徐 幸，張 燕，舒 平，楊衛(wèi)花

（大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南大理 671000）

Key words：cephalosporins；isotope internal standard；LC-MS/MS；animal derived food孢菌素對(duì)革蘭氏陽性菌有抑制作用，能讓細(xì)菌在增殖階段死亡[1-2]，因其具有抗菌譜寬、抗菌效果強(qiáng)的特點(diǎn)，常被飼養(yǎng)者用于動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療。然而，不加控制地使用頭孢菌素可能導(dǎo)致其在動(dòng)物源性食品中殘留累積，使消費(fèi)者被動(dòng)地吸收此類藥物[3-4]。頭孢菌素的殘留對(duì)人體和環(huán)境會(huì)產(chǎn)生以下影響：首先，干擾腸道正常菌群，導(dǎo)致菌群失調(diào)[5]；其次，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥病原體菌株，使用抗生素治療的病人引起不良反應(yīng)[6-8]；最后，動(dòng)物排泄物中頭孢菌素耐藥菌株釋放到環(huán)境后會(huì)污染水體和土壤，并在污泥中長期保持耐藥性[9]。

為減少抗生素殘留給消費(fèi)者帶來的影響，歐盟、美國和日本都對(duì)動(dòng)物源性食品中的頭孢菌素殘留規(guī)定了限量[10]。日本限制使用的頭孢菌素類數(shù)量最多、最嚴(yán)格。在中國，GB 31650-2019《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》對(duì)頭孢菌素類（頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢噻呋）的最大殘留限量進(jìn)行了規(guī)定（見表1）。因此，建立檢測多種頭孢菌素及其代謝物殘留的方法具有重要意義。目前，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測分析研究多集中于醫(yī)藥和環(huán)境領(lǐng)域[11-15]，而食品領(lǐng)域中大多數(shù)的研究文獻(xiàn)是關(guān)于食品中青霉素類的分析檢測，對(duì)頭孢菌素類的分析檢測文獻(xiàn)相對(duì)較少[16-18]?，F(xiàn)有的關(guān)于頭孢菌素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[19-21]。通常傳統(tǒng)的HPLC-MS/MS法前處理方法步驟繁瑣，如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮、固相萃取柱凈化、氮吹濃縮等步驟[22-24]。這些凈化方法費(fèi)力又費(fèi)時(shí)，需要使用大量的有機(jī)溶劑。因此，開發(fā)省時(shí)、方便、可靠的預(yù)處理技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)。

表1 食品中頭孢菌素最大殘留限量（中國）Table 1 Maximum residue limits for cephalosporins in foods(China)

本文擬采用多個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)作為定量方式建立分析市售消費(fèi)量較大的動(dòng)物源性食品（豬肉、牛肉、雞肉、魚肉）中多種頭孢菌素的殘留量，并對(duì)提取溶劑和凈化材料進(jìn)行了優(yōu)化，最終，采用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分別掃描正、負(fù)離子的模式，測定20種頭孢菌素殘留的方法，并以此方法在實(shí)際樣品中進(jìn)行了驗(yàn)證分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

46份豬肉樣品、38份牛肉樣品、43份雞肉樣品、26份魚肉樣品 市售；頭孢氨芐（純度≥98%）、頭孢地尼（純度≥95%）、頭孢克肟（純度≥98%）、頭孢唑啉（純度≥97%）、頭孢喹肟（純度≥97%）、頭孢他啶（純度≥90%）、頭孢曲松（純度≥97%）、頭孢地嗪（純度≥97%）、頭孢替唑（純度≥97%）、頭孢噻吩（純度≥98%）、頭孢呋辛（純度≥97%）、頭孢西丁（純度≥97%）等標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定研究院；頭孢拉定（純度≥97%）、頭孢匹林（純度≥97%）、頭孢哌酮（純度≥98%）、頭孢洛寧（純度≥97%）、頭孢匹羅（純度≥97%）、頭孢噻呋（純度≥98%）、頭孢呋辛酯（純度≥97%）等標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer公司；去呋喃甲酰基頭孢噻呋（純度≥90%）、頭孢呋辛D3（純度≥97%）、頭孢匹林D4（純度≥97%）、頭孢氨芐D5（純度≥98%）等標(biāo)準(zhǔn)品 加拿大TRC公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（C18）吸附劑、0.22 μm尼龍針濾頭 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；甲酸（色譜純） Acros公司；乙腈、丙酮、甲醇、乙醇 均為色譜純，德國Merck公司；Ascentis C8色譜柱（規(guī)格為10 cm×4.6 mm，3 μm）Supelco公司；其他試劑 均為分析純。

QTRAP 4500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 AB SCIEX公司；88880018型渦旋振蕩器 Thermo公司；Direct-Q3超純水機(jī) Millipore公司；AL204型電子天平 Mettler toledo公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確值0.1 mg），由于各標(biāo)準(zhǔn)品的溶解性不同，分別采用不同溶劑溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。頭孢氨芐、頭孢氨芐D5、頭孢拉定、頭孢匹林、頭孢匹林D4、頭孢洛寧、頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢地嗪、頭孢替唑、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢呋辛D3等標(biāo)準(zhǔn)品采用超純水溶解；頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻呋、頭孢呋辛酯、去呋喃甲?；^孢噻呋等標(biāo)準(zhǔn)品采用甲醇溶解；頭孢哌酮采用丙酮溶解。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.00 g絞碎的樣品于50 mL離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液（質(zhì)量濃度為1.0 mg/L），加入10 mL甲醇渦旋混勻提取1 min，振蕩混勻，以轉(zhuǎn)速5000 r/min離心5 min，吸取2 mL上清液于10 mL離心管中，添加150 mg的C18吸附劑，充分振蕩1 min。將上清液采用0.22 μm尼龍針濾頭過濾，得到待檢測液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 儀器分析條件 流動(dòng)相：A為體積濃度為0.1%的甲酸溶液，B為乙腈。

液相色譜洗脫條件（正模式）：0～1.0 min，5% B；

1.0～8.0 min，5%～95% B；8.0～10.0 min，95% B；10.0～10.1 min，95%～5% B；10.1～14.0 min，5% B。

液相色譜洗脫條件（負(fù)模式）：0～1.0 min，40%B；1.0～3.0 min，40%～95% B；3.0～3.1 min，95%～5%B；3.1～7.5 min，5% B。

流速：0.50 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源；噴霧電壓：5500 eV；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；掃描方式多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）條件見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測條件Table 2 Parameter of MRM

1.2.4 方法驗(yàn)證

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用甲醇/水（體積比1:2）混合溶劑稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，由于各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在儀器上的響應(yīng)值不同，分別配制成高響應(yīng)值的頭孢菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（17種），質(zhì)量濃度為5、10、20、40、60、80、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，低響應(yīng)值的頭孢菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（3種，頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢曲松），質(zhì)量濃度為25、50、100、200、300、400、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取頭孢呋辛D3、頭孢匹林D4、頭孢氨芐D5等內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配制進(jìn)各質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度為10 μg/L，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定，以頭孢菌素與同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)，頭孢菌素與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 添加回收實(shí)驗(yàn) 分別在不同基質(zhì)樣本中（豬肉、牛肉、雞肉、魚肉）添加3個(gè)水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在儀器上的響應(yīng)值，17種響應(yīng)值較高的化合物（頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢匹林、頭孢洛寧、頭孢他啶、頭孢地嗪、頭孢替唑、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻呋、頭孢呋辛酯、去呋喃甲?；^孢噻呋、頭孢哌酮）添加水平為10、40、80 μg/kg，3種響應(yīng)值較低的化合物（頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢曲松）添加水平為50、200、400 μg/kg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用HPLC-MS/MS進(jìn)行分析檢測，每個(gè)樣品進(jìn)樣測試2次，HPLC-MS/MS數(shù)據(jù)采集使用AB SCIEX Analyst software軟件，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2007軟件，處理數(shù)據(jù)和繪圖采用Origin 8.0和Photoshop CS6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS儀器分析條件的優(yōu)化

采用HPLC-MS/MS分析的過程中，流動(dòng)相的組成會(huì)影響化合物的峰形和響應(yīng)值。本文考察了4種流動(dòng)相組合模式的分析效果，分別為：水和乙腈、水和甲醇、0.1%甲酸水溶液和乙腈、5 mmol/L醋酸銨水溶液和乙腈。結(jié)果表明，大多數(shù)化合物在0.1%甲酸水溶液和乙腈流動(dòng)相體系中的峰形和響應(yīng)值都較好，最終，選擇0.1%的甲酸水溶液和乙腈體系作為本實(shí)驗(yàn)分析的流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)嘗試采用相同的梯度洗脫程序同時(shí)掃描正、負(fù)離子，然而效果并不理想，因此，經(jīng)過優(yōu)化梯度洗脫程序，本文采用不同的梯度洗脫程序分別掃描正、負(fù)離子，正離子掃描模式洗脫程序用于分析14個(gè)頭孢菌素和2個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)（頭孢氨芐D5和頭孢匹林D4），負(fù)離子掃描模式洗脫程序用于分析6個(gè)頭孢菌素和1個(gè)同位素內(nèi)標(biāo)（頭孢呋辛D3），頭孢菌素的離子對(duì)掃描條件見表2中，各種頭孢菌素化合物的多反應(yīng)監(jiān)測MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of cephalosporins standard solution

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑和吸附劑的選擇 頭孢菌素的極性與其分子結(jié)構(gòu)中含有的官能團(tuán)有關(guān)，大多數(shù)頭孢菌素可以溶解于極性溶劑。在本實(shí)驗(yàn)中，考察了3種極性溶劑從動(dòng)物源性食品基質(zhì)中提取頭孢菌素的效果，分別為乙腈、甲醇、乙醇。同時(shí)，采用C18和PSA吸著劑作為凈化材料來減少由基質(zhì)引起的干擾，C18吸附劑由于碳含量占比10%而具有疏水性，可以吸附非極性和弱極性的物質(zhì)，主要是樣品中的脂類、多環(huán)芳烴和鄰苯二甲酸酯類。PSA吸附劑有弱陰離子交換作用、極性相互作用和絡(luò)合作用，可以吸附各種極性色素、脂肪酸和有機(jī)酸[25]。如圖2所示，采用乙腈作提取溶劑時(shí)，多種頭孢菌素的回收率都很低，而采用甲醇與乙醇作提取溶劑時(shí)，回收率更高。此外，與采用PSA相比，采用C18作為凈化吸附劑的回收率相對(duì)較高。結(jié)果顯示，大多數(shù)頭孢菌素可能被PSA吸附，分析原因可能是PSA吸附劑的氨基與頭孢菌素的羧基發(fā)生相互作用有關(guān)（如圖3所示），而C18吸附劑含有的烷基則不會(huì)與頭孢菌素發(fā)生這種相互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇為提取溶劑，采用C18吸附劑作為凈化材料。

圖2 不同提取溶劑和吸附劑對(duì)頭孢菌素回收率的影響Fig.2 Effects on recovery of cephalosporins under different solvent and sorbent

圖3 C18和PSA吸附劑作用于頭孢菌素的可能機(jī)制Fig.3 Possible mechanism for C18 and PSA sorbents on cephalosporins

2.2.2 吸附劑用量的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了使用不同劑量的吸附劑對(duì)頭孢菌素回收率的影響，采用C18吸附劑作為凈化材料時(shí)，吸附劑使用量的變化對(duì)大多數(shù)頭孢菌素的回收率沒有影響，而有5種頭孢菌素的回收率會(huì)受到影響，如圖4所示，當(dāng)C18吸附劑的使用量從75 mg增加到200 mg的過程時(shí)，5種頭孢菌素（頭孢地尼、頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢地嗪和頭孢西丁）的回收率逐漸增加，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能與這5種頭孢菌素的分子量較大，含有的氨基較多，提取液中一些脂類物質(zhì)可能會(huì)與頭孢菌素的氨基發(fā)生相互作用，使這些頭孢菌素被雜質(zhì)吸附，導(dǎo)致回收率較低，而當(dāng)使用C18吸附劑凈化處理樣品提取液時(shí)，提取液中的脂質(zhì)與C18吸附劑發(fā)生相互作用，使最初與脂質(zhì)發(fā)生作用的頭孢菌素被釋放出來，從而提高了回收率。作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，也采用相同的實(shí)驗(yàn)方法考察PSA吸附劑對(duì)頭孢菌素的影響，結(jié)果表明，大多數(shù)頭孢菌素的回收率隨著PSA吸附劑用量的增加而逐漸降低（圖4），這也進(jìn)一步驗(yàn)證了上一步實(shí)驗(yàn)的推論，PSA吸附劑會(huì)與頭孢菌素發(fā)生相互作用?？紤]到凈化效果和節(jié)約因素，最終本實(shí)驗(yàn)采用150 mg的C18吸附劑用于凈化提取液。

圖4 不同劑量的吸附劑對(duì)頭孢菌素回收率的影響Fig.4 Effects of different dosage of sorbent on recovery rate of cephalosporins

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)是除被測組分以外的其他物質(zhì)，如磷脂、膽固醇和其它內(nèi)源性物質(zhì)，當(dāng)這些組分進(jìn)入質(zhì)譜儀時(shí)，液滴蒸發(fā)產(chǎn)生的氣體離子可能與液體表面的目標(biāo)離子發(fā)生競爭作用，這將導(dǎo)致目標(biāo)離子的電離效率減少或增強(qiáng)，然后導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)值的減少或增加[26-27]，這種現(xiàn)象就是基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，頭孢菌素基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算方法為：基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值[25]。如表3所示，本實(shí)驗(yàn)中的20種頭孢菌素的基質(zhì)效應(yīng)從0.368到0.768不等，這個(gè)結(jié)果表明，在動(dòng)物源性食品中，樣品的基質(zhì)效應(yīng)是明顯的，因此，為減少基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，采用添加穩(wěn)定性同位素內(nèi)標(biāo)的方法來解決這個(gè)問題。

表3 不同動(dòng)物源性樣品的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Matrix effect for cephalosporins in different animal derived matrices

2.3.2 線性方程、檢出限和定量限 頭孢菌素的線性方程采用外標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的比值繪制，各線性方程見表4，其中X是頭孢菌素外標(biāo)物質(zhì)與同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值，Y是頭孢菌素外標(biāo)物質(zhì)與同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，本實(shí)驗(yàn)一共使用了3種同位素物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，每一種化合物對(duì)應(yīng)使用的具體內(nèi)標(biāo)物見表4，線性方程的決定系數(shù)（R2）范圍從0.9913到0.9998。方法檢出限（LOD）為3倍信噪比的檢測濃度，定量限（LOQ）為10倍信噪比的檢測濃度，根據(jù)儀器的檢測信號(hào)值，這20種頭孢菌素LOD的范圍為1.0～20.0 μg/kg，LOQ的范圍為3.0～60.0 μg/kg。

表4 線性方程、檢出限和定量限Table 4 Linear equation, LOD and LOQ of cephalosporins

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度 以準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)方法的有效性，對(duì)20種頭孢菌素分別在4種基質(zhì)（豬肉、牛肉、雞肉、魚肉）中，添加3個(gè)濃度水平的回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)?；厥章式Y(jié)果見表5，在不同基質(zhì)中，頭孢菌素的平均回收率范圍在78.08%～115.47%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的范圍為3.07%～12.44%，回收率實(shí)驗(yàn)表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 不同基質(zhì)中頭孢菌素的回收率和精密度（n=6）Table 5 Recovery and RSD of the cephalosporins in different matrices (n=6)

2.3.4 方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用 為驗(yàn)證穩(wěn)定同位素質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定動(dòng)物源性食品中20種頭孢菌素的可行性，從當(dāng)?shù)厥袌錾喜杉?6個(gè)豬肉樣品、38個(gè)牛肉樣品、43個(gè)雞肉樣品和26個(gè)魚肉樣品，以本實(shí)驗(yàn)建立的檢測方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在2個(gè)

魚肉樣品中檢出頭孢匹林，含量分別為7.3和12.1 μg/kg，不符合現(xiàn)有對(duì)食品中頭孢菌素殘留的規(guī)定，未檢出其它頭孢菌素，出現(xiàn)這個(gè)結(jié)果可能是由于養(yǎng)殖魚類的過程中使用了頭孢匹林，或者魚類生活的水體被污染了。

3 討論與結(jié)論

本文以甲醇作為提取溶劑，以C18吸附劑作為凈化材料用于動(dòng)物源性食品的前處理，結(jié)合同位素質(zhì)譜法分析檢測了20種頭孢菌素，并對(duì)前處理和儀器參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終，建立了同位素質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定動(dòng)物源性食品中20種頭孢菌素的方法，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，本文所建立檢測方法的線性方程、準(zhǔn)確度、精密度和檢出限等參數(shù)都滿足檢測需求，在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果較好。表明該檢測方法是準(zhǔn)確可靠、簡便的，可用于日常對(duì)動(dòng)物源性食品中的頭孢菌素的監(jiān)測分析。由于目前國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》僅對(duì)3種頭孢菌素類（頭孢氨芐、頭孢喹肟、頭孢噻呋）在牛、豬等食品中的最大殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，本文對(duì)其它類型的頭孢菌素也進(jìn)行檢測分析，并擴(kuò)展到其它類型的樣品（雞肉、魚肉），對(duì)進(jìn)一步了解市場上動(dòng)物源性食品中頭孢菌素的殘留情況具有現(xiàn)實(shí)意義，受同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類限制，部分化合物使用同位素內(nèi)標(biāo)的回收率還有待提高，今后如果有更多的同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以選擇，會(huì)更加完善此法的效果。