的轉變、低聚物的分解等。作者提出IM-MS是一種有前途的高通量篩選工具，并通過IM-MS發(fā)現(xiàn)了一種新的hIAPP自組裝抑制劑。Pang等[41]利用電噴霧離子淌度質譜結合多種分析方法，分別從hIAPP的構象變化、聚集動力學的影響、聚集中疏水區(qū)域的暴露等多方面考察了紫草酸對hIAPP聚集的抑制作用。發(fā)現(xiàn)紫草酸與hIAPP結合形成的復合物可以改變hIAPP單體緊實構象和伸展構象的相對豐度，從而維持hIAPP構象的穩(wěn)定性，并證明紫草酸能夠有效抑制hIAPP聚集，減少纖維生成。

圖5 利用DTT/H2O2氧化(a,b)和還原(c,d)ApoSOD1(P1)和ApoSOD1(P1)的IM熱圖，以及P1(e)、P2(f)單體的離子淌度譜圖[36]Fig.5 IM heat maps of oxidized (a, b) and reducted (c, d) ApoSOD1 (P1) and ApoSOD1 (P1),IM spectra of +8 charged P1(e) and P2(f) monomer induced by DTT or H2O2[36]

越來越多的研究表明[42-45]，某些疾病相關蛋白質聚集過程中形成的可溶性寡聚體具有很強的細胞毒性，可能是致病的重要原因，而蛋白質結構穩(wěn)定性的降低與寡聚體的形成密切相關。因此，針對疾病相關蛋白的結構穩(wěn)定性、錯誤折疊及寡聚體形成與干預措施進行深入研究顯得尤為重要。利用靈敏、快捷、特異性強的非變性離子淌度質譜方法，結合多重串聯(lián)質譜技術(如碰撞誘導解離(CID)以及電子轉移解離(ETD))，以及光譜、計算機模擬及細胞生物學實驗等技術，針對上述疾病相關蛋白及多肽的結構穩(wěn)定性、錯誤折疊及聚集抑制劑的篩選進行深入研究，既有助于闡明蛋白構象病的發(fā)病機制，也有利于臨床的靶向治療及相關創(chuàng)新藥物的研發(fā)。雖然篩選得到的具有穩(wěn)定蛋白構象、抑制蛋白聚集的天然小分子配體最終應用于臨床有待考察，但仍為尋找治療蛋白質錯誤折疊疾病的臨床藥物提供了新途徑[46]。

4 結語

非變性離子淌度質譜已逐漸成為一種為傳統(tǒng)結構生物學技術提供互補信息的重要研究手段。雖然非變性離子淌度質譜缺少揭示原子水平的分辨率，但分析蛋白質異質復合物及蛋白質-配體相互作用的能力比其他方法更具獨特優(yōu)勢。此外，使用離子淌度質譜進行蛋白質結構檢測具有快速、靈敏的特點，尤其是近年來將其與native top-down方法進行整合，以及與多種解離方式結合，使非變性離子淌度質譜可以提供更豐富的結構信息。隨著高分辨、靈敏便捷的新一代離子淌度質譜技術的不斷開發(fā)和完善，以及與多樣化質譜技術的進一步整合，非變性離子淌度質譜技術在疾病相關的生物大分子結構及相互作用分析方面將擁有更加廣闊的應用前景。