張亞琳，展曉鳳，馬海娟，張 昱，任新雅，蘆玉佳，張文娜，朱 璇

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

新疆具有日照時間充足，晝夜溫差大，光熱資源豐富的地理優(yōu)勢，造就了杏果實風(fēng)味酸甜、汁少、仁肉較飽滿的特點，其中‘賽買提’杏是品質(zhì)特優(yōu)的鮮食品種之一[1]。但是杏果實采收后極易軟化，在運輸過程中易遭受病原菌的侵染而發(fā)生腐爛變質(zhì)，其中互隔交鏈孢（Alternaria alternata，A.alternata）引起的黑斑病是杏果實采后主要的侵染性病害[2]。目前，主要采用石硫合劑、代森錳鋅、多菌靈、仲丁胺等化學(xué)殺菌劑控制杏果實采后黑斑病的發(fā)生，但由于安全性和殘留危害等問題而受到限制，因此尋找綠色健康的防治方法是亟待解決的問題。

褪黑素（melatonin，MT），學(xué)名N-乙?；?5-甲氧基-色胺，是一種新型植物內(nèi)源激素[3]。研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理可增強園藝作物在非生物（熱、冷、干旱和鹽）和生物（真菌、病毒、細(xì)菌和昆蟲）脅迫中的抵御能力[4]。近幾年來，越來越多的研究者轉(zhuǎn)向褪黑素在采后果蔬貯藏保鮮方面的研究，發(fā)現(xiàn)了外源褪黑素保持了獼猴桃[5]、芒果[6]、冬棗[7]、油桃[8]、石榴[9]的貯藏品質(zhì)，降低貯藏期間果實乙烯產(chǎn)量，延緩了果實后熟衰老。還有研究表明，外源褪黑素可提高低溫脅迫下李[10]、杏[11]、桃[12]的耐受性，減輕果實冷害的發(fā)生。此外，外源褪黑素還可激活水楊酸、茉莉酸、一氧化氮等信號分子，調(diào)控防御酶體系，促進果實酚類物質(zhì)積累，增強番茄[13]、蘋果[14]、草莓[15]果實的抗病性。但有研究表明外源褪黑素處理柑橘果實反而會加速果實的腐爛[16]。目前，在采后果蔬貯藏方面，外源褪黑素處理主要集中在延緩采后果實后熟衰老，提高果實低溫脅迫下的耐受性，但在增強果實抵御侵染性病害方面研究較少，而且外源褪黑素處理對果實抗病性的誘導(dǎo)受果蔬種類、作用時間、處理濃度、處理方法的影響。

活性氧在果蔬生理代謝過程中具有重要作用，當(dāng)果蔬受到病原微生物侵害時，大量積累的活性氧不僅可以直接殺死病原菌，還可作為信號分子啟動寄主抗病防御體系[17]。但活性氧積累過多反而會加速果實腐爛。研究發(fā)現(xiàn)水楊酸[18]、新型殼聚糖制劑[19]、苯并噻二唑[20]等處理提高采后芒果、荔枝、蘋果等果實的抗病性均與調(diào)控活性氧代謝相關(guān)。

本文以‘賽買提’杏為試材，主要探究外源褪黑素處理對果實采后黑斑病的控制與活性氧代謝的關(guān)系，以期為A.alternata引起的杏果實采后黑斑病的防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏果實 于2020年7月10日采自新疆喀什英吉沙縣烏恰鎮(zhèn)果園，采收后立即運回新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生理實驗室，在（8±1）℃條件下預(yù)冷12 h散去田間熱，剔除有機械損傷及病、蟲果，選取色澤及成熟度（硬度為13.97±0.1 N/cm2，可溶性固形物17.32%±0.2%）相對一致，大小均勻的杏果實作為試驗材料；A.alternata由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬采后生理研究室提供；褪黑素 上海源葉生物科技有限公司；丙酮、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、四氯化鈦、濃氨水、對氨基苯磺酸、過氧化氫、硫酸、鄰苯二酚溶液、愈創(chuàng)木酚、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、水楊酸、無水乙醇，鹽酸羥胺、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚等 均為國產(chǎn)分析純。

KH20R型離心機 湖南凱達離心機廠系凱達集團；UV 1601紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；XMTD-4000型超低溫冰箱 中科美菱公司；DZKW-5-6電熱恒溫水浴 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；AL204-IC型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器廠（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 減壓（0.05 MPa）處理的方法參照本課題組前期研究基礎(chǔ)[21]，略作修改。分別采用50、100、200 μmol/L褪黑素溶液對杏果實進行減壓（0.05 MPa）處理2 min，后常壓狀態(tài)下浸泡8 min，以蒸餾水處理為對照組。每組處理果實10.0 kg，每處理組重復(fù)3次，自然晾干后，在溫度（0±1） ℃，相對濕度90%～95%條件下放置48 h后，進行損傷接種

A.alternata。

1.2.2 損傷接種 參照Bi等[22]的方法稍作修改。取在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的A.alternata菌，加入10 mL無菌水（含0.05% Tween-80），用三角涂布棒輕輕刮取培養(yǎng)基表面的孢子，不斷洗脫倒入50 mL三角瓶中，振蕩搖勻后用脫脂棉過濾，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×106個/mL備用。褪黑素處理和對照杏果實表面分別用75%乙醇溶液和無菌水輕輕擦拭，待表面水分蒸發(fā)后，在杏果實赤道中心處用滅菌后的鐵釘刺一個孔（直徑3.0 mm，深4.0 mm），取15 μL孢子懸浮液注射入孔內(nèi)，將接種面朝上整齊排列在塑料框內(nèi)，損傷接種完成后放置在溫度（0±1）℃、RH 90%～95%條件下貯藏，每7 d進行一次取樣及相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 發(fā)病率和病斑直徑 參照趙亞婷等[23]的方法。采用十字交叉法測量病斑直徑，接種發(fā)病率以損傷接種的杏果實菌斑直徑大于損傷接種孔徑3.0 mm時即為接種發(fā)病果實。每處理組3.0 kg，重復(fù)3次。計算公式如下：

1.2.3.2 過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）含量和超氧陰離子（superoxide anion，O2-·）產(chǎn)生速率 超氧陰離子（O2-·）產(chǎn)生速率的測定參考石玲等[24]的方法稍作修改。以每分鐘每克杏果實產(chǎn)生O2-·物質(zhì)的量為O2-·產(chǎn)生速率，單位表示為μmol/（min·g）。

過氧化氫（H2O2）含量測定參考曹建康等[25]的方法，取2.0 g杏果實樣品于反應(yīng)液（含丙酮、濃氨水和四氯化鈦）在12000 r·min-1離心20 min后，將沉淀溶于濃硫酸，于410 nm處測定吸光度。結(jié)果根據(jù)H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，計算每克杏果實組織中的H2O2含量，單位表示為μmol·g-1。

1.2.3.3 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力 超氧化物歧化酶（SOD）活力測定參考曹建康等[25]的方法，以每分鐘每克杏組織的反應(yīng)體系對氮藍四唑（NBT）光化還原的抑制為50%為1個SOD活力單位（U）表示，則U=0.01ΔOD560·min-1·g-1·FW。

過氧化氫酶（CAT）活力測定參考曹建康等[25]的方法，以每克杏果實每分鐘在240 nm波長處吸光度變化0.01表示1個CAT活力單位（U）表示，則U=0.01ΔOD240·min-1·g-1·FW。

1.2.3.4 過氧化物酶（peroxidase，POD）活力 過氧化物酶（POD）活力測定參考Zeng等[26]的方法稍作修改，稱取2.0 g杏果實，置于研缽中，加入5 mL 0.1 mol/L pH5.5乙酸鈉緩沖液（含1 mmol/L聚乙二醇、4%聚乙烯吡咯烷酮和1% Triton X-100），12000 r·min-1離心30 min，反應(yīng)體系：3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚、0.5 mL酶液和200 μL 0.5 mol/L H2O2，于470 nm處測量吸光值變化，以每克杏果實每分鐘吸光度變化值增加0.01時為1個POD酶活力單位（U）表示，則U=0.01ΔOD470·min-1·g-1·FW。

1.2.3.5 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和細(xì)胞膜滲透率 丙二醛（MDA）含量的測定參考曹建康等[25]方法。稱取2.0 g杏果實，加入10 mL 10%三氯乙酸（含0.5%硫代巴比妥酸）研磨勻漿，將混合物在沸水中加熱10 min，冷卻后，5000 r·min-1離心15 min，分別在450、532和600 nm測量上清液的吸光度，以鮮重為單位表示為μmol·g-1。細(xì)胞膜滲透率采用電導(dǎo)率法[25]，單位以%表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進行所有數(shù)據(jù)結(jié)果計算，使用SPSS 19.0軟件進行差異性分析，采用鄧肯氏多重比較法進行差異性分析（P＜0.05表示差異性顯著），繪圖采用Origin 2017軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素（MT）處理對杏果實接種A.alternata后病斑直徑及接種發(fā)病率的影響

如圖1a所示，在接種A.alternata后第0 d和第7 d未見發(fā)病，貯藏第14 d時各處理組均發(fā)病，貯藏14 d后各處理組發(fā)病率均呈逐漸上升的趨勢，杏果實在貯藏第21～35 d之間，50、100和200 μmol/L MT處理組的接種發(fā)病率均顯著（P＜0.05）低于對照組。其中100 μmol/L MT處理組貯藏第28 d時分別比對照組、50 μmol/L和200 μmol/L MT處理組低33.3%、13.3%和15.5%（P＜0.05）。由此說明，MT處理延緩了接種A.alternata杏果實接種發(fā)病率的升高，在貯藏第28～35 d之間100 μmol/L MT處理組接種發(fā)病率顯著（P＜0.05）低于其他處理組。

雖然貯藏結(jié)束時各處理組損傷接種的杏果實均發(fā)?。▓D1a），但接種A.alternata的杏果實病斑直徑擴展情況各不相同。如圖1b所示，各處理組病斑直徑隨貯藏時間延長整體呈逐漸上升的趨勢，在貯藏第35～49 d之間，對照組杏果實的病斑直徑顯著（P＜0.05）高于50、100和200 μmol/L MT處理組，貯藏結(jié)束時，對照組分別比50、100和200 μmol/L MT處理組的病斑直徑高22.73%、54.32%、37.52%。結(jié)果表明MT處理可延緩病斑直徑的擴展，其中100 μmol/L MT處理組的病斑直徑顯著（P＜0.05）低于其他處理組。綜上所述，MT處理可有效延緩杏果實接種A.alternata病斑生長，其中100 μmol/L MT處理組抑制杏果實黑斑病的發(fā)生效果最好。因此，后續(xù)選取100 μmol/L MT處理組杏果實，探究MT對采后杏果實黑斑病的抑制作用與活性氧代謝的關(guān)系。

圖1 外源褪黑素對杏果實采后接種A.alternata發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig.1 Effects of MT treatment on disease incidence and lesion diameter in apricot fruit inoculated with A.alternata

2.2 外源褪黑素對杏果實O2-·產(chǎn)生速率的影響

由圖2可知，接種A.alternata的杏果實在貯藏第0～21 d時，各處理組杏果實內(nèi)O2-·產(chǎn)生速率均呈逐漸下降的趨勢，且MT處理顯著（P＜0.05）減緩了杏果實內(nèi)O2-·產(chǎn)生速率。在貯藏第21 d時對照組杏果實內(nèi)的O2-·產(chǎn)生速率達到了最小值，但比MT處理組高68.00%，MT處理組在貯藏第35 d時O2-·產(chǎn)生速率比對照組低36.63%，仍顯著（P＜0.05）低于對照組。結(jié)果表明，與對照組相比，MT處理減緩了杏果實內(nèi)O2-·產(chǎn)生速率，這一研究結(jié)果與外源褪黑素處理荔枝[27]結(jié)果一致。

圖2 外源褪黑素處理對杏果實O2-·產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effect of MT treatment on O2-· production rate of apricot fruit

2.3 外源褪黑素對杏果實SOD活力的影響

SOD可清除果實內(nèi)的O2-·，將其轉(zhuǎn)化為低毒性的H2O2和O2[28]。MT處理組接種A.alternata后的杏果實貯藏第0～21 d之間SOD酶活力持續(xù)上升，貯藏第21～49 d SOD活力下降（圖3），與對照組SOD活力總體變化相似。從圖3可知MT處理組SOD活力第21 d時比對照組高22.70%，MT處理組峰值顯著（P＜0.05）高于對照組，貯藏后期各處理組SOD活力逐漸下降。與對照組相比，MT處理組杏果實SOD酶活力高于對照組，且MT組杏果實O2-·產(chǎn)生速率降低，這一研究結(jié)果與殼聚糖處理杏[29]果實研究結(jié)果一致，由此表明MT處理可提高杏果實內(nèi)SOD酶活力，降低O2-·產(chǎn)生速率。

圖3 外源褪黑素處理對杏果實SOD活力的影響Fig.3 Effect of MT treatment on SOD activity of apricot fruit

2.4 外源褪黑素對杏果實H2O2含量的影響

研究表明，H2O2既可以作為植物防御反應(yīng)的信號分子，又可直接抵御病原菌的侵入，但過多的H2O2積累易造成果實細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷[30]。如圖4所示，MT處理組接種A.alternata后的杏果實H2O2含量整體呈先上升后下降趨勢，而對照組呈逐漸上升的趨勢。在貯藏前期第14 d時接種A.alternata菌的杏果實達到高峰，MT處理組杏果實的H2O2含量急劇上升，比對照組高46.90%，MT處理組H2O2含量顯著（P＜0.05）高于對照組。MT處理組貯藏第14 d之后H2O2含量逐漸減少，而對照組H2O2含量逐漸上升，在貯藏結(jié)束時，MT處理組比對照組低19.74%，MT處理組杏果實的H2O2含量低于對照組。MT處理的杏果實貯藏前期H2O2快速積累，可作為信號分子啟動杏果實其他防御反應(yīng)，又可直接抵御A.alternata菌進一步侵染，貯藏后期對照組H2O2含量增加，而MT組杏果實H2O2含量降低，有效避免了杏果實內(nèi)H2O2含量長時間過度積累，維持了杏果實細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)增強了杏果實抗病性，抑制了A.alternata進一步擴展。這一研究結(jié)果與石玲等[24]采用24-表油菜素內(nèi)酯處理誘導(dǎo)杏果實對黑斑病抗性研究結(jié)果一致。

圖4 外源褪黑素處理對杏果實H2O2含量的影響Fig.4 Effect of MT treatment on H2O2 content of apricot fruit

2.5 外源褪黑素對杏果實CAT活力的影響

CAT可將低毒性的H2O2轉(zhuǎn)化為無毒性的H2O和O2[31]。如圖5所示，杏果實接種A.alternata菌后，對照組貯藏期間CAT活力呈逐漸下降的過程，而MT處理組第0～14 d呈下降的趨勢，而后第21 d至貯藏結(jié)束CAT活力增加。在貯藏第14 d時，MT處理組CAT活力達到前期最低值，較對照組低21.15%，貯藏后期，MT處理組CAT活力逐漸上升，在貯藏結(jié)束時，MT處理組比對照組CAT活力高39.13%，MT處理組CAT活力顯著（P＜0.05）高于對照組。由圖4和圖5可知杏果實貯藏前期MT組CAT活力受到抑制，促進了H2O2含量早期積累（圖4），貯藏后期CAT活力逐漸上升，H2O2含量逐漸降低，有效避免了H2O2含量過度積累，而對照組CAT活力呈逐漸下降的趨勢，H2O2含量逐漸上升。

圖5 外源褪黑素處理對杏果實CAT活力的影響Fig.5 Effect of MT treatment on CAT activity of apricot fruit

2.6 外源褪黑素處理對杏果實POD活力的影響

POD協(xié)同CAT清除活性氧，促進分解果實內(nèi)多余的H2O2[32]。由圖6所示，杏果實接種A.alternata菌后，隨貯藏時間的變化MT組和對照組杏果實內(nèi)POD活力逐漸增大，在貯藏21 d時，MT處理組POD活力比對照組高53.30%，MT處理組的杏果實POD活力在貯藏第28～49 d之間保持逐漸上升且高于對照組，MT處理組POD活力在貯藏第49 d時是對照組POD活力的1.78倍，MT處理組貯藏第49 d時POD活力顯著（P＜0.05）高于對照組，由此表明，MT處理可提高杏果實內(nèi)POD活力，促進了H2O2分解，清除了因A.alternata菌侵染杏果實產(chǎn)生的H2O2，有效避免了長時間H2O2積累對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，從而誘導(dǎo)增強了杏果實對黑斑病的抗性。這與外源褪黑素處理梨果實[33]研究結(jié)果一致。

圖6 外源褪黑素處理對杏果實POD活力的影響Fig.6 Effect of MT treatment on POD activity of apricot fruit

2.7 外源褪黑素處理對杏果實MDA含量的影響

果實采后受到氧化脅迫主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，MDA是不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物，常被作為判斷細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[34]。杏果實中MDA含量因貯藏時間的變化而不斷增加，然而從圖7可知MT處理組顯著延緩了杏果實內(nèi)MDA的積累。在接種后的杏果實貯藏第28 d時MT處理組杏果實MDA含量比對照組顯著（P＜0.05）降低26.34%。在杏果實貯藏結(jié)束時，MT處理組的MDA含量比對照組低24.06%，結(jié)果表明MT處理組顯著降低了杏果實內(nèi)MDA積累，減輕了細(xì)胞膜膜脂過氧化。

圖7 外源褪黑素處理對杏果實MDA含量的影響Fig.7 Effect of MT treatment on MDA content of apricot fruit

2.8 外源褪黑素處理對杏果實細(xì)胞膜滲透率的影響

由圖8可知杏果實貯藏期間各處理組的細(xì)胞膜滲透率總體呈逐漸上升的趨勢，MT處理組細(xì)胞膜滲透率在貯藏第21 d時比對照組低49.18%，在貯藏第49 d時，MT處理組細(xì)胞膜透性為60.61%，對照組為83.32%，處理組的細(xì)胞膜滲透率較對照組小22.71%，由圖8可以看出杏果實貯藏第21～49 d時對照組細(xì)胞膜滲透率顯著（P＜0.05）高于MT處理組，由此表明褪黑素處理延緩了杏果實細(xì)胞膜滲透率的上升，維持了杏果實細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性。

圖8 外源褪黑素處理對杏果實細(xì)胞膜滲透率的影響Fig.8 Effect of MT treatment on cell membrane permeability of apricot fruit

3 討論

本研究表明，與對照組相比，不同濃度外源褪黑素處理均可明顯抑制接種A.alternata杏果實的病斑直徑和接種發(fā)病率的增加，其中以100 μmol/L褪黑素處理效果最好。一些研究表明了對番茄[35]、荔枝[36]、香蕉[37]等采用適宜濃度的褪黑素處理也可有效抑制灰霉菌、霜霉菌、炭疽菌等發(fā)病率。由此表明，外源褪黑素處理能夠誘導(dǎo)果實產(chǎn)生抗病性，降低果實的腐爛率。

H2O2在果實內(nèi)既可直接抵御病原菌的侵入，又可作為植物防御反應(yīng)的信號分子[38]。在本研究中，處理組貯藏前期SOD活力上升，O2-·產(chǎn)生速率下降，抑制了CAT活性，加速了杏果實內(nèi)H2O2的積累。早期H2O2快速積累既可直接抵御A.alternata的侵入，又可作為信號分子啟動杏果實內(nèi)防御反應(yīng)。胡培芳等[39]研究結(jié)果也表明采用亞精胺浸泡處理‘早酥梨’也可通過調(diào)控果實內(nèi)SOD和CAT活性，加速了早期H2O2積累，引起了果實過敏反應(yīng)增強果實防御能力，有效抑制了早酥梨果實黑斑病的發(fā)生。由此表明外源褪黑素處理引起早期杏果實內(nèi)H2O2積累是增強杏果實抗病性的重要原因。

當(dāng)病原菌侵染果實時，雖然早期H2O2積累可作為防御反應(yīng)的信號分子，但是過多的H2O2會引起果實細(xì)胞膜膜脂過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，從而積累有害物質(zhì)。在果實體內(nèi)存在SOD、CAT、POD等活性氧酶促清除系統(tǒng)，SOD可將果實內(nèi)O2-·歧化為低毒性的H2O2和O2，而CAT和POD可將果實內(nèi)多余的H2O2分解為無毒性的O2和H2O[40]。研究表明了采后苯并噻二唑[41]、茉莉酸甲酯[42]、硅酸鈉[43]浸泡處理甜瓜、富士蘋果和厚皮甜瓜等果實，通過調(diào)控SOD、CAT、POD等活性，調(diào)節(jié)O2-·產(chǎn)生速率和H2O2含量，維持了活性氧在果實內(nèi)產(chǎn)生與清除動態(tài)平衡，誘導(dǎo)了果實分別對Trichothecium roseum、Penicillium expansum等產(chǎn)生抗性，抑制了接種果實病斑直徑，降低了果實腐爛率，延長了果實貯藏期。在本研究中也發(fā)現(xiàn)外源褪黑素處理組接種杏果實貯藏后期CAT活性逐漸上升，且POD活性始終保持逐漸上升的趨勢，有效避免了H2O2含量和超氧陰離子過度積累，減輕了杏果實細(xì)胞膜膜脂過氧化，從而延緩了細(xì)胞膜滲透率的上升，減少了MDA的積累，保持了杏果實細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性。實驗結(jié)果表明了外源褪黑素處理誘導(dǎo)采后杏果實對黑斑病的作用與活性氧代謝有關(guān)。

4 結(jié)論

外源褪黑素處理降低了接種A.alternata杏果實發(fā)病率，延緩了病斑直徑的擴展，通過調(diào)控SOD、CAT、POD等活性，貯藏前期降低了O2-·產(chǎn)生速率，激發(fā)了杏果實內(nèi)H2O2快速積累，貯藏后期提高了CAT和POD活性，降低了H2O2含量，減輕了杏果實細(xì)胞膜膜脂過氧化，延緩了細(xì)胞膜滲透率和MDA含量的上升，維持了杏果實內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡，保持了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性，提高了杏果實對黑斑病的抗性。初步探究出外源褪黑素誘導(dǎo)杏果實對黑斑病的抗性，為促進褪黑素用于杏果實貯藏保鮮提供了理論依據(jù)，但褪黑素在果實中的作用是復(fù)雜的，其作用受體還未發(fā)現(xiàn)，還可從其他生理代謝進一步分析褪黑素誘導(dǎo)杏果實產(chǎn)生抗病性生理作用。