于溫溫，張金華，劉云娜,3，劉 飛，邵華榮,4, ，韓冠英

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧錦州 121000；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院生物藥物重點實驗室，山東濟南 250101；3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濟南 250012；4.廈門大學(xué)深圳研究院，廣東深圳 518057）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）正迅速成為世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝病之一，是造成肝臟相關(guān)疾病死亡率和發(fā)病率增加的重要原因[1]，NAFLD是在未過度飲酒或無其他致病病因（包括自身免疫性、藥物性或病毒性肝炎）情況下的一種代謝性肝損傷，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪積累大于5%，其組織學(xué)變化可從脂肪變性到非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化和肝硬化[2]。據(jù)報道，肥胖患者中NAFLD患病率高達90%，且隨著相關(guān)代謝綜合征及肥胖的全球化，NAFLD患病率持續(xù)升高，全球亟待關(guān)注[3]，控制體重、加強運動和改變飲食等多種辦法已被用于改善NAFLD，然而，在實際生活中，對于大多數(shù)患者來說，這些方法通常難以堅持。一些藥物如他汀類藥物和噻唑烷二酮類藥物等已在臨床試驗中進行了測試，但很少有藥物在最大限度地提高療效和減少不良反應(yīng)方面產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果[4]。因此，開發(fā)一種保護肝臟、改善NAFLD的天然功能食品仍是當(dāng)務(wù)之急。

NAFLD的發(fā)生、發(fā)展與甘油三脂（triglyceride，TG）的合成和降解的不平衡密切相關(guān)，既往研究發(fā)現(xiàn)，法尼酯受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）的激活可通過調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白來降低甘油三酯水平[5]。FXR作為膽汁激活的核受體在調(diào)節(jié)膽汁酸、脂質(zhì)和碳水化合物代謝中起著關(guān)鍵作用[6]。有報道稱FXR在NAFLD患者中表達降低，作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，有望成為治療NAFLD的新靶點[7]。激活FXR可抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C（sterol regulatory element-binding protein，SREBP-1C）及其靶酶的表達，從而減少肝脂肪變性[8]。SREBP-1C是一種脂肪生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，SREBP-1C的激活可促進脂肪酸的合成，加速TG的積累，因此，SREBP-1C在代謝性疾病，特別是NAFLD中發(fā)揮著重要作用[8]，下調(diào)SREBP-1C及其相關(guān)的信號分子，如脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS），可抑制脂肪從頭生成[9]。有研究表明抑制FAS的表達在肝脂肪變性的治療中占有重要地位[10]，且有研究發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)FXR，可降低SREBP-1C和FAS水平，對肝臟脂質(zhì)積累有抑制作用[11]。因此，關(guān)注對FXRSREBP-1C-FAS信號調(diào)控脂代謝的影響對研究NAFLD的改善方法具有重要意義。

貽貝多糖（mussel polysaccharideα-D-Glucan，MP-A）是本課題組由海洋貽貝中分離提取到的一種新型多糖，主體為葡聚糖，含葡萄糖分枝，重均分子量在1200～1300 kDa之間[12-13]。前期研究表明，MPA對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血脂水平和NAFLD具有改善作用[14]，基于NAFLD與脂質(zhì)代謝的紊亂和膽固醇代謝密切相關(guān)，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究以高脂飲食誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠NAFLD模型，探討MP-A對NAFLD脂代謝和膽固醇代謝密切相關(guān)的蛋白分子信號FXR-SREBP-1C-FAS信號通路和CYP7A1受體表達的調(diào)節(jié)作用，旨在為MP-A開發(fā)為改善NAFLD的天然功能食品提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20只C57BL/6J正常小鼠和20只ApoE-/-小鼠（6～8周齡） 雄性，體重20～23 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證：SCXK（京）2016-0006；MP-A（純度98.65%，w/w） 山東省藥學(xué)科學(xué)院提供；TG檢測試劑盒（批號：20210510） 南京建成生物公司研究所；高脂樣本總膽固醇（TC）酶法測定試劑盒（批號：E1026） 北京普利萊基因技術(shù)有限公司；NR1H4 polyclonal antibody（批號：25055-1-AP）、FAS polyclonal antibody（批號：10624-2-AP）

Proteintech有限公司；Anti-SREBP1 antibody（批號：H00425） 購自華安生物有限公司；Anti-CYP7A1 antibody（批號：ab65596） Abcam公司；FAS、CYP7A1、FXR、小異源二聚體伴侶受體（small heterodimer partner，SHP）、GAPDH基因擴增引物 由武漢賽維爾生物科技有限公司設(shè)計并合成；HRP-羊抗兔1gG（批號：BST15J26C15J54）、HRP-羊抗小鼠2gG（批號：BST16C15B16G50） 博士德生物工程有限公司；BeyoGel? Plus PAGE預(yù)制膠（Tris-gly，10%，10孔）（批號：90221211014）、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（6.5-270 kDa）（批號：90071）、一抗稀釋液（批號：12621210412） 碧云天生物有限公司；脫脂奶粉（批號：414WO511） 索萊寶生物有限公司；蛋白定量BCA試劑盒（批號：7E412I0）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mi（批號：7E501C1）

諾唯贊有限公司。

冷凍型微量臺式離心機、QuantStudio 3實時熒光定量PCR儀 美國Thermo公司；電泳儀ProXima 280化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、 美國Bio-Rad公司；Nano-100超微量核酸分析儀 杭州奧盛儀器有限公司；Infinite M200PRO多功能酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；6325XQ601089梯度PCR儀 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MP-A溶液配制 稱取MP-A 0.8 g，加蒸餾水溶解至10 mL，得濃度為80 mg/mL的MP-A灌胃溶液，并依據(jù)前期預(yù)實驗研究結(jié)果，確定0.8 g/kg作為本研究MP-A的小鼠灌胃給藥劑量。

1.2.2 動物實驗分組與處理 經(jīng)山東省藥學(xué)科學(xué)院實驗動物管理和使用委員會（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批準(zhǔn)，開展本研究動物試驗。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，20只C57BL/6J正常小鼠隨機分為兩組：正常組、正常+MP-A組，20只ApoE-/-小鼠隨機分為兩組：模型組、模型+MPA組，每組10只動物。

正常組和正常+MP-A組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組和模型+MP-A組給予高脂飼料（10.0%豬油、20.0%蔗糖、10.0%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料）[15]喂養(yǎng)。

從第2周開始，正常+MP-A組、模型+MP-A組灌胃給予MP-A（0.8 g/kg），根據(jù)小鼠體重每天灌胃1次，持續(xù)7周，每周對小鼠進行稱重，調(diào)整灌胃體積，正常組和模型組灌胃對應(yīng)體積的蒸餾水。實驗結(jié)束后，稱量小鼠體重，各組小鼠用1%戊巴比妥溶液（30 mg/kg）麻醉。小鼠眼球摘除后取血，對各組小鼠解剖，肝臟完整取出，肝臟表面使用生理鹽水沖洗，病理切片盒中放入同等部位的部分肝臟，采用4%多聚甲醛溶液中固定，后續(xù)進行切片染色觀察[16]，其余肝臟置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血脂水平測定 小鼠眼球摘除取血，血液靜置2 h后4000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清，測定血清 TG、TC水平。

1.2.4 肝臟中TG含量的測定 準(zhǔn)確稱取肝臟組織，按重量（g）:體積（mL）=1:9比例，加入9倍體積無水乙醇，冰水浴條件下機械勻漿，2500 r/min，離心10 min，取上清液待測。按參考文獻[17]及試劑盒說明書檢測肝臟TG含量。

1.2.5 肝臟中TC含量的測定 按照試劑盒說明書操作，準(zhǔn)確稱取肝臟組織，按肝臟重量（mg）:體積（μL）=1:10比例，加入試劑盒中的裂解液，用高通量組織勻漿器破碎肝臟組織，靜置10 min，取適量上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，余下的上清液用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白含量測定。70 ℃加熱10 min，室溫2000 r/min離心5 min，取上清液用于酶學(xué)測定。配制工作液，按4:1比例取試劑盒中的R1與R2混勻。將5 mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇稀釋為2500、1250、625、312.5 μmol/L[18]。向96孔板中加入190 μL反應(yīng)液，再加入10 μL空白對照液、標(biāo)準(zhǔn)品、上清液，充分混勻。37 ℃反應(yīng)20 min，將96孔板置于酶標(biāo)儀中，在550 nm波長處測定OD值[19]，以測定的蛋白濃度校正膽固醇含量。

1.2.6 肝臟組織病理學(xué)檢查 取固定于多聚甲醛中的肝臟標(biāo)本，嵌入石蠟，切割成5 μm厚的切片，H&E染料染色后于光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.2.7 RT-qPCR法檢測小鼠肝組織中FXR、SHP、CYP7A1、FAS的mRNA表達水平 采用mRNA提取試劑盒從肝臟樣本中分離總RNA。采用NANO DROP 2000儀器，測定OD260/OD280比值，對RNA進行定量和質(zhì)量評估[20]。配制逆轉(zhuǎn)錄體系，進行逆轉(zhuǎn)錄實驗，設(shè)計用于RT-qPCR擴增的引物（見表1），配制擴增體系，進行PCR擴增。以GAPDH作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法分析各組之間目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。

表1 RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Prime sequences for RT-qPCR analysis

1.2.8 Western blot法檢測小鼠肝組織FXR、SREBP-1C 、FAS、CYP7A1蛋白表達水平 稱取肝臟樣本，加入含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解緩沖液，冰上裂解30 min，12000 r/min離心10 min。收集樣本蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，各組蛋白樣本定量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉[21]，一抗孵育，置于搖床上4 ℃過夜，第2 d，與二抗孵育，TBST洗膜三次，ECL顯影液顯影。用Image J軟件分析條帶，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，采用GraphPad prism 8.0.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，One-way ANOVA方差分析用于組間樣本差異性比較，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01提示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP-A對ApoE-/-小鼠體重的影響

體重及體重增長率結(jié)果如表2所示，與正常組比較，高脂飲食誘導(dǎo)的模型組小鼠體重及體重增長率顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，模型+MP-A組小鼠體重增長率顯著降低（P＜0.05），表明MP-A能減緩高脂飲食所致NAFLD小鼠體重增加，且正常動物給予MP-A對體重?zé)o顯著影響（P＞0.05）。

2.2 MP-A對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響

由表2可知，小鼠長期高脂飲食喂養(yǎng)后，與正常組相比，模型組小鼠血清中TG、TC水平極顯著分別升高0.66 mmol/L（P＜0.01）和5.53 mmol/L（P＜0.01）。給予MP-A灌胃7周后，與模型組比較，模型+MP-A組小鼠血清TG水平極顯著降低0.59 mmol/L（P＜0.01），而TC水平盡管由（7.10±0.30） mmol/L降至（5.95±0.46） mmol/L，但統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示無顯著意義（P＞0.05）。結(jié)果表明MP-A可明顯降低高脂飲食誘導(dǎo)的血清TG水平升高。

表2 MP-A對ApoE-/-小鼠體重及血脂水平的影響Table 2 Effects of MP-A on body weight and serum lipid levels in ApoE-/-mice

2.3 MP-A對小鼠肝臟總量及肝臟TG、TC水平的影響

由表3可知，相比正常組，模型小鼠在長期高脂飲食誘導(dǎo)下，肝臟重量、肝臟指數(shù)、肝臟TG、TC水平分別升高1.2 g，4.32%，38.02、43.97 μmol/g prot，差異極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積。而連續(xù)7周給予MP-A，模型+MP-A組小鼠肝臟重量由（2.21±0.26） g降低到（1.20±0.04） g、肝臟指數(shù)降低了3.6%、肝臟TG水平降低了32.26 μmol/g prot，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），肝臟TC水平降低至（32.30±2.76） μmol/g prot，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。肝臟TG水平與血清中TG水平趨勢相比一致且肝臟TC水平明顯降低。結(jié)果表明MPA能抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝內(nèi)TG、TC沉積。

表3 MP-A對各組小鼠肝臟總量及TG、TC水平的影響Table 3 Effects of MP-A on the total amount of liver as well as the liver TG and TC levels of each group

2.4 MP-A可改善肝脂肪變性

如圖1肝組織H&E染色顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝臟可見大小不均的脂質(zhì)液泡彌散分布，存在顯著的肝臟脂肪變性。小鼠灌胃MP-A后，模型+MP-A組小鼠脂質(zhì)液泡個數(shù)變少，肝細(xì)胞微泡脂肪變化程度減輕。病理結(jié)果證實，高脂飲食喂養(yǎng)會誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠肝臟脂質(zhì)積累，給予MP-A，可顯著改善肝臟脂肪變性。

圖1 小鼠肝臟切片的H&E染色的代表性顯微照片F(xiàn)ig.1 Representative photomicrograph of H&E staining of mouse liver slices

2.5 MP-A對肝臟中FXR、SHP、FAS和CYP7A1 mRNA水平的影響

如圖2a～圖2d所示，與正常組相比較，模型組的肝臟FASmRNA表達水平極顯著上升（P＜0.01），CYP7A1mRNA表達水平顯著下降（P＜0.05），F(xiàn)XR、SHP的mRNA表達水平無顯著變化（P＞0.05）。與模型組比較，模型+MP-A組FASmRNA表達水平顯著下降（P＜0.05），CYP7A1mRNA表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），F(xiàn)XR及SHP的表達水平無顯著影響（P＞0.05）。因此推測模型+MP-A組中血清和肝臟中TG的降低可能與FASmRNA的表達下調(diào)有關(guān)。

圖2 各組肝組織中FXR、SHP、FAS和CYP7A1 mRNA水平Fig.2 Analysis of the FXR, SHP, FAS and CYP7A1 mRNA levels in liver tissues

2.6 小鼠肝組織中FXR、SREBP-1C、FAS、和CYP7A1的蛋白表達水平

為進一步研究MP-A在NAFLD中作用的信號通路，本文評估了肝組織中與脂質(zhì)代謝和膽固醇代謝密切相關(guān)的蛋白分子表達。如圖3a～圖3e所示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織中FXR和CYP7A1的蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），SREBP-1C、FAS的蛋白表達水平顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，模型+MP-A組中FXR、CYP7A1的蛋白表達水平顯著上升（P＜0.05），SREBP-1C、FAS蛋白表達水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，MP-A干預(yù)可影響FXR-SREBP-1C-FAS信號通路和CYP7A1的蛋白表達，調(diào)節(jié)脂代謝和膽固醇代謝。

圖3 各組肝臟組織中FXR、SREBP-1C、FAS和CYP7A1的蛋白表達水平Fig.3 Protein expression levels of FXR, SREBP-1C, FAS and CYP7A1 in liver tissues of each group

3 討論與結(jié)論

NAFLD是目前最常見的慢性肝病[22]，約30%的NAFLD患者會發(fā)展為非酒精性脂肪肝炎[23]，若不及時預(yù)防，極易發(fā)展為肝硬化、肝癌，因此發(fā)掘新的天然功能性食品改善NAFLD是很有必要的。有研究報道喂養(yǎng)高脂飲食的ApoE-/-小鼠可作為快速而有價值的NAFLD模型[24]，高脂飲食喂養(yǎng)的動物可以復(fù)制人類NAFLD中的主要組織病變和發(fā)病機制，長期高脂飲食喂養(yǎng)會使小鼠肥胖且出現(xiàn)肝脂肪變性[25]。同樣張虹等通過高脂飲食組的小鼠體重、肝重明顯增加，肝細(xì)胞呈脂肪變性，肝臟TG水平顯著升高等結(jié)果表明成功構(gòu)建小鼠NAFLD動物模型[26]。本實驗?zāi)Ｐ徒M小鼠精神不振，皮毛粗糙，體型肥大，體重較正常組顯著升高，連續(xù)7周喂養(yǎng)高脂飲食，模型組小鼠體重增長率、肝重、肝臟指數(shù)較正常組顯著升高，且血清TG、TC水平也顯著上升。H&E染色觀察模型組小鼠肝臟有明顯的脂肪變性，與NAFLD患者的臨床表現(xiàn)相似[27]。肝臟TG、TC的水平明顯升高，成功構(gòu)建ApoE-/-小鼠NAFLD模型。

MP-A是課題組由貽貝中提取到的一種具備新穎結(jié)構(gòu)的新型多糖[28]，并發(fā)現(xiàn)MP-A具有調(diào)血脂和保肝護肝活性[20]，但將其進一步作為功能食品開發(fā)，相關(guān)研究亟需深入。在本研究中，采用ApoE-/-小鼠驗證了MP-A對高脂誘導(dǎo)的NAFLD改善作用，發(fā)現(xiàn)MP-A干預(yù)可顯著降低ApoE-/-模型小鼠體重增長率、血清TG、肝臟重量及肝臟TG、TC水平。肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果中顯示模型組出現(xiàn)明顯的肝脂肪變性，且有明顯的脂肪空泡癥狀，而給予MP-A，小鼠肝組織的病變癥狀明顯改善。本研究采用ApoE-/-小鼠NAFLD模型進一步確證了MP-A對NAFLD具有顯著的改善作用。

近年研究也表明，除胰島素抵抗、肥胖、2型糖尿病、氧化應(yīng)激、脂肪失衡等因素外，肝游離膽固醇的積累和肝內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞與NAFLD的發(fā)病機制密切相關(guān)[29]。肝細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)是通過多種機制維持的，包括細(xì)胞合成、攝取、儲存、排出和排泄。肝臟不僅是合成膽固醇的重要器官，也是輸出膽固醇的器官。肝臟膽固醇輸出是維持肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)所必需的[30]，由膽固醇合成膽汁酸是肝臟膽固醇分解代謝的主要途徑。肝CYP7A1催化反應(yīng)是膽汁酸合成的速率限制步驟[31]，多項研究[16,32-34]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)肝臟CYP7A1過表達可預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、脂肪肝和胰島素抵抗，改善肝臟脂質(zhì)積累。本研究結(jié)果顯示，MP-A干預(yù)可上調(diào)CYP7A1的mRNA水平和蛋白水平，CYP7A1表達水平升高加快膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，消耗肝臟中的膽固醇，且MP-A干預(yù)后肝臟TC水平顯著降低。因此，MP-A可能對高脂飲食誘導(dǎo)的肝內(nèi)膽固醇代謝有一定的調(diào)節(jié)作用。

膽汁酸在體內(nèi)作為一種信號分子，可激活FXR受體調(diào)控機體代謝[35]，F(xiàn)XR在脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[36]，激活肝臟FXR受體相應(yīng)途徑可抑制NAFLD[37]。FXR激活后可通過上調(diào)SHP的表達，調(diào)控SHP，影響SREBP-1、ACC和FAS間接調(diào)控脂肪的生成，抑制脂質(zhì)沉積[6,38-39]。SREBP-1C在肝臟中高表達[40]，是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，尤其是肝臟和脂肪組織中TG沉積的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[41]。FXRSREBP-1C-FAS信號通路調(diào)控脂代謝在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，通過FXR-SHP-SREBP-1C途徑降低肝臟新生脂肪是改善肝脂肪變性的機制之一[41]。而FAS為脂肪酸合成酶，F(xiàn)AS異常表達可促進肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量堆積，誘導(dǎo)肝組織氧化損傷，導(dǎo)致機體脂代謝及能量代謝紊亂[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會誘導(dǎo)小鼠肝臟TG大量累積，SREBP-1C、FAS的蛋白過度表達，抑制FXR的蛋白表達，MPA干預(yù)可上調(diào)FXR蛋白表達，下調(diào)SREBP- 1C、 FAS的蛋白表達，減輕小鼠肝臟脂肪積累。表明MPA干預(yù)可影響FXR-SREBP-1C-FAS信號通路，調(diào)控脂代謝，逆轉(zhuǎn)肝臟TG 堆積，具有顯著的降脂作用。

綜上所述，MP-A可影響肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的FXR-SREBP-1C-FAS信號通路和CYP7A1的表達，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟TG積累及組織病理改變，對NAFLD及肝臟代謝性疾病的防治具有重要的應(yīng)用前景。目前本研究確證了MP-A與脂代謝和膽固醇代謝相關(guān)的蛋白信號有關(guān)，但尚未確定MPA是直接或間接影響了肝臟中這些關(guān)鍵的蛋白信號分子，深入的研究仍在開展。本研究揭示了MPA的降血脂作用，為降血脂功能性食品的開發(fā)以及NAFLD的防治提供重要的理論依據(jù)。