戴叢書，柴晶美，林長青

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，吉林延吉 133000）

金銀花（Lonicera japonicaThunb.），有金銀藤、銀花、忍冬等別稱，是忍冬科忍冬屬多年生常綠植物。金銀花原產(chǎn)于東亞（包括中國、韓國和日本）[1]，現(xiàn)在新西蘭、澳大利亞、阿根廷、墨西哥、巴西和美國等許多國家均有種植。金銀花富含多種活性成分，如黃酮類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、三萜皂苷類等[2-3]，眾多研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、護(hù)肝等生物學(xué)功能[4-8]。因此，金銀花被視為天然活性物質(zhì)的重要來源。黃酮類化合物為金銀花的主要活性成分，研究表明，黃酮類化合物具有豐富的藥理活性，如抗菌、抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[9]。金銀花中目前鑒定出的黃酮類化合物包括木犀草素、忍冬苷等[10-11]。

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，影響著全球的數(shù)百萬人。若管理不當(dāng)，可能導(dǎo)致危及生命的并發(fā)癥、器官衰竭和死亡。其中1型糖尿?。═ype 1 Diabetes Mellitus，T1DM）是由于胰島β細(xì)胞完全或部分破壞而導(dǎo)致的一種慢性自身免疫性疾病。T1DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受遺傳、環(huán)境、免疫等諸多因素的影響[12-14]。臨床糖尿病物治療藥物主要包括胰島素促泌劑、胰島素增敏劑、雙胍類、胰島素及胰島素類似物等，均可發(fā)揮一定的降糖效果，促進(jìn)血糖水平的控制[15]。已有研究表明，許多藥物可用于糖尿病的治療和預(yù)防，但它們長期使用會產(chǎn)生很多副作用[16]，因此，目前已轉(zhuǎn)向?qū)λ幱弥参锖筒菟幍难芯俊?/p>

目前有關(guān)金銀花黃酮的報道多集中在黃酮提取工藝的研究[17-18]，而對金銀花黃酮降血糖作用還鮮有報道。另外治療糖尿病的藥物還存在很多副作用，使得開發(fā)藥食同源的植物替代傳統(tǒng)藥物顯得尤為重要。因此，本文擬選用藥食同源的植物金銀花為對象，研究金銀花黃酮提取物的降血糖作用，旨在為糖尿病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 延吉市海蘭江藥店；蘆丁 批號：Y16 M9S61523，上海源葉生物有限公司；C57BL/6小鼠

雄性，50只，體重（20±5）g，長春億斯試驗動物中心，合格證書：SCXK（吉）2018-0007，符合《延邊大學(xué)實驗動物倫理守則》，獲得延邊大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)；無水乙醇、亞硝酸鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鏈脲佐菌素（STZ） 99.9%，批號：WXBC8740V，美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片 95.0%，中美上海施貴寶制藥有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C檢測試劑盒、SOD、CAT、GSH、MDA檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8 Elisa試劑盒、HE染色試劑盒北京索萊寶科技有限公司。

HH-4型四孔數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司；CCA-1111-CE型旋蒸冷凝器 東京理化器械株式會社；101A-1E型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海安亭科學(xué)儀器有限公司；580型血糖儀 江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；SuPerMax 3100型多功能酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花總黃酮提取 將金銀花烘干并粉碎過40目篩，參照田存章等[19]的方法并進(jìn)行修改，取金銀花粉末200 g，按1:20（g:mL）的料液比加入75%乙醇溶液，50 ℃，超聲功率250 W，提取溫度50 ℃，超聲時間30 min，提取3次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，按1:1的比例加入石油醚洗滌3次，乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮干燥，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總黃酮含量測定 將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品配制成0.2 mg/mL，分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL容量瓶中并定容，采用NaNO2-Al（NO3）-NaOH法[20]，測定溶液在510 nm處的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取金銀花黃酮提取物1 g溶于1 mL無水乙醇中，并定容至10 mL，將溶液稀釋100倍，使其吸光度在0.2～0.8范圍內(nèi)，按照上述方法測定510 nm吸光度，按公式（1）計算樣品中總黃酮含量。

式中：F為總黃酮含量，mg/g；C為提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；d為稀釋倍數(shù)；V為提取液定容體積，mL；M為金銀花提取物質(zhì)量，g。

1.2.3 試驗動物分組及給藥 小鼠在溫度25±2 ℃，濕度55%環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，10只作為正常組，其余40只一次性腹腔注射STZ（130 mg/kg·BW）建立T1DM模型，72 h后，隔夜禁食不禁水，共禁食12 h，尾尖取血，棄掉第一滴血，用血糖儀進(jìn)行測量，空腹血糖值≥11.1 mmol/L視為造模成功，并將造模成功小鼠其隨機(jī)分為模型組、金銀花黃酮提取物低劑量組（200 mg/kg）、金銀花黃酮提取物高劑量組（400 mg/kg）、陽性組（二甲雙胍200 mg/kg）[21]，每組10只，連續(xù)灌胃8周，正常組和模型組灌以等量蒸餾水，試驗期間每天測量小鼠體重，每兩周記錄所有小鼠的空腹血糖值（FBG）。

1.2.4 小鼠OGTT測定 實驗最后一天各組小鼠給予等量的葡萄糖溶液，灌胃后0、30、60、90 min分別測定各組小鼠血糖值[22]。

1.2.5 小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C測定實驗最后一天，對小鼠采取心臟取血，并脫頸處死，血液室溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，取上清得血清，依次按各項指標(biāo)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 小鼠肝臟組織SOD、GSH、CAT、MDA測定

小鼠脫頸處死后，取肝臟并稱重，按肝臟:生理鹽水為1:3的比例制備成組織勻漿，并按試劑盒說明書依次加入反應(yīng)液進(jìn)行孵育，測定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA活性。

1.2.7 小鼠血清炎癥因子的測定 將收集好的血清使用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法進(jìn)行炎癥因子的測定，根據(jù)試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6炎癥因子。

1.2.8 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢測 采用蘇木精和伊紅（HE）染色法分析肝臟組織病理變化，對取出的小鼠肝臟組織用4%多聚甲醛溶液固定，再進(jìn)行脫水包埋切片，用HE法染色并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和顯著性差異分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠體重、FBG的影響

金銀花黃酮提取物總黃酮含量為43.62 mg/g，圖1反映了金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠體重以及FBG的影響，灌胃8周后，與正常組相比，模型組小鼠體重極顯著降低（P＜0.01），經(jīng)金銀花黃酮提取物治療后的T1DM小鼠體重均與模型組有極顯著差異（P＜0.01）。經(jīng)8周的金銀花黃酮提取物灌胃后，各小鼠的FBG差異顯著（P＜0.05），其中金銀花黃酮提取物高劑量組FBG下降最為顯著，可能是由于金銀花黃酮提取物影響了胰島細(xì)胞，使其分泌出更多胰島素，從而T1DM小鼠的糖尿病癥狀得以緩解?？梢娊疸y花黃酮提取物能有效緩解T1DM小鼠體重的下降，調(diào)節(jié)其血糖水平。

圖1 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠體重及FBG的影響Fig.1 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on body weight and FBG of T1DM mice

2.2 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠OGTT的影響

由圖2可知，各組小鼠血糖值在灌胃后30 min達(dá)到最大值，隨后下降，模型組中血糖下降緩慢，與模型組相比，金銀花低、高劑量組均能夠極顯著降低小鼠血糖水平（P＜0.01），能夠提高T1DM小鼠的糖耐量。經(jīng)金銀花黃酮提取物灌胃后，調(diào)節(jié)了T1DM小鼠體內(nèi)各種酶的活性，平衡了對葡萄糖的攝取及利用，提高了其對葡萄糖的耐受能力[23]。楊思等[24]的研究中指出，苦蕎黃酮具有顯著的降血糖效果?？梢?，黃酮類物質(zhì)具有調(diào)節(jié)血糖的能力，具有很好的提高葡萄糖耐受的作用。

圖2 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠OGTT的影響Fig.2 Effect of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on OGTT of T1DM rats

2.3 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

由圖3可知，與正常組相比，模型組小鼠血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平有極顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，金銀花黃酮低劑量組TC無顯著性差異（P＞0.05），而金銀花黃酮低劑量組的TG、HDL-C、LDL-C均有極顯著性差異（P＜0.01）。經(jīng)金銀花黃酮高劑量組治療后能夠極顯著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C相關(guān)指標(biāo)的水平（P＜0.01）。這是由于金銀花黃酮提取物經(jīng)體內(nèi)吸收后參與了T1DM小鼠的脂代謝，使TC、TG、LDL-C水平降低，HDLC水平提高。有研究指出，經(jīng)治療后的T1DM小鼠脂代謝水平能夠得到明顯改善，這與本研究結(jié)果一致[25]。王佳慧[26]的研究指出，川木瓜黃酮能夠改善T1DM小鼠的異常脂代謝，說明植物黃酮具有調(diào)節(jié)異常脂代謝的作用，也更加確定金銀花黃酮提取物能夠改善T1DM小鼠異常脂代謝。

圖3 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響Fig.3 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on TC, TG, HDL-C and LDL-C in T1DM mice

2.4 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響

圖4反映了金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，與正常組相比，模型組小鼠肝臟中SOD、GSH、CAT含量均極顯著下降（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），經(jīng)金銀花黃酮提取物治療后可有效恢復(fù)T1DM小鼠的氧化應(yīng)激水平。有研究顯示，經(jīng)治療后的T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA水平均得到恢復(fù)，與模型組差異極顯著（P＜0.01），可見，金銀花黃酮提取物能夠通過改善機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)酶水平從而發(fā)揮降血糖作用[27]。

圖4 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響Fig.4 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on SOD, GSH, CAT and MDA in T1DM mice

2.5 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的影響

圖5為金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠TNFα、IL-1β、IL-8和IL-6的影響，由圖5可知，與正常組相比，模型組T1DM小鼠炎癥因子含量均有升高，極顯著高于正常組（P＜0.01），而經(jīng)金銀花黃酮提取物治療后的T1DM小鼠炎癥因子水平均極顯著下降（P＜0.01），且高劑量組效果與陽性組相當(dāng)。表明金銀花黃酮提取物能夠降低T1DM小鼠炎癥的發(fā)生。呂品等[28]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究指出，金銀花具有抗炎抗菌活性，由此也印證了本文的實驗結(jié)果。因此，金銀花黃酮提取物能夠降低T1DM小鼠的炎癥反應(yīng)，有助于治療糖尿病。

圖5 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠TNF-α、IL-1β、IL-8 and IL-6的影響Fig.5 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on TNF-α, IL-1β, IL-8 and IL-6 in T1DM mice

2.6 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠肝臟的影響

圖6為金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠肝臟的影響，HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡，局部伴有炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)了明顯的肝損傷，而金銀花黃酮提取物組肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞內(nèi)有少量脂肪空泡及脂滴，炎癥細(xì)胞浸潤較少，可見，金銀花黃酮提取物能夠明顯減輕模型小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的改變，病理損傷明顯減輕。劉暢等[29]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對金銀花對大鼠急性酒精性肝損傷進(jìn)行了研究，認(rèn)為金銀花對肝損傷具有一定的改善作用，與本文的研究結(jié)果相符。

圖6 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠肝臟的影響Fig.6 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on liver of T1DM mice

3 討論與結(jié)論

近年來，研究者們不斷地從金銀花中分離提取出有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、黃酮類等化合物，在劉昌平[30]的研究中發(fā)現(xiàn)，金銀花中黃酮類化合物的含量約占金銀花干重的7.2%。本實驗中，測得所提取的總黃酮含量為44.3 mg/g。由此可見，黃酮類化合物在金銀花中含量較高，而且黃酮類物質(zhì)有許多生理活性，還具有用量少、安全無毒等優(yōu)點，因此，對金銀花的開發(fā)前景較為廣闊。

黃酮類物質(zhì)易溶于乙酸乙酯中，因此在提取時選用乙酸乙酯進(jìn)行萃取。實驗結(jié)果顯示，金銀花黃酮提取物能夠緩解T1DM小鼠體重的下降，降低其FBG，提高OGTT，表現(xiàn)出良好的降血糖作用。梅桂雪等[31]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可以通過抑制美拉德反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對葡萄糖的攝取，抑制醛糖還原酶，促進(jìn)胰島素的分泌，控制胰島素敏感性，作用于血管緊張素，抑制α-葡萄糖苷酶，類胰島素作用等，發(fā)揮防治糖尿病的作用。朱小峰等[32]對金銀花不同提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明金銀花水提物對其抑制率較低，而總浸膏和乙酸乙酯提取物的抑制率可高達(dá)108.09%和102.81%，可見金銀花乙酸乙酯提取物即黃酮類物質(zhì)在體外表現(xiàn)出一定的降血糖活性。金銀花黃酮提取物還顯示出良好的調(diào)節(jié)T1DM小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)TC、TG、HDL-C、LDL-C的效果，有研究報道，金銀花水提物能夠顯著降低高血脂小鼠的TC、TG水平，并調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)[33]。王強(qiáng)等[34]研究發(fā)現(xiàn)金銀花黃酮提取物（4.2 g/kg）可使高脂血癥大鼠血清及肝組織TG水平明顯降低。這些均與本文研究結(jié)果一致。

糖尿病在發(fā)生過程中常伴隨著炎癥反應(yīng)，研究人員在糖尿病早期的肥胖小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞侵入胰腺，并釋放出大量促炎蛋白，從而破壞了產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞[35]?？梢姡装Y引起的免疫反應(yīng)，會影響胰島素分泌情況，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。而糖尿病反過來，又會進(jìn)一步惡化炎癥。本實驗測定了金銀花黃酮提取物對小鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-6的影響，結(jié)果顯示金銀花黃酮提取物能夠有效地抑制糖尿病引起的炎癥反應(yīng)。本文又檢測了T1DM小鼠肝臟組織的病理變化，模型組小鼠肝臟局部伴有炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)了明顯的肝損傷，而金銀花黃酮提取物治療后改善了炎癥細(xì)胞浸潤狀態(tài)，可見，金銀花黃酮提取物能夠明顯減輕T1DM小鼠肝臟炎癥。有研究指出，抑制T1DM小鼠炎癥反應(yīng)，可以有效抑制胰島細(xì)胞凋亡，保護(hù)胰島β細(xì)胞，減輕其糖尿病癥狀[36-37]。這與本研究結(jié)果相符。

因此，金銀花黃酮提取物具有良好的降血糖活性，并能夠改善T1DM小鼠異常脂代謝、炎癥以及肝臟損傷。該研究可為金銀花黃酮的開發(fā)與利用提供新的思路，但其對糖尿病的治療機(jī)制研究還較為淺顯，后續(xù)可對金銀花黃酮提取物的降血糖機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。