梁曉云，趙王晨，張 晨，王曦琦，王思亓，宓曉雨，王龍鳳

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210023）

藍莓（Vacciniumspp.）屬杜鵑花科越橘屬植物，因其豐富的營養(yǎng)成分備受消費者歡迎。 藍莓果實含有大量維生素、類黃酮、酚酸和花青素等生物活性化合物，有助于預(yù)防心血管疾病、癌癥、炎癥和其他慢性病的發(fā)生[1-2]。然而，藍莓果肉多汁，果皮柔軟，在貯藏過程中極易受到機械損傷和微生物侵襲，從而引起炭疽病、灰霉病等一系列生理病害[3]，導(dǎo)致藍莓品質(zhì)下降，造成不可挽回的經(jīng)濟損失。因此，開發(fā)安全高效的藍莓保鮮技術(shù)成為目前亟待解決的問題。目前，藍莓的主要保鮮方法有低溫貯藏、氣調(diào)保鮮、輻照處理和涂膜處理和活性包裝等。近年來，活性包裝因具有良好的可降解性、氣體阻隔性、光線防護、抗氧化活性和抗菌活性被廣泛研究[4]。

殼聚糖（chitosan）是通過甲殼素脫乙酰化獲得的一種天然多糖，因其生物相容性、抗菌活性、抗氧化性和成膜特性成為塑料基包裝材料的理想替代品[5]。然而，較差的熱穩(wěn)定性和機械性能限制了殼聚糖在食品包裝材料中的廣泛應(yīng)用。近年來，由于納米技術(shù)的飛速發(fā)展，基于殼聚糖的活性納米復(fù)合材料為殼聚糖基包裝材料的研究開拓了新的方向[6]。納米材料的引入增加了殼聚糖的機械性能、熱穩(wěn)定性、水蒸氣/氣體阻隔性能以及活性功能，且不影響其降解特性[7]。Xing等[8]表示殼聚糖納米TiO2復(fù)合涂層可以增強藍莓營養(yǎng)成分的維持。Sun等[9]將人參渣多糖與殼聚糖共混制成抗菌復(fù)合膜，用以延長鮮切甜瓜等的貨架期。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中的重要生物活性成分，具有良好的抗氧化、抗菌和抗腫瘤功效，有望被廣泛應(yīng)用于食品加工[10]和制備果蔬保鮮活性包裝材料。然而，EGCG在高溫、中性或弱堿等條件下易發(fā)生氧化導(dǎo)致失活，極大降低了它的加工利用率[11]。利用納米技術(shù)將EGCG與其他納米結(jié)構(gòu)相結(jié)合，可有效提高其熱穩(wěn)定性，使之在熱環(huán)境下保持良好的抗氧化及抗菌活性[12]。納米黑色素（melanin nanoparticles，MNPs）是一類天然聚合物，存在于各種動植物和微生物體中，研究證實MNPs有突出的自由基清除、金屬離子螯合等特性[13]。同時，MNPs能夠增強多種生物基（殼聚糖[14]、明膠[15]、卡拉膠[15]、瓊脂[16]）包裝薄膜材料的性能。最新研究發(fā)現(xiàn)，黑色素能夠通過ππ堆積和/或氫鍵相互作用與各種具有芳香結(jié)構(gòu)的活性物質(zhì)結(jié)合，其作為納米載體被有效的應(yīng)用于構(gòu)造活性物質(zhì)的遞送系統(tǒng)[17]。因此，本研究合成黑色素納米顆粒作為EGCG的納米載體，獲得一種新型納米復(fù)合材料EGCG@MNPs，以提高EGCG的穩(wěn)定性和利用效率；并將復(fù)合納米粒子摻入殼聚糖基質(zhì)，通過流延法制備殼聚糖基納米復(fù)合薄膜；通過包裝形式，研究其對低溫和常溫貯藏期間藍莓果實品質(zhì)的影響，以期找到一種新的延長藍莓貨架期的保鮮方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試藍莓 于2021年8月17日采購自江蘇省南京市某農(nóng)產(chǎn)品集散中心，果實于當天采摘后保存于4 ℃環(huán)境下運回實驗室，挑取大小均勻、成熟度一致、無病蟲害和機械損傷的藍莓果實備用；殼聚糖（脫乙酰度80%～95%）、冰醋酸（純度≥99.5%）、甘油（純度≥99%）、磷酸二氫鈉（純度≥99%）、磷酸氫二鈉（純度≥99%）、過硫酸鉀（純度≥99%）、甲醇（純度≥99%） 國藥（上海）集團化學(xué)試劑有限公司；沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS） 源葉生物科技有限公司；鹽酸多巴胺（純度≥99%） 阿達瑪斯試劑有限公司；LB瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA） 北京陸橋科技有限公司。

CR-10 Plus色差儀 柯尼卡美能（中國）有限公司；SYS-GH30A果蔬呼吸測定儀 遼寧塞亞斯科技有限公司；GY-4水果硬度計 北京沃威科級有限公司；Pico-21高速冷凍離心機 德國Thermo Fisher公司；SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV759紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；ZHTE-48多樣品組織研磨儀 南京卓恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EGCG@MNPs復(fù)合納米粒子的制備 EGCG@MNPs納米粒子按照實驗室之前報道的方法制備[12]。將500 mg鹽酸多巴胺溶于50 mL去離子水中，以500 r/min的轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌，直至鹽酸多巴胺完全溶解，然后滴入1.5 mL 1 mol/L NaOH，并緩慢加入50 mL的1 mg/mL EGCG溶液，在25 ℃下連續(xù)攪拌24 h。所得到的納米懸濁液于15000 r/min下離心15 min，洗滌三次，獲得EGCG@MNPs沉淀。將沉淀冷凍干燥48 h，得到EGCG@MNPs納米粒子，并保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合膜的制備采用流延法制備殼聚糖膜與EGCG@MNPs納米復(fù)合膜。首先，將40 mg EGCG@MNPs超聲分散于150 mL 1%乙酸溶液中。將甘油（30 wt%殼聚糖）作為增塑劑加入溶液中，不斷攪拌，然后將4 g殼聚糖粉末溶解到溶液中，在90 ℃下持續(xù)攪拌30 min。然后將成膜液澆鑄在聚四氟乙烯模具（21 cm×30 cm×0.5 cm）上，室溫下干燥48 h后將薄膜從模具表面剝離，在25 ℃和50% RH條件下放置至少72 h，以達到穩(wěn)定狀態(tài)。所有薄膜樣品一式三份。同時，在相同條件下制備不含EGCG@MNPs納米粒子的純殼聚糖膜。

1.2.3 藍莓包裝及貯藏流程 使用熱封機將裁剪后的殼聚糖薄膜進行熱封，制成三面封口的保鮮袋（10 cm×15 cm），其中一口留作藍莓的填充口，在藍莓填充完成后進行熱封。將藍莓置于無菌操作臺內(nèi)，隨機選取成熟度一致、無損傷蟲害的健康藍莓，將藍莓稱重后分別裝入殼聚糖包裝和殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合包裝，每袋裝入60 g左右藍莓，并準確記錄好袋中藍莓的初始重量，每個包裝袋分別做三個平行。包裝完成后，將樣品放置于有孔PET透明盒中，分別置于25和4 ℃下進行貯藏，未進行膜包裝處理的藍莓作為對照。25 ℃貯藏藍莓每隔2 d取樣測定各項指標，4 ℃貯藏藍莓每隔4 d取樣測定各項指標。并從各處理組隨機選取部分藍莓果實分別用液氮速凍，置于-80 ℃環(huán)境中儲存用于后續(xù)其它生理指標測定。分別將對照組、純殼聚糖膜組和殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合膜組簡稱為C、CH和CHEM。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 失重率 通過貯藏前后的質(zhì)量差來計算藍莓果實失重率[18]，失重率計算公式如下。

1.2.4.2 腐爛率 果實出現(xiàn)明顯綿軟、破損、流汁和霉變的被確定為腐敗果。藍莓的腐爛率由式（2）確定。

1.2.4.3 呼吸強度 使用果蔬呼吸測定儀來測量果實的呼吸強度，將50 g藍莓果實置于200 mL密封容器中，在同一溫度和濕度下進行測量，并保持測量環(huán)境氣流穩(wěn)定。以CO2產(chǎn)生量表示藍莓果實的呼吸強度，單位為CO2mg/kg·h。

1.2.4.4 表觀品質(zhì)和顏色指標 使用高清相機記錄各貯藏天數(shù)樣品的表觀品質(zhì)。使用手持式色差儀測定藍莓果實的各項顏色指標L*、a*、b*值，其中L*代表亮度、a*代表紅綠色調(diào)、b*代表藍黃色調(diào)，并計算藍莓褐變指數(shù)[19]，計算見式（3）。

1.2.4.5 硬度 采用手持式果實硬度計測定藍莓果實的硬度。將藍莓果實平穩(wěn)放置于測試臺上，硬度計垂直勻速向下刺入藍莓表皮，并將硬度計調(diào)成Autopeak模式，自動記錄峰值。隨機選取十顆藍莓果實進行測量并取平均值，單位為N。

1.2.4.6 微生物指標 參考Yang等[20]的方法測定貯藏藍莓的微生物指標，并稍作修改。將10 g藍莓果肉置于無菌均質(zhì)袋中，加入90 mL的0.9%無菌生理鹽水，并使用拍打均質(zhì)機將均質(zhì)袋正反面拍打均勻。將混合溶液進行梯度稀釋（10-1～10-6），吸取100 μL稀釋液均勻涂抹在LB瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （PDA） 平板上，然后分別在 37和28 ℃下培養(yǎng)以觀察細菌和真菌的數(shù)量。微生物計數(shù)的單位表示為lg CFU/g。

1.2.4.7 pH和可溶性固形物（TSS） 將液氮預(yù)凍的藍莓樣品放入組織研磨儀，取5 g研磨樣品，加入15 mL去離子水，10000 r/min、 4 ℃冷凍離心20 min。使用pH計測量上清液，記錄藍莓果實的pH。采用手持式糖度計測定可溶性固形物含量。將上清夜滴于糖度計棱鏡玻璃面上，取3次讀數(shù)平均值[21]。

1.2.4.8 多酚氧化酶和過氧化物酶活力的測定 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活力參考鄒小波等[19]的方法略作修改。

PPO：準確稱取2.5 g研磨樣品，加入5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS, pH6.5），10000 r/min、4 ℃冷凍離心20 min，提取上清液。取50 μL上清液，加入1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚溶液和1.95 mL 0.2 mol/L PBS溶液 （pH6.5），搖勻后迅速放于紫外-可見分光光度計內(nèi)，記錄反應(yīng)體系在420 nm處5 min內(nèi)吸光度的變化，每20 s記錄一次。以每克樣品每分鐘吸光度變化值增加1為一個活力單位（U）。對照用蒸餾水代替上清液。

POD：取50 μL與PPO相同處理的上清液，加入0.15 mL 10 g/L愈創(chuàng)木酚、 0.15 mL 過氧化氫（體積分數(shù)1%）、2.66 mL PBS溶液（pH6.5）。搖勻后迅速放于紫外-可見分光光度計內(nèi)，記錄反應(yīng)體系在470 nm處5 min內(nèi)吸光度的變化，每20 s記錄一次。以每克樣品每分鐘吸光度變化值增加1為一個活力單位（U）。對照用蒸餾水代替上清液。

1.2.4.9 藍莓花色苷含量測定 使用pH差法測定藍莓果實的花色苷含量[22]。準確稱取5 g藍莓研磨樣品，加入10 mL酸化甲醇（0.1% HCl），搖勻后4 ℃避光放置2 h。然后15000 r/min冷凍離心10 min，提取上清液備用。吸取0.2 mL藍莓上清液分別用醋酸鈉緩沖液（pH4.5）或氯化鉀緩沖液（pH1.0）稀釋，混合搖勻后于28 ℃放置5 min，使用紫外-可見分光光度計分別于500和700 nm處測定吸光度，對照用蒸餾水代替藍莓上清液。將花色苷含量表示為每100 g樣品矢車菊素-3-葡萄糖苷當量（mg/100 g），計算見公式（4）。

式中：A =(A500-A700)pH1.0-(A500-A700)pH4.5；MW表示矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2）；DF表示稀釋倍數(shù)；V表示樣液體積，mL；m表示樣品質(zhì)量，g；ε=26900 L/（mol·cm）；d表示比色皿厚度，1 cm。

1.2.4.10 藍莓抗氧化活性的測定 使用DPPH自由基清除法[23]測量藍莓提取物的總抗氧化活性。吸取1.2.4.9節(jié)上清液0.2 mL與3 mL DPPH甲醇溶液混合搖勻，在室溫避光條件下放置30 min。對照用0.2 mL甲醇溶液代替上清液。在517 nm處測定混合液的吸光度，并按照式（5）計算提取液的DPPH自由基清除率。

式中：A0表示對照樣品的吸光度；A1表示所測樣品的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

最終數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)記錄處理，用SPSS 16.0進行方差分析和差異顯著性分析，P＜0.05表示差異性顯著。用Origin 8對數(shù)據(jù)進行擬合并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓失重率和腐爛率的影響

失重率是反映藍莓貯藏品質(zhì)的重要指標之一。由于藍莓采后的呼吸作用和蒸騰作用，導(dǎo)致藍莓的養(yǎng)分消耗和水分流失，從而造成藍莓的質(zhì)量損失[24]。失重的主要表現(xiàn)是果實皺縮和變質(zhì)，由圖1A和圖1B可知，隨著貯藏時間的增加，各處理組藍莓樣品的失重率不斷增加。4 ℃貯藏藍莓比25 ℃貯藏藍莓有更低的失重率，且上升幅度更平緩，主要因為藍莓在低溫環(huán)境中減緩了呼吸作用和蒸騰作用，從而減少水分流失。除此之外，CH-EM組在貯藏期間的失重率顯著低于C和CH組（P＜0.05）。在貯藏結(jié)束時，4和25 ℃經(jīng)納米復(fù)合包裝處理的貯藏藍莓的失重率分別比對照組低0.9%和8.1%。本實驗結(jié)果與Eldib等[25]的結(jié)果類似，他們將含有殼聚糖薄膜涂層的納米材料分別與乳鏈菌肽和二氧化硅粒子結(jié)合，涂層處理有效地控制了藍莓的失重率，可以有效保持新鮮藍莓的質(zhì)量。由此說明，納米復(fù)合包裝能夠為藍莓提供良好的屏障，可以作為果實貯藏過程中水分損失的保護層，這是因為具有微孔結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合薄膜用于藍莓包裝，可以減少氧氣和二氧化碳等氣體交換，同時防止水分子從果實表面快速流失，并一定程度上減緩了呼吸作用，使體內(nèi)有機物質(zhì)消耗減少，有效減輕了藍莓在貯藏過程中的重量損失。藍莓的果實腐爛通常是由于機械損傷和真菌引起的。由圖1C和圖1D可知，各溫度貯藏藍莓的腐爛率變化表現(xiàn)了和失重率相同的趨勢。各處理組藍莓的腐爛率隨著貯藏時間的增加而增加，且4 ℃貯藏藍莓在各階段的腐爛率均低于25 ℃貯藏藍莓。經(jīng)包裝處理的藍莓比對照組有著更低的腐爛率（P＜0.05），在4 ℃環(huán)境下貯藏12 d后，CH組和CHEM組的失重率比對照組分別低4.8%和8.4%，且在貯藏后期，CH-EM組的失重率幾乎趨于平緩，而常溫貯藏藍莓則仍然有上升趨勢。包裝組的腐爛率較低是由于薄膜自身出色的吸濕性能，它能及時吸收藍莓貯藏過程中產(chǎn)生的水蒸氣，使包裝內(nèi)保持干燥，防止腐敗菌生長[24]。除此之外，殼聚糖和EGCG@MNPs出色的抗菌性能也有效抑制了環(huán)境中有害微生物的生長[12]，從而控制了藍莓果實的腐敗。

圖1 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓失重率和腐爛率的影響Fig.1 Effects of nanocomposite packaging on weight loss and decay rate of blueberries during storage

2.2 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓呼吸強度和硬度的影響

藍莓屬于呼吸越變型水果，在采后仍然能進行呼吸作用，呼吸強度能夠反映出藍莓果實的衰老程度[26]。由圖2A所示，4 ℃環(huán)境下的各處理組藍莓呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，從第4 d開始，CH組和CH-EM組的呼吸強度變化趨于平穩(wěn)，而C組藍莓則在第8 d時出現(xiàn)呼吸高峰，且包裝處理的藍莓呼吸強度顯著低于對照組（P＜0.05），在貯藏結(jié)束時，CH組和CH-EM組的呼吸強度分別比對照組低15.7%和27.0%。說明納米復(fù)合包裝處理能夠有效抑制藍莓的呼吸強度，且延緩了果實呼吸高峰的出現(xiàn)。而25 ℃貯藏藍莓的CH組和CH-EM組則表現(xiàn)了與對照組相同的變化趨勢（圖2B），同樣，包裝組藍莓果實有著更低的呼吸強度。在第6 d時，由于常溫貯藏藍莓的高腐敗率，導(dǎo)致藍莓呼吸強度呈上升趨勢。呂靜祎等[26]發(fā)現(xiàn)將殼聚糖-山竹果皮提取液復(fù)合涂膜處理藍莓后，藍莓的呼吸強度被有效地抑制，本實驗也得到了類似的實驗結(jié)果。由此可知，低溫結(jié)合納米復(fù)合包裝是藍莓果實一種有效的保鮮方法。

作為質(zhì)地較柔軟的水果，硬度是藍莓果實最重要的質(zhì)量指標之一，它直接影響到果實的品質(zhì)以及商業(yè)價值。藍莓硬度下降主要是由于水分流失、果實腐敗、細胞壁崩解、膨壓和膜損傷所引起。其中，細胞壁和中層多糖（果膠、半纖維素和纖維素）代謝被認為是導(dǎo)致藍莓果實軟化的首要因素[27]。由圖2C和圖2D可知，隨著貯藏天數(shù)的增加，各藍莓處理組的硬度呈整體下降趨勢。相較于常溫貯藏藍莓，冷藏貯藏藍莓的下降趨勢更趨于平緩，且在貯藏結(jié)束時，4 ℃貯藏藍莓各組硬度均能保持在2.4 N以上，而25 ℃貯藏藍莓則在第6 d時各組藍莓硬度就均處于2.4 N以下。除此之外，復(fù)合納米包裝處理也延緩了藍莓果實硬度的下降。由于EGCG@MNPs納米粒子的加入，提高了殼聚糖-EGCG@MNPs薄膜的水蒸氣阻隔性能，所以在貯藏期間，納米復(fù)合包裝有效阻止了藍莓水分流失和環(huán)境中微生物的繁殖，同時降低了藍莓的代謝活性，這是維持藍莓果實飽滿度和硬度的關(guān)鍵。這與汪東風(fēng)等[28]通過殼聚糖復(fù)合膜處理藍莓的結(jié)果一致。

圖2 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓呼吸強度和硬度的影響Fig.2 Effects of nanocomposite packaging on respiration rate and hardness of blueberries during storage

2.3 納米復(fù)合包裝對藍莓貯藏期間微生物生長的影響

藍莓采后會受到一些細菌如鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌和單核細胞增生李斯特菌的侵染，藍莓果實受真菌如灰霉病菌、鏈格孢菌和炭疽菌等感染后還會引起灰霉病、果實腐爛病和炭疽病等病害[3]。圖3A和圖3B分別顯示了藍莓在冷藏和常溫貯藏環(huán)境下細菌的生長情況，所有處理組均呈現(xiàn)了上升的趨勢。在冷藏藍莓貯藏初期，各組細菌菌落總數(shù)差異較小，在貯藏4 d后包裝處理藍莓的細菌菌落總數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05），且菌落總數(shù)增加緩慢，在第12 d，對照組的細菌菌落總數(shù)為5.01 lg CFU/g，而CH組和CH-EM組分別為3.92和3.58 lg CFU/g。與冷藏藍莓相比，常溫貯藏藍莓CH組和CH-EM組在貯藏后期仍有較大幅度的上升趨勢，但CH-EM組的細菌菌落總數(shù)要顯著低于其他組（P＜0.05）。圖3C和圖3D分別顯示了藍莓在冷藏和常溫貯藏環(huán)境下真菌的生長情況，所有樣品的真菌菌落總數(shù)均呈現(xiàn)了先下降后上升的趨勢，同樣的，常溫貯藏4 d后的真菌菌落總數(shù)的上升幅度顯著高于冷藏藍莓（P＜0.05）。在貯藏結(jié)束時，CH-EM組在冷藏和常溫下的真菌菌落總數(shù)分別比對照組低27.9%和18.7%。

圖3 納米復(fù)合包裝對藍莓貯藏期間微生物生長的影響Fig.3 Effects of nanocomposite packaging on microbial growth of blueberries during storage

實驗結(jié)果表明，殼聚糖包裝和納米復(fù)合包裝能顯著抑制藍莓在貯藏期間的微生物生長，延緩了藍莓的腐敗，有效延長了食品的保質(zhì)期。這歸因于殼聚糖和EGCG@MNPs出色的抗菌性能。曹森等[29]采用丁香提取液結(jié)合殼聚糖處理能夠顯著抑制藍莓采后真菌菌落總數(shù)上升，降低了果實的腐爛率。在實驗室之前的研究中，已經(jīng)證明了EGCG@MNPs具有優(yōu)越的抗菌性能，其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別僅為0.8和0.2 mg/mL[12]。EGCG@MNPs納米粒子的加入有效提高了殼聚糖薄膜的抗菌活性。綜上所述，殼聚糖/ EGCG@MNPs納米復(fù)合膜是藍莓的一種有效抗菌保鮮包裝材料。

2.4 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓顏色的影響

顏色是藍莓果實新鮮度最重要的指標之一，顏色的變化直接反應(yīng)出藍莓果實的品質(zhì)以及商業(yè)價值[30]。L*值主要體現(xiàn)藍莓果實的亮度，L*值越大表示果實越有光澤。由圖4A和圖4B可知，貯藏期間藍莓果實的亮度呈下降的趨勢，冷藏藍莓亮度的下降趨勢相較于常溫藍莓較為平緩，且貯藏期間CH-EM組藍莓L*值始終高于其余組。a*值代表了果實的紅綠程度，a*值越大表示果實色澤越紅，反之則色澤越綠。如圖4C和圖4D所示，在4 ℃ 環(huán)境下CHEM組的a*值在貯藏期間維持著較穩(wěn)定的狀態(tài)，對照組和CH組則有著不同幅度的變化，但總體來說變化不大，貯藏結(jié)束時對照組和CH組a*值相較于貯藏前分別提高了0.35和0.05。常溫貯藏藍莓的a*值則呈現(xiàn)總體上升的趨勢，在貯藏期間，對照組的a*值顯著高于處理組（P＜0.05），而包裝組之間則沒有顯著性差異（P＞0.05），且上升幅度平緩。b*值表示了果實的黃藍度，b*值越表示果實色澤越黃，反之則色澤越藍。如圖4E和圖4F所示，各樣品組的b*值均有不同程度的提升。冷藏藍莓的CH組在貯藏前期的b*值提升較大，但在貯藏后期，CH組和CH-EM組的b*值均顯著低于對照組（P＜0.05）。而常溫貯藏藍莓b*值上升幅度較大，貯藏結(jié)束時，C組、CH組和CH-EM組的b*值相較于貯藏分別提高了5.02、3.12和2.05。

圖4 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓顏色的影響Fig.4 Effects of nanocomposite packaging on the color of blueberries during storage

褐變指數(shù)綜合體現(xiàn)了果實色澤變化。如圖4G和圖4H所示，各樣品組的褐變指數(shù)總體上均表現(xiàn)出了上升的趨勢。在貯藏前期，冷藏藍莓的CH組褐變指數(shù)上升速度顯著高于對照組和CH-EM組（P＜0.05），這可能是由于純殼聚糖薄膜較高的水蒸氣透過率加速了包裝環(huán)境中氧氣與水蒸氣的交換[31]，這促進了藍莓的氧化褐變，從而導(dǎo)致CH組包裝藍莓的褐變指數(shù)在前期高于對照組，但在貯藏后期CH和CH-EM組則均趨于平緩，而對照組仍有上升趨勢。在常溫貯藏期間，納米復(fù)合包裝藍莓的褐變指數(shù)上升速度則顯著低于對照組和殼聚糖包裝組（P＜0.05）。綜上所述，CH組和CH-EM組能夠有效地保持藍莓的顏色特性。這可能是由于包裝阻止了藍莓果實與空氣的接觸，從而減少了褐變[19]。此外，藍莓中的花青素作為一種色素可以攜帶殼聚糖作為一種正電荷來幫助維持藍莓的顏色[32]。

2.5 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓pH和TSS的影響

圖5A和圖5B展示了藍莓在貯藏期間pH的變化，所有藍莓樣品的pH均呈現(xiàn)了上升的趨勢。在冷藏條件下，藍莓的pH上升緩慢，且包裝組之間無顯著性差異（P＞0.05）。在常溫貯藏前期，對照組pH的上升速度則顯著高于包裝組（P＜0.05），貯藏結(jié)束時，對照組、CH組和CH-EM組的pH由貯藏前的3.23分別上升到了3.64、3.52和3.41。藍莓果實在貯藏期間pH的上升可能是由于采后代謝反應(yīng)的繼續(xù)發(fā)生，導(dǎo)致果實中的酸被轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)[33]。

圖5 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓pH和TSS的影響Fig.5 Effects of nanocomposite packaging on pH and TSS of blueberries during storage

可溶性固形物是反映果實的成熟程度和品質(zhì)的重要指標之一，TSS值越高，則果實口感越好[34]。如圖5C和圖5D所示，隨著貯藏時間的增加，兩種貯藏溫度下的貯藏藍莓的TSS值均呈下降的趨勢。如圖所示，CH-EM組的TSS含量下降速度顯著慢于對照組和CH組（P＜0.05）。在貯藏結(jié)束時，冷藏CHEM組的TSS含量分別是對照組和CH組的1.17和1.05倍，常溫CH-EM組的TSS含量則分別是對照組和CH組的1.09和1.05倍。藍莓貯藏過程中TSS含量的變化可能是由于呼吸消耗或者大分子碳水化合物部分水解為TSS引起的，低溫條件可以抑制藍莓的呼吸作用，還可以減少水分的流失[8]，可見低溫條件能夠更好的維持藍莓的TSS含量。CHEM組藍莓能夠保持較高TSS含量的原因可能是包裝薄膜對氣體的選擇性通過抑制了藍莓采后的呼吸強度，從而減少了呼吸底物的消耗[26]。此外，由于后期微生物對藍莓果實的侵蝕增加，也會導(dǎo)致TSS含量的下降[35]。

2.6 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓PPO和POD活性的影響

PPO是廣泛存在于植物體中的一種氧化酶，其活性與果蔬的褐變有著密切的關(guān)系，是果蔬品質(zhì)的重要指標之一[34]。如圖6A和圖6B所示，各處理組在貯藏前期呈現(xiàn)下降趨勢，在貯藏后期則呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，而對照組則呈現(xiàn)了波動性的變化趨勢，在貯藏結(jié)束時，常溫對照組PPO活性最高可達45.33 U·min-1·g-1，同時誘導(dǎo)酚類化合物的積累。在貯藏期間，CH-EM組藍莓PPO活性顯著低于其他組（P＜0.05），且在冷藏環(huán)境下表現(xiàn)了更低的PPO活性，冷藏結(jié)束時CH-EM組藍莓PPO活性低至16 U·min-1·g-1。這說明低溫配合納米復(fù)合包裝能夠更有效的抑制PPO活性的增加。2.4中褐變指數(shù)的結(jié)果也驗證了這一結(jié)論，貯藏期間藍莓PPO的活性變化與鄒小波等[19]研究的研究成果一致。

POD是存在于植物體中的一種重要的活性酶，其能夠與過氧化氫酶產(chǎn)生協(xié)同作用，將植物體中的H2O2分解成H2O和O2，從而減少活性氧自由基對細胞的傷害，其活性也與藍莓果實的成熟度有著密切的關(guān)系[36]。圖6C和圖6D顯示了貯藏期間藍莓果實POD活性的變化，冷藏藍莓的POD活性呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，而常溫藍莓則是展現(xiàn)了總體下降的趨勢。在貯藏后期，相較于其他組，CH-EM組的藍莓均表現(xiàn)了較高的POD活性。貯藏期結(jié)束時，冷藏藍莓對照組、CH組以及CH-EM組的POD活性分別比常溫組高了10.1、21.6和28.38 U·min-1·g-1。說明低溫環(huán)境更有利于維持藍莓的POD活性。貯藏后期藍莓POD活性的下降，主要是由于藍莓果實的衰老產(chǎn)生了過量的自由基抑制了POD的活性[37]。殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合包裝則延緩了果實的衰老，為提供了良好的抗氧化環(huán)境，且薄膜隔絕了部分氧氣，抑制了藍莓的氧化行為，有效維持了藍莓POD的活性。也有研究表明，隨著貯藏天數(shù)的逐漸增加，藍莓活性氧代謝失調(diào)導(dǎo)致H2O2積累，從而誘導(dǎo)了POD活性升高[18]。

圖6 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓PPO和POD活性的影響Fig.6 Effects of nano-composite packaging on PPO and POD activities of blueberries during storage

2.7 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓花色苷含量的影響

花色苷是存在于藍莓果皮中的的一種天然水溶性植物色素，其具有抗氧化、抗炎、改善視力和預(yù)防心血管疾病等多種生理活性功能，其含量是藍莓品質(zhì)重要的參考指標之一[38]。由圖7A和圖7B所示，在貯藏期間，藍莓花色苷含量呈現(xiàn)了先輕微上升后緩慢下降的趨勢。隨著貯藏時間的增加，包裝處理藍莓的花色苷含量的下降速度顯著低于對照組（P＜0.05）。在4 ℃貯藏12 d后，包裝組藍莓之間無顯著差異（P＞0.05），而常溫貯藏藍莓在第6 d后，CH-EM組藍莓花色苷含量則顯著高于其他組（P＜0.05）。在貯藏結(jié)束時，4和25 ℃環(huán)境下經(jīng)過納米復(fù)合包裝處理的藍莓花色苷含量分別保留了90.1%和99.0%，而對照組分別只有79%和86%。藍莓花色苷含量的下降主要是因為貯藏期間自由基的產(chǎn)生，使得花色苷作為抗氧化劑被消耗。而殼聚糖和EGCG@MNPs提供了優(yōu)良的抗氧化效果，延緩了花色苷的消耗，使藍莓果實能夠保持較高的花色苷含量水平。沈春華等[21]探討不同活性抗菌薄膜對藍莓低溫貯藏品質(zhì)的影響，結(jié)果表明含有精油的活性抗菌薄膜能延緩果實花色苷和VC含量的降低，與本研究花色苷含量變化趨勢相似。

圖7 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓花色苷含量的影響Fig.7 Effects of nanocomposite packaging on anthocyanin content in blueberries during storage

2.8 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓抗氧化活性的影響

藍莓的抗氧化活性是藍莓品質(zhì)最重要的參考指標之一，藍莓果實中含有豐富的抗壞血酸、花青素、酚類物質(zhì)等內(nèi)源性抗氧化劑，其抗氧化能力能夠反映藍莓果實自身對自由基的清除能力[2]。如圖8A和圖8B所示，各組藍莓對DPPH自由基的清除活性呈現(xiàn)了與花色苷含量類似的變化趨勢，在貯藏前期藍莓的DPPH自由基清除活性輕微上升，后期則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，且納米復(fù)合包裝處理的藍莓一直維持著較高的自由基清除水平。在貯藏結(jié)束時，4和25 ℃貯藏藍莓CH-EM組的DPPH自由基清除活性分別

比對照組高6.2%和6.3%，而包裝組之間則無顯著性差異（P＞0.05）。由此說明，包裝處理降低了藍莓的衰老速度，從而有效延緩了藍莓果實內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)的分解，使得藍莓保持了較高的營養(yǎng)水平和抗氧化能力。從呂靜祎等[26]的研究中觀察到了類似的藍莓DPPH自由基清除能力的變化趨勢。

2.9 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓表觀品質(zhì)的影響

水果的外觀是消費者判斷其質(zhì)量的主要因素，藍莓的表觀變化能夠在一定程度上直觀地反映出藍莓品質(zhì)的變化。圖9分別羅列了兩種貯藏條件下，各樣品組藍莓表觀品質(zhì)的變化。隨著貯藏天數(shù)的增加，與對照組相比，包裝組藍莓果實的霉變、皺縮和軟化現(xiàn)象明顯改善。在貯藏結(jié)束時，納米復(fù)合包裝藍莓仍然保持著較好的飽滿度以及色澤。說明殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合包裝是維持藍莓品質(zhì)的一種有效保鮮方式。

圖9 納米復(fù)合包裝對貯藏期間藍莓表觀品質(zhì)的影響Fig.9 Effect of nanocomposite packaging on apparent quality of blueberries during storage

3 結(jié)論

本研究以殼聚糖為包裝薄膜基質(zhì)，添加EGCG@MNPs納米粒子作為活性填料制備成殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合薄膜，并以包裝形式探討納米復(fù)合薄膜對低溫和常溫貯藏藍莓品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，殼聚糖包裝減少了藍莓的腐爛率和失重率，延緩了硬度、POD活性以及花色苷含量的下降，并有效維持了藍莓果實的顏色水平和抗氧化能力。EGCG@MNPs納米粒子的加入為包裝環(huán)境提供了更優(yōu)越的抗菌和抗氧化水平，減少了微生物對藍莓果實的侵襲，同時有效地降低了體內(nèi)自由基的積累速率，減少了活性物質(zhì)的消耗，在藍莓貯藏后期維持了較高的POD活性和花色苷含量。而且薄膜對氣體的阻隔作用顯著抑制了藍莓果實采后的呼吸作用，減少了因呼吸導(dǎo)致的營養(yǎng)物質(zhì)消耗和水分散失，同時也延緩了果實褐變的發(fā)生。納米復(fù)合包裝在抑制藍莓呼吸強度、果實褐變、改善生理代謝以及維持果實表觀品質(zhì)方面表現(xiàn)出了更優(yōu)秀的水平。與此同時，相較于常溫貯藏環(huán)境，冷藏環(huán)境更有利于保持藍莓果實的貯藏品質(zhì)，延長采后藍莓的保質(zhì)期。

綜上分析，殼聚糖/EGCG@MNPs納米復(fù)合裝結(jié)合低溫是維持采后藍莓品質(zhì)的最佳貯藏方式，并在果蔬保鮮方面具有廣闊的應(yīng)用前景。