杜 寧，陳 旭，劉海燕, ，許文濤,

（1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山 063210；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）是蕓香科柑橘屬植物，我國種植面積和產(chǎn)量位居世界第一，在貯藏階段容易受到多種真菌侵染導(dǎo)致?lián)p失率高達(dá)20%～25%[1]。傳統(tǒng)的保鮮包裝不易降解，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，進(jìn)而促進(jìn)了新型可降解涂膜保鮮技術(shù)的開發(fā)。淀粉和殼聚糖因其成本低、可降解和良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用在面包[2-3]、果蔬[4-5]、肉類[6-7]等食品的包裝中，但單一的淀粉-殼聚糖包裝膜的抗菌能力較弱，需要引入銀納米簇（AgNCs）、納米ZnO、植物精油等抗菌材料來增強(qiáng)淀粉-殼聚糖包裝膜的抗菌性能。

AgNCs是直徑小于2 nm的團(tuán)簇，主要通過破壞細(xì)菌形態(tài)影響胞內(nèi)代謝[8]，不僅對(duì)細(xì)菌有較好的抗菌效果，對(duì)白色念珠菌[9]和曲霉[10]等真菌也有較強(qiáng)的抗菌作用，且添加AgNCs的薄膜還能抑制荔枝[11]、甘蔗[12]采后霉菌繁殖延長(zhǎng)貨架期，對(duì)多種食物都有良好的保鮮效果[13]。但單純的AgNCs性質(zhì)不穩(wěn)定，在DNA模板的加持下合成的AgNCs（DNA-AgNCs）具有穩(wěn)定的熒光和抗菌性能[14]。

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境被核酸、蛋白質(zhì)、多糖、小分子、各種離子等密集地占據(jù)，這種現(xiàn)象稱為分子擁擠，分子擁擠對(duì)分子結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)各種生命活動(dòng)有高效精確的調(diào)控作用[15-16]。平均分子量為200的PEG溶液（PEG 200）與核仁內(nèi)的環(huán)境相似，常用來體外模擬分子擁擠[17]，以穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)，確保DNA-AgNCs不受外界干擾[18]。加之PEG有微弱的抗菌作用[19]，因此，在DNA-AgNCs合成時(shí)加入PEG 200，可以增強(qiáng)DNA-AgNCs的穩(wěn)定性和抗菌能力。

本研究選用PEG 200模擬胞內(nèi)分子擁擠環(huán)境來合成DNA-AgNCs，以擴(kuò)展青霉（Penicillium expau sum）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、禾谷鐮刀菌（Fusa rium graminearum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）為模型來評(píng)估其抗真菌能力，再以淀粉和殼聚糖為基質(zhì)制備復(fù)合薄膜，并通過涂膜保鮮對(duì)接種擴(kuò)展青霉孢子的柑橘進(jìn)行青霉病防治效果的研究，以期開發(fā)一種環(huán)境友好的柑橘保鮮涂膜。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑橘 購自湖北省咸豐縣，果實(shí)大小均勻，成熟程度一致，無機(jī)械損傷和病害，采摘后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；擴(kuò)展青霉、黃曲霉、禾谷鐮刀菌、串珠鐮刀菌均為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系功能核酸實(shí)驗(yàn)室保藏；硝酸銀、硼氫化鈉 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰醋酸 分析純，北京化工廠；甘油

分析純，上海麥克林生化科技有限公司；殼聚糖美國Sigma公司；食用玉米淀粉 福建古田榮昌貿(mào)易有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDB）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDA） 上海索萊寶生物科技有限公司。

GL-3250A磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ-600VD超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；TA.HD plusC質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；OCA25接觸角測(cè)量?jī)x 德國Dataphysics公司；Amix熒光生物成像系統(tǒng) 美國Spectral Instruments Imaging公司；ELX-800多功能酶標(biāo)儀 德國Biotek公司；SU5000掃描電鏡 日本日立公司；DMIL LED熒光倒置顯微鏡 德國徠卡公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA-AgNCs的制備 根據(jù)Yeh等[20]的方法，將序列（5'-CCCCCCCCCCCC-3'）與AgNO3溶液混合，室溫孵育30 min，然后加入新鮮配制的NaBH4溶液，振蕩1 min。最終濃度為DNA 15 μmol/L，AgNO3180 μmol/L，NaBH4180 μmol/L，pH6.8的PB緩沖液20 mmol/L。在混合液中加入50% PEG 200溶液模擬分子擁擠環(huán)境（記為Ag+PEG），以不加PEG溶液做對(duì)照（記為Ag），使用前在4 ℃避光條件下反應(yīng)12 h。

1.2.2 DNA-AgNCs的表征 將制備好的DNA-Ag-NCs溶液放入96孔板中測(cè)定其在350～600 nm的吸光度。將DNA-AgNCs溶液用PB緩沖液稀釋10倍后，滴在噴有碳膜的銅網(wǎng)上，自然干燥后，使用透射電子顯微鏡觀察其形貌以及大小。

1.2.3 DNA-AgNCs對(duì)四種真菌孢子萌發(fā)的影響取1 mL PDB培養(yǎng)基至保藏的真菌平板上，晃動(dòng)平板，將洗下的孢子收集到離心管中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并將孢子懸浮液終濃度調(diào)至1×106CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。參考付瑞敏等[21]的方法，在10 mL PDB培養(yǎng)基中加入100 μL DNA-AgNCs溶液，同時(shí)加入100 μL 1×106CFU/mL孢子懸浮液，于(28±1) ℃搖床中180 r/min培養(yǎng)18 h。以無菌水為空白對(duì)照組，每個(gè)處理至少觀察100個(gè)孢子，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用熒光倒置顯微鏡觀察孢子萌發(fā)，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的確定 根據(jù)Espinel-Ingroff等[22]方法，將四種1×104CFU/mL孢子懸液分別接種300 μL到96孔板中，依次加入0.25～2.75 μmol/L DNA-AgNCs溶液，在(28±1) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度，以無渾濁的第一個(gè)孔的濃度為MIC，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 復(fù)合薄膜的制備 根據(jù)李雪等[5]的方法稍作修改，將5%的玉米淀粉（w/w）用磁力攪拌器在90 ℃，700 r/min糊化30 min，將1%殼聚糖（w/w）溶于1%的冰醋酸（v/v）溶液中600 W超聲至溶解，二者以8:2（v/v）的比例均勻混合，以60%的甘油（w/w）為增塑劑，攪拌均勻后超聲，用于柑橘的涂膜，其余溶液倒入玻璃板，室溫下干燥36 h，得到復(fù)合薄膜。不加DNA-AgNCs的薄膜記為S+C，加入10%DNA-AgNCs溶液（v/v）的薄膜記為S+C+Ag，加入10%分子擁擠DNA-AgNCs溶液（v/v）的薄膜記為S+C+Ag+PEG。

1.2.6 復(fù)合薄膜的表征 用掃描電鏡觀察和拍攝薄膜的形貌特征，薄膜先用液氮浸泡后破碎，每個(gè)樣品都做噴金處理，并在1.0 kV的加速電壓下操作。

力學(xué)性能按照國標(biāo)GB/T 1040.1-2018[23]測(cè)定并加以改進(jìn)。將復(fù)合薄膜裁成15 mm×70 mm長(zhǎng)條，實(shí)際測(cè)量長(zhǎng)度為55 mmol/L，測(cè)試速度為200 mm/min，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

用接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定復(fù)合薄膜與水的接觸角。將10 μL的蒸餾水滴在薄膜（20 cm2）表面，測(cè)量液滴兩側(cè)的接觸角，確保對(duì)稱和水平，取3次測(cè)量結(jié)果的平均值。

抗真菌性能參照Spasova等[24]的方法，將四種真菌的孢子懸液調(diào)至1×106CFU/mL，分別涂布在PDA平板上，將薄膜剪成直徑10 mm的圓片，經(jīng)酒精擦拭待其揮發(fā)后放置在平板表面，(28±1) ℃培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量各處理的抑菌圈直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.7 復(fù)合薄膜對(duì)柑橘青霉病抑制作用的研究

1.2.7.1 柑橘處理 參照黃姣麗等[25]的方法，柑橘共分為四組，每組6個(gè)，分別記為：對(duì)照組，淀粉-殼聚糖膜處理組（S+C），加入10% DNA-AgNCs溶液（v/v）的淀粉-殼聚糖膜處理組（S+C+Ag），加入10%分子擁擠的DNA-AgNCs溶液（v/v）的淀粉-殼聚糖膜處理組（S+C+Ag+PEG）。柑橘經(jīng)流水沖洗后，將三個(gè)處理組分別在三種膜溶液中浸泡1 min，對(duì)照組在無菌水中浸泡1 min，待其自然晾干后，用無菌打孔器在表面赤道處對(duì)稱刺兩個(gè)深2 mm、寬2 mm的傷口，在傷口表面接種10 μL 1×106CFU/mL擴(kuò)展青霉孢子懸液，將相同處理的柑橘裝在一個(gè)塑料袋內(nèi)，于恒溫培養(yǎng)箱(28±1) ℃貯藏14 d，每隔2 d測(cè)量病斑直徑和稱重，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用十字交叉法測(cè)量果實(shí)的病斑直徑，失重率按照下式計(jì)算。

1.2.7.2 感官評(píng)價(jià) 根據(jù)裴少培[26]的方法稍作修改，采用綜合評(píng)價(jià)的方法對(duì)柑橘進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（100分制），由10位具有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的人組成評(píng)價(jià)小組，根據(jù)柑橘的硬度、色澤、皺縮和腐爛程度分為四個(gè)等級(jí)，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2020軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.6軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA-AgNCs的表征

Javani等[14]結(jié)果表明，DNA序列5'-CCCCCC CCCCCC-3'合成的DNA-AgNCs有較好的抗菌效

果，加之PEG溶于水且在生物環(huán)境呈惰性[18]，且PEG 200與核仁內(nèi)環(huán)境相似[15]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇以上述序列為模板，PEG 200體外模擬分子擁擠，來合成DNA-AgNCs。首先通過吸光度對(duì)正常和擁擠條件下合成的DNA-AgNCs進(jìn)行表征。如圖1所示，正常條件合成的Ag和擁擠環(huán)境的Ag+PEG的吸收峰均在430 nm左右，但后者峰值較低，這與Huang等[18]結(jié)果一致，表明兩種DNA-AgNCs成功合成。由圖2可知，制備的兩種DNA-AgNCs大小均一且有良好的分散性，Ag直徑在2 nm左右（圖2A），Ag+PEG約為3 nm（圖2B），汪爾康[27]、Xu等[28]報(bào)道，含有多個(gè)C的DNA模板序列合成的DNA-AgNCs粒徑均在2 nm左右，這有利于其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮抗菌作用。

圖1 DNA-AgNCs的吸光度表征Fig.1 Absorbance characterization of DNA-AgNCs

圖2 正常DNA-AgNCs（A）和分子擁擠DNA-AgNCs（B）的電鏡圖像Fig.2 Electron microscope images of normal DNA-AgNCs(A)and molecular crowding DNA-AgNCs(B)

2.2 DNA-AgNCs的抗真菌能力

2.2.1 DNA-AgNCs抑制四種孢子萌發(fā)的能力 為探究分子擁擠對(duì)DNA-AgNCs抗真菌能力的影響，首先通過顯微鏡觀察計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。如表2所示，擴(kuò)展青霉對(duì)DNA-AgNCs最敏感，Ag能抑制其68.940%的孢子萌發(fā)，而Ag+PEG能達(dá)到83.351%。對(duì)兩種鐮刀菌的抑制效果較差，Ag+PEG的抑制率僅有59.814%和52.803%。黃曲霉對(duì)兩種DNAAgNCs的敏感性居中，抑制率分別為61.024%和76.527%。因此，DNA-AgNCs對(duì)四種孢子都有不同程度的抑制作用，且Ag+PEG的抑制能力明顯優(yōu)于Ag（P＜0.05）。AgNCs由于能使菌絲變形斷裂，增加外膜損傷，促進(jìn)K+釋放，還能使活性氧、脂質(zhì)過氧化、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性升高，因此有顯著的抗真菌活性[10]。Xie等[29]報(bào)道，經(jīng)PEG修飾的AgNCs能夠聚集在細(xì)菌表面，進(jìn)而使細(xì)胞扭曲胞膜破裂導(dǎo)致胞質(zhì)外漏。此外，Hao等[19]實(shí)驗(yàn)表明，PEG有微弱的抗菌效果，能形成水和層抑制細(xì)菌蛋白黏附，因此Ag+PEG的抑制率高于Ag的可能原因是AgNCs與PEG協(xié)同作用提高了其抗真菌能力。

表2 兩種DNA-AgNCs對(duì)四種真菌孢子萌發(fā)抑制率Table 2 Inhibition rates of two DNA-AgNCs on four kinds of fungal spores

2.2.2 DNA-AgNCs對(duì)四種真菌的MIC DNA-Ag-NCs與四種孢子懸液在96孔板培養(yǎng)3 d后，以完全抑制真菌生長(zhǎng)的最低濃度（即第一個(gè)澄清孔濃度）為MIC。兩種DNA-AgNCs對(duì)擴(kuò)展青霉的MIC最小（圖3A），分別為1.00和0.50 μmol/L，僅在純孢子液中看到輕微菌絲生成（圖4A）。黃曲霉在低濃度的孔壁上能看到明顯的白色菌絲（圖4B），MIC分別為1.25和1.00 μmol/L（圖3B）。Ag和Ag+PEG對(duì)禾谷鐮刀菌的MIC差距較大（圖3C），分別為2.50和1.50 μmol/L，在純孢子液中可見明顯菌絲（圖4C），后續(xù)孔中溶液也較渾濁。串珠鐮刀菌雖沒有明顯的菌絲（圖4D），但大多數(shù)孔已渾濁，直到2.50和2.25 μmol/L可見澄清（圖3D）。Malkapur等[10]制備的AgNCs對(duì)寄生曲霉和黃曲霉的MIC分別為4.5和3.5 μg/mL，Chen等[30]所制AgNCs 6.4 μg/mL即對(duì)耐藥性銅綠假單胞菌有較好的殺滅效果，因此AgNCs具有微量高效的抗菌效果。

圖3 四種真菌與兩種DNA-AgNCs培養(yǎng)3 d的OD值Fig.3 OD values of four fungi and two DNA-AgNCs cultured for 3 d

2.3 復(fù)合薄膜的性能分析

2.3.1 SEM圖像 對(duì)三種復(fù)合薄膜的外觀和表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，雖然外觀沒有較大差異（圖5插圖），但在電鏡下的形態(tài)差異較大。如圖5A所示，無DNAAgCs的S+C薄膜表面較平整，幾乎看不到顆粒凸起，添加有DNA-AgNCs的S+C+Ag薄膜表面較粗糙（圖5B），能看到較多的顆粒均勻分散在表面，而添加分子擁擠的S+C+Ag+PEG薄膜表面雖也有顆粒在膜表面均勻分布，但較S+C+Ag薄膜平整（圖5C）。由于PEG有良好的相容性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[31]，可以使DNA-AgNCs更充分地分散在淀粉和殼聚糖的混合溶液中，因此S+C+Ag+PEG薄膜較S+C+Ag薄膜平整，顆粒狀結(jié)構(gòu)不明顯。

圖5 三種復(fù)合薄膜的SEM圖像（插圖為薄膜照片）Fig.5 SEM images of three kinds of composite films（inset is film photo）

2.3.2 力學(xué)性能 薄膜的延展性通過力學(xué)性能體現(xiàn)，采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)復(fù)合薄膜的力學(xué)性能進(jìn)行測(cè)定。如表3所示，Ag的加入將拉伸強(qiáng)度由4.729 MPa提高到5.968 MPa，斷裂伸長(zhǎng)率也從51.399%增加至60.368%。Ag+PEG的改善效果更顯著（P＜0.05），拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率分別增加至7.300 MPa和77.287%。由于DNA-AgNCs濃度低，均勻分散在淀粉和殼聚糖基質(zhì)中，氫鍵的作用影響分子排列和運(yùn)動(dòng)，使復(fù)合薄膜結(jié)構(gòu)更加緊致[32]。Kiuchi等[31]研究表明，由于PEG具有良好的相容性和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，也能降低薄膜脆性，使分子間有更大的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。

2.3.3 接觸角 接觸角是表征薄膜疏水性的常用方法，90°是薄膜疏水性的臨界值[33]。由表3可知。加入Ag后，淀粉-殼聚糖薄膜的接觸角由59.700°增加至69.785°，這可能歸因于DNA-AgNCs與淀粉和殼聚糖的-OH相互作用形成氫鍵，使薄膜的疏水性增加[34]。而加入Ag+PEG后接觸角有所下降，為66.717°，這與SEM結(jié)果趨勢(shì)一致。Li等[35]報(bào)道，表面粗糙度的增加通常可以提高材料表面疏水性，AgNCs與顆粒團(tuán)聚體之間的空隙可以截留空氣，使其表面由固體和空氣組成，從而提高了納米復(fù)合薄膜的表面疏水性。由于加入Ag后復(fù)合薄膜表面變得更加粗糙，因此S+C+Ag水接觸角最大，而S+C+Ag+PEG的表面較S+C+Ag光滑，因此水接觸角居中，S+C表面最平整水接觸角也最小。此外，薄膜在包裝食品時(shí)大多處于一個(gè)潮濕的環(huán)境，Tai等[33]指出提高疏水性能夠有效隔絕內(nèi)外水分流動(dòng)，減少細(xì)菌附著，起到良好的屏障作用，對(duì)薄膜的抗菌應(yīng)用十分有利。

表3 復(fù)合薄膜的力學(xué)性能和水接觸角Table 3 Mechanical properties and water contact angle of composite film

2.3.4 抗真菌能力 為評(píng)估復(fù)合薄膜的抗真菌能力，將三種薄膜分別與四種真菌培養(yǎng)，抑菌效果由抑菌圈直徑?jīng)Q定。如表4所示，在沒有DNA-AgNCs加入時(shí)，S+C薄膜沒有抗菌效果，加入DNA-AgNCs后兩種薄膜有明顯的抑菌圈，其中擴(kuò)展青霉的抑菌圈最大，分別為18.249和23.969 mm，而串珠鐮刀菌只有11.736和13.349 mm，且S+C+Ag+PEG的抑菌圈直徑顯著大于S+C+Ag（P＜0.05），這與2.2中DNAAgNCs的抗真菌能力相對(duì)應(yīng)，表明S+C+Ag+PEG復(fù)合薄膜有更顯著的抗菌效果。

表4 三種復(fù)合薄膜的抑菌圈直徑Table 4 Diameter of bacteriostatic zone of three kinds of composite films

2.4 復(fù)合薄膜對(duì)柑橘青霉病抑制作用

2.4.1 復(fù)合薄膜對(duì)柑橘失重率和病斑直徑的影響果蔬在采摘后由于蒸騰和呼吸作用消耗自身的水分和養(yǎng)分，重量會(huì)持續(xù)下降。由圖6可知，柑橘在接種青霉之后重量不斷下降，在2 d僅對(duì)照組失重率超過5%，其他三組均在4%左右。隨著時(shí)間的增加，對(duì)照組失重率幾乎呈倍數(shù)增長(zhǎng)，14 d時(shí)高達(dá)32.5%，且與S+C組無顯著性差異（P＞0.05）。而S+C+Ag+PEG組失重率僅為23.8%，與對(duì)照組第10 d的水平相當(dāng)，且與其他三組有顯著性差異（P＜0.05），這表明S+C+Ag+PEG復(fù)合涂膜能夠延緩柑橘重量損失。

圖6 復(fù)合薄膜對(duì)柑橘失重率的影響Fig.6 Effects of composite film on weight loss rate of citrus

柑橘在貯藏期間常由于磕碰造成表皮受損增加微生物侵染的幾率，因此通過刺傷接種孢子液來模擬此情況。如圖7所示，第2 d四組均沒有明顯的病斑，4 d時(shí)對(duì)照組可見0.6 cm病斑 直徑，S+C和S+C+Ag僅0.4 cm，S+C+Ag病斑依舊不明顯。在14 d時(shí)，對(duì)照組病斑直徑達(dá)3.3 cm，而S+C+Ag+PEG病斑僅2.3 cm，與10 d時(shí)對(duì)照組直徑相似。結(jié)合圖8可以看出，S+C+Ag+PEG處理組在第10 d可見明顯菌斑，其余三組在第6 d即可見菌斑生成。三組涂膜處理的病斑直徑均小于對(duì)照組，且S+C+Ag+PEG處理組效果最顯著（P＜0.05），這與前面Ag+PEG的強(qiáng)抗菌能力相對(duì)應(yīng)，表明S+C+Ag+PEG復(fù)合涂膜能夠顯著抑制病斑擴(kuò)散（P＜0.05）。

圖7 復(fù)合薄膜對(duì)柑橘病斑直徑的影響Fig.7 Effects of composite film on spot diameter of citrus

2.4.2 復(fù)合薄膜對(duì)柑橘感官品質(zhì)的影響 柑橘在貯藏期間質(zhì)量逐漸下降，視覺評(píng)價(jià)是品質(zhì)評(píng)估最直觀的方式。如圖9所示，起初四組無顯著性差異（P＞0.05），評(píng)分均在90分以上，顏色鮮亮，果皮柔韌有彈性。第6 d開始，對(duì)照組已降至60分，結(jié)合圖8可看出，開始出現(xiàn)明顯病斑，外皮光澤度下降，S+C和S+C+Ag僅在接種除有較少菌絲，三個(gè)涂膜處理組評(píng)分均在70分以上。在第10 d時(shí)，對(duì)照組降至33分，病斑內(nèi)陷并伴有綠色孢子產(chǎn)生，外皮堅(jiān)硬粗糙失去光澤；S+C組患病處有輕微內(nèi)陷和少量菌絲，果皮失去彈性硬度增加；S+C+Ag和S+C+Ag+PEG僅有病斑直徑的增加，外皮的彈性和亮度還維持在較高的水平。直至第14 d，對(duì)照組僅有17分，柑橘腐爛嚴(yán)重并產(chǎn)生酸腐味液體；S+C和S+C+Ag組已不足40分，外皮粗糙暗淡，患病處內(nèi)陷，有異味產(chǎn)生；S+C+Ag+PEG組評(píng)分還在50以上，外皮脆性逐漸增加，光澤度有輕微下降，但沒有明顯的氣味變化。綜上所述，柑橘在貯藏14 d內(nèi)感官品質(zhì)不斷下降，其中對(duì)照組下降最快，S+C+Ag+PEG品質(zhì)最好，顯著優(yōu)于其他三組（P＜0.05），因此S+C+Ag+PEG復(fù)合涂膜能夠有效延緩柑橘感官品質(zhì)的降低。

圖8 不同處理下柑橘14 d內(nèi)外觀變化Fig.8 Appearance changes of citrus under different treatments in 14 d

圖9 復(fù)合涂膜對(duì)柑橘外觀品質(zhì)的影響Fig.9 Effects of compound coating on appearance quality of citrus

3 結(jié)論

本研究在分子擁擠條件下合成的DNA-AgNCs有廣譜抗真菌效果，其中對(duì)擴(kuò)展青霉效果最明顯，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)83.351%，MIC僅為0.5 μmol/L，對(duì)其他真菌的抑制率也均在50%以上，MIC不超過2.5 μmol/L。將DNA-AgNCs加入淀粉-殼聚糖溶液中制備復(fù)合薄膜，能有效改善薄膜的韌性，賦予薄膜良好的屏障作用和抗菌效果。作為涂膜使用在青霉侵染的柑橘中，S+C+Ag+PEG涂膜能有效延緩柑橘重量損失，14 d內(nèi)失重率僅有23.8%，還能有效抑制病斑蔓延，在接種孢子液14 d后病斑只有2.3 cm，對(duì)青霉病有較好的防治效果，且能將柑橘品質(zhì)維持在較高的水平。本研究為DNA-AgNCs的應(yīng)用提供新方向，更好地滿足食品包裝的多樣化應(yīng)用需求。