關(guān)玉婷，陳瑞瑞, ，蔡如玉，范 蓓，孫 晶，張 瑞，張紫陽，常世敏,

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產(chǎn)物與功能食品開發(fā)重點實驗室，河北邯鄲 056038；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

茄（Solanum melongenaL.）為茄科，茄屬植物，在我國廣泛種植，是一種高產(chǎn)作物，茄子的不同部位，如皮、肉和葉子，都含有豐富的生物活性物質(zhì)，如類黃酮和酚類化合物。然而茄皮通常被當(dāng)做垃圾進(jìn)行處理，造成嚴(yán)重的環(huán)境問題和經(jīng)濟(jì)浪費[1]。茄皮作為一種副產(chǎn)品，含有豐富的酚類化合物，具有顯著的抗氧化[2]、降血糖[3]和抑菌[4]等作用。將茄皮中的多酚進(jìn)行提取，可提升茄子的附加值并降低環(huán)境壓力。

Ⅱ型糖尿病是常見的代謝性疾病，對全球人民健康造成了巨大的威脅。國際糖尿病聯(lián)合會公布2019年有4.63億人（占全球人口的9.3%）患有糖尿病[5]。Ⅱ型糖尿病是由多種因素引起的代謝紊亂性疾病，例如遺傳、生活習(xí)慣和環(huán)境等，其特征是缺乏胰島素或胰島素水平較低，導(dǎo)致血糖水平異常升高[6]。臨床治療Ⅱ型糖尿病常選用阿卡波糖或二甲雙胍等藥物，但患者會出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等癥狀[7]，因此選用天然產(chǎn)物調(diào)控血糖水平具有重要意義。趙艷威等[8]研究表明蘋果多酚可通過抑制α-葡糖苷酶活性降低糖尿病大鼠的血糖。厲成玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)黑米多酚可有效刺激小鼠胰島素分泌，改善Ⅱ型糖尿病小鼠恢復(fù)趨于正常血糖水平。

本研究采用超聲輔助提取技術(shù)制備茄皮酚（EPP），以得率為指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，測定EPP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，評價其體外的降血糖作用，通過建立糖尿病小鼠模型，對EPP體內(nèi)降血糖活性進(jìn)行研究，既提升了茄皮的綜合利用率，又為治療Ⅱ型糖尿病提供了新的原料和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明小鼠 實驗動物飼養(yǎng)于北京市實驗動物研究中心，4周齡（18～20 g），動物許可證號為SYXK（京）2020-0038，實驗期間充分保證了實驗動物的各項福利；紫黑色茄子 表皮顏色均勻無蟲害，購于邯鄲市叢臺區(qū)美食林超市；硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；四氧嘧啶 美國Sigma公司；磷酸鉀、碳酸鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SB25-12DTD超聲波清洗器、SCIENTZ-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；BPG-9100BH高熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；AL204型精密電子天平 梅特勒-托利多公司；SIGMA3K15臺式冷凍離心機 曦瑪離心機（揚州）有限公司；UV-80005紫外分光光度計 上海方析儀器有限公司；ACCU-CHEK血糖測定儀 羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EPP提取 將新鮮無蟲害茄子進(jìn)行清洗，取茄皮置于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥5 h，干燥后的茄皮進(jìn)行粉碎并過100目篩。在裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中加入2.00 g干燥茄皮粉末，進(jìn)行超聲輔助提取，超聲功率為420 W，提取30 min，結(jié)束后，8500 r/min離心15 min，收集上清液，冷凍干燥，得到EPP，稱重并計算得率。

式中：Y為EPP得率，%；M1為EPP的質(zhì)量，g；M0為茄皮粉末的質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素實驗 以EPP的得率為指標(biāo)，提取時間為50 min，提取溫度為45 ℃，料液比為1:50 g/mL，探究最優(yōu)超聲功率（360、420、480、540、600 W）；以EPP的得率為指標(biāo)，提取時間為50 min，超聲功率為480 W，提取溫度為45 ℃，探究最優(yōu)料液比（1:40、1:45、1:50、1:55、1:60 g/mL）；以EPP的得率為指標(biāo)，提取時間為50 min，超聲功率為480 W，料液比為1:50 g/mL，探究最優(yōu)提取溫度（35、40、45、50、55 ℃）；以EPP的得率為指標(biāo)，超聲功率為480 W，提取溫度為45 ℃，料液比為1:50 g/mL，探究最優(yōu)提取時間（30、40、50、60、70 min）。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，以料液比、提取時間、超聲功率和提取溫度為因素，EPP得率為指標(biāo)，采用正交試驗L9（34）設(shè)計，對影響EPP得率的因素進(jìn)行優(yōu)化，見表1。

表1 正交試驗因素和水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 EPP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率測定 根據(jù)黃春躍等[10]的方法進(jìn)行調(diào)整，測定EPP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。用pH6.9，0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液分別配制2 mg/mL阿卡波糖溶液、0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液和0.2 mol/L的碳酸鈉溶液；配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的濃度EPP溶液備用。37 ℃孵育10 min后加入2.0 mL碳酸鈉溶液，反應(yīng)終止后在405 nm處測定吸光值，α-葡萄糖苷酶溶液+EPP溶液吸光值記為OD1，EPP溶液吸光值記為OD2，α-葡萄糖苷酶溶液吸光值記為OD3，磷酸鹽緩沖溶液吸光值記為OD4，2 mg/mL阿卡波糖溶液為陽性對照。

α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式為：

1.2.5 建立糖尿病小鼠模型 所有實驗動物均飼養(yǎng)在北京市實驗動物研究中心SPF級動物房中，充分保證了實驗動物的福利，嚴(yán)格遵守了有關(guān)動物使用的道德規(guī)定。

隨機選120只健康4周齡雄性昆明小鼠，禁食16 h，注射四氧嘧啶180 mg/kg·bw，注射體積為0.01 mL/g，建立Ⅱ型糖尿病模型小鼠；同時給予普通飼料自由采食，禁食8 h，采尾血，測定空腹血糖值。糖尿病小鼠建模成功標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖值大于10 mmol/L（參照《保健食品功能檢驗與評價方法（2020年版）》）。

1.2.6 降血糖試驗 隨機選取10只健康小鼠作為空白組，選取50只建模成功的小鼠，分為5組（n=10）：空白組（等體積無菌水），陽性對照組（1 mg/kg·bw的阿卡波糖溶液），模型組（等體積無菌水），高劑量組（1.5 g/kg·bw的EPP溶液），中劑量組（0.5 g/kg·bw的EPP溶液），低劑量組（0.25 g/kg·bw的EPP溶液），灌胃體積為10 mL/kg，同時給予普通飼料自由采食，連續(xù)灌胃4周，禁食4 h，采尾血，測定空腹血糖值[11]。

式中：W表示血糖下降率，%；BG0表示EPP干預(yù)前血糖值，mmol/L；BG1表示EPP干預(yù)后血糖值，

mmol/L。

1.2.7 糖耐量試驗 小鼠試驗4周禁食4 h后進(jìn)行灌胃，20 min后每只小鼠灌胃葡萄糖溶液，劑量為2.0 g/kg·bw，分別測定灌胃后0、0.5、2 h的血糖值并記錄血糖曲線下面積[12]。

式中：S表示血糖曲線下的面積；A0表示0 h血糖值；A1表示0.5 h血糖值；A2表示2 h血糖值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性差異采用ANOVA，P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有極顯著差異，數(shù)據(jù)表示均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

各因素對EPP得率的影響如圖1所示，超聲功率對EPP得率的影響呈先上升后下降的趨勢，在480 W時，EPP得率最高達(dá)到39.21%，因過高的超聲功率會造成EPP中黃酮、多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)被氧化分解[13]，且過高的超聲會產(chǎn)生熱效應(yīng)[14]，改變原料結(jié)構(gòu)，降低了酚類物質(zhì)的溶出，降低了EPP的得率。

圖1 超聲功率、料液比、提取溫度和提取時間對EPP得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power, solid-liquid ratio, extraction temperature and extraction time on the yield of EPP

EPP的得率隨著料液比的變化呈先上升后下降的趨勢，在料液比為1:50 g/mL時得率達(dá)到最大，為42.51%。表明料液比為1:50 g/mL時已基本完成對EPP的提取，增加溶劑已無法提升得率，甚至可能會增加冷凍干燥的負(fù)荷[15]。故1:50 g/mL為提取EPP的最佳料液比。

EPP的得率隨著溫度的變化呈先上升后下降的趨勢，溫度在35～45 ℃時，EPP得率隨著溫度增加而增加，且提取溫度為45 ℃時，EPP得率高達(dá)41.2%；當(dāng)溫度高于45 ℃，EPP得率呈下降趨勢；過高的提取溫度導(dǎo)致EPP中的生物活性物質(zhì)被分解，且溶劑揮發(fā)導(dǎo)致樣液溶解度降低，從而降低了EPP的得率[16]，與胡棟寶等[17]的結(jié)果一致，利用適宜的提取溫度可加快酚類物質(zhì)溶出，同時需防止過高的提取溫度破壞已經(jīng)提取的多酚類物質(zhì)。

EPP的得率隨著提取時間的變化呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)提取時間小于50 min時EPP的得率隨提取時間的增加而升高；當(dāng)提取時間大于50 min時，EPP的得率隨提取時間的增加而降低，最優(yōu)提取時間50 min為，得率為40.11%，與劉靜等[18]研究結(jié)果一致，過長的提取時間會造成已溶出的EPP被氧化，導(dǎo)致EPP得率會隨著提取時間的增加呈現(xiàn)出下降的趨勢[19]。故提取EPP最佳超聲時間為50 min。

2.2 正交試驗結(jié)果

由表2、表3可知，影響EPP得率的順序依次為：提取溫度（C）＞提取時間（D）＞料液比（B）＞超聲功率（A），且提取EPP的最佳工藝是A3B2C3D2，即提取溫度50 ℃，提取時間50 min，料液比1:50 g/mL，超聲功率540 W。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

進(jìn)行了3次正交試驗結(jié)果驗證試驗，測的EPP得率為43.21%，確認(rèn)提取工藝最優(yōu)參數(shù)為A3B2C3D2。

2.3 EPP對α-葡萄糖苷酶活性的影響

α-葡萄糖苷酶是關(guān)鍵的消化酶，抑制α-葡萄糖苷酶可降低消化率從而緩解餐后血糖。對于Ⅱ型糖尿病的治療，可以利用抑制α-葡萄糖苷酶的活性從而抑制血糖水平的異常升高[20-22]。如圖2所示，不同濃度的EPP對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，EPP濃度在0.2～1 mg/mL時，抑制率與EPP濃度呈正相關(guān)，1 mg/mL EPP抑制率為45.46%。而常國立等[23]研究發(fā)現(xiàn)1 mg/mL楊梅核多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于90%且效果優(yōu)于同濃度阿卡波糖的抑制率，可能是由于提取的EPP未進(jìn)行純化，導(dǎo)致相同濃度時，EPP的抑制效果較差。

圖2 EPP對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Inhibition rate of α-glucosidase by EPP

2.4 EPP對糖尿病小鼠體重的影響

糖尿病小鼠體重通常會出現(xiàn)緩慢增長甚至降低的狀態(tài)。由表4可知，試驗前后，空白組小鼠的體重與其他試驗組均存在極顯著差異（P＜0.01），表明建立糖尿病小鼠模型成功；陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組給藥后體重均有所上升，但與模型組相比，均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；EPP三個劑量組之間及與陽性對照組也均無顯著差異（P＞0.05）。

表4 EPP對糖尿病小鼠體重的影響（g）Table 4 Effects of EPP on body weight of hyperglycemic mice (g)

2.5 EPP對糖尿病小鼠空腹血糖的影響

空腹血糖值可以反映出機體血糖代謝的狀況[24]。由圖3可知，試驗前，與空白組相比，糖尿病小鼠空腹血糖值均升高，具有極顯著差異（P＜0.01），且注射四氧嘧啶的小鼠各組間空腹血糖值無顯著差異（P＞0.05），表明糖尿病小鼠建模成功。經(jīng)4周灌胃后，與空白組相比，模型組和低、中、高劑量組血糖值均升高，存在極顯著差異（P＜0.01）；雖然低劑量組血糖值降低，但與模型組無顯著性差異（P＞0.05），中劑量組存在顯著差異（P＜0.05），陽性藥組及高劑量組血糖值明顯下降，存在極顯著差異（P＜0.01）；與陽性藥組相比，EPP干預(yù)的劑量組均存在極顯著的差異（P＜0.01），但血糖值均高于陽性藥組，表明EPP對降低空腹血糖水平有積極作用，但效果不及阿卡波糖治療效果，這可能是由于注射四氧嘧啶對小鼠胰島細(xì)胞造成了不可逆的損傷，EPP的干預(yù)僅能改善空腹血糖水平，而不能使其恢復(fù)至正常狀態(tài)[25]。

圖3 EPP對糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.3 Effects of EPP on fasting blood glucose in hyperglycemic mice

由血糖下降率可知，模型組、陽性藥組和EPP干預(yù)的三個劑量組血糖下降率均高于空白組，且存在極顯著差異（P＜0.01）；陽性藥和EPP干預(yù)均使之呈現(xiàn)出較高的血糖下降率，與模型組比，低劑量組存在顯著差異（P＜0.05），陽性藥組和中、高劑量組存在極顯著差異（P＜0.01）；EPP干預(yù)的三個劑量組血糖下降率均低于陽性藥物組，存在極顯著的差異（P＜0.01），結(jié)論與空腹血糖值相同，且高劑量的EPP干對糖尿病小鼠的空腹血糖值預(yù)有更好的治療效果。

2.6 EPP對小鼠糖耐量的影響

糖耐量可反映出機體對葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)能力。由圖4可知，給藥0.5 h時，除空白組外，所有小鼠的血糖值均達(dá)到最高水平；與陽性藥組相比，高劑量組0.5 h血糖值明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05）。給藥2 h后，灌胃葡萄糖溶液引起的血糖值波動基本消失；除空白組外其他實驗組血糖值仍較高，且與空白組相比存在極顯著差異（P＜0.01）；經(jīng)低、中劑量EPP灌胃小鼠的血糖值與模型組相比無顯著差異（P＞0.05），但經(jīng)高劑量EPP灌胃小鼠的血糖值與模型組相比存在顯著差異（P＜0.05）；與陽性藥物組相比，低、中、高劑量組血糖值降低效果較差，低劑量組存在極顯著差異（P＜0.01），中劑量組存在顯著差異（P＜0.05），且經(jīng)過EPP干預(yù)（如圖5），血糖曲線下面積極顯著降低（P＜0.01）。上述結(jié)論表明EPP的降血糖作用具有劑量依賴性，EPP能有效提升糖尿病小鼠的糖耐量，EPP可以改善糖尿病小鼠，降低小鼠機體葡萄糖的負(fù)荷，促進(jìn)代謝，有效降低血糖值，與趙艷威等[8]研究結(jié)果一致。

圖4 EPP對糖尿病小鼠糖耐量的影響Fig.4 Effects of EPP on glucose tolerance in hyperglycemic mice

圖5 EPP對糖尿病小鼠血糖曲線下面積的影響Fig.5 Effects of EPP on area under the blood glucose curve in hyperglycemic mice

3 結(jié)論

本研究對紫黑色茄皮以蒸餾水為提取劑進(jìn)行超聲輔助提取，研究優(yōu)化了EPP的提取工藝：最優(yōu)超聲功率為540 W，料液比為1:50 g/mL、提取溫度為50 ℃、提取時間為50 min，此條件下EPP的得率為43.21%。通過對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率確定EPP具有體外降血糖功效，1 mg/mL的EPP在體外對α-葡萄糖苷酶抑制率為45.46%。利用EPP對糖尿病小鼠進(jìn)行干預(yù)治療，通過測定小鼠的體重、空腹血糖值及糖耐量，確定了EPP不會使正常小鼠的血糖代謝異常；對糖尿病小鼠具有明顯的降血糖作用，且高劑量EPP具有更優(yōu)的降血糖效果。這表明EPP具有治療Ⅱ型糖尿病的潛力，且不會對正常的胰腺組織產(chǎn)生負(fù)面影響。但EPP的具體成分需進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究可提升茄皮的綜合利用價值，為降血糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供新的研究思路。

表5 EPP對糖尿病小鼠血糖下降率的影響Table 5 Effect of EPP on hypoglycemic rate in diabetic mice