孫伯祿 ，楊艷梅 ，楊 林 ，楊光瑞，唐道埔，萬靜雪，石紅霞

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州理工大學(xué)溫州泵閥工程研究院，甘肅蘭州 730000；2.蘭州中檢科測試技術(shù)有限公司，甘肅蘭州 730000）

酸奶作為牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成的產(chǎn)物，它具有口感細(xì)滑、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，深受人們的喜愛[1]。隨著人們收入的不斷增加，消費(fèi)者對酸奶市場的要求也不斷提高。然而，當(dāng)前酸奶市場品種單一，具有特色口味和功能的產(chǎn)品較少。因此，功能型的酸奶[2]出現(xiàn)在了大眾的視野當(dāng)中，與普通的酸奶相比， 功能型酸奶口味多樣、營養(yǎng)豐富， 適合更廣泛的消費(fèi)群體，所以功能型酸奶具有極高的研究價值。同時肉蓯蓉作為分布于我國西北干旱地區(qū)的列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物的根莖[3]，它具有補(bǔ)腎、改善便秘[4]和抗氧化[5]等功效。因此，近年來跟肉蓯蓉相關(guān)的藥食產(chǎn)品的開發(fā)深受研究者的廣泛關(guān)注。紅棗作為一種藥食兩用的鼠李科棗屬植物，它含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、多糖、維生素、核苷酸、黃酮類、有機(jī)酸和生物堿等，具有養(yǎng)血安神[6]、保護(hù)腸道[7]和清除自由基等[8]功效，其豐富的營養(yǎng)成分能同時滿足消費(fèi)者的需求，基于其所開發(fā)的各種食品、保健品等深受廣大消費(fèi)者的喜愛?？煞駥⑷馍惾?、紅棗以及酸奶三者有機(jī)的結(jié)合在一起，開發(fā)一款營養(yǎng)和口味俱佳，貼近消費(fèi)者群體，滿足消費(fèi)者需求的功能型復(fù)合酸奶。

近年來，隨著科技水平的不斷提高，人們對食品中各種功能的研究[9]也逐步加深，如抗癌、抗氧化、抗疲勞、抗衰老等。因此，在眾多功能型食品研制的過程中，抗氧化功能是人們研究的熱門內(nèi)容之一。研究抗氧化的方法[10]主要有活性氧自由基清除能力、基于氫原子轉(zhuǎn)移、基于電子轉(zhuǎn)移（SET）等方法，這些方法操作簡單、成本較低，但是它的準(zhǔn)確度較差、效率不高。因此亟待便捷、準(zhǔn)確、高效和低成本的技術(shù)，電化學(xué)生物傳感技術(shù)因其操作簡便、快速，分析成本低等特點(diǎn)[11]，已有將其用于中藥提取物抗氧化活性評價的研究[12]。然而鮮有將其用于食品功能性如抗氧化活性等的評價研究。

本文以肉蓯蓉、紅棗、酸奶為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面曲線分析優(yōu)化了復(fù)合酸奶的制備工藝。并利用構(gòu)建的DNA 電化學(xué)生物傳感器[13]，以電極表面DNA在含有VC、肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶或原味酸奶的Fenton 體系中的損傷程度為評價指標(biāo)，對復(fù)合酸奶功能之一的抗氧化活性進(jìn)行了評價[14]。該研究為該類產(chǎn)品的研發(fā)及地方特產(chǎn)的高值化開發(fā)利用，以及對同類產(chǎn)品的抗氧化性檢測，開拓了思路，提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅棗、蜂蜜、白砂糖、明膠、檸檬酸等 均為食品級，市售；新鮮肉蓯蓉 阿拉善盟蓉天下生物科技有限公司；純牛奶 君樂寶，市售；酸奶發(fā)酵劑，保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus）:嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）1:1 北京川秀科技有限公司；鯡精DNA 美國Sigma-Aldrich公司；六銨合釕Ru（NH3）6Cl3北京百靈威科技有限公司；氮參雜石墨烯，N-G 南京先豐納米材料科技有限公司；L-抗壞血酸 上海中秦化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖，CS 中國國藥有限公司。

Brookfield CT質(zhì)構(gòu)儀 保圣實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；JYZ-E91型號榨汁機(jī) 山東九陽小家有限公司；FA1004精密電子天平 瑞普儀器儀表有限公司；MB-530酶標(biāo)儀 上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；ERS2000-4均質(zhì)機(jī) 浙江恒岳儀器有限公司；HCSM-D滅菌機(jī) 昊利新科技發(fā)展有限公司；CHI 6041E型電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司，采用三電極體系，裸玻碳電極（GCE）或修飾電極為工作電極，鉑絲（Pt）電極為輔助電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸奶制備的工藝 原料制備→調(diào)配→均質(zhì)、殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→冷藏后熟→加紅棗汁→加肉蓯蓉汁→加蜂蜜→加白砂糖→灌裝→冷藏→成品

原料制備：分別挑選外形完整、新鮮、無腐爛的紅棗以及新鮮、無損壞的肉蓯蓉；將紅棗預(yù)煮10 min使其軟化后去核，將新鮮的肉蓯蓉洗凈、殺菌、切??；分別將紅棗和肉蓯蓉按照與水料液比1:5和1:4 g/mL打漿，過150目篩，取上清液，冷藏備用。同時對純牛奶進(jìn)行凈乳，將其冷卻至10 ℃以下保存。

調(diào)配：將穩(wěn)定劑以及輔料加入到牛奶中混合，加熱至60～70 ℃，并循環(huán)攪拌20 min。

均質(zhì)、殺菌：將混合好的料液進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)機(jī)壓力25 MPa，殺菌溫度為85 ℃，保持20 min。

冷卻、接種及發(fā)酵[15]：將殺菌后的料液冷卻至42 ℃，向冷卻好的料液中加入4%的發(fā)酵劑在45 ℃的條件下恒溫培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)后送入2～6 ℃的冷藏設(shè)施內(nèi)后熟24 h。

加入原料：將適當(dāng)比例的紅棗汁、肉蓯蓉汁與發(fā)酵乳混合并攪拌，混勻后繼續(xù)加入適當(dāng)比例的蜂蜜和白砂糖繼續(xù)攪拌混勻。

灌裝、冷藏：將制備好的酸奶灌裝入杯，嚴(yán)格檢查品質(zhì)及封合情況，立即送入4 ℃的冷藏設(shè)施內(nèi)進(jìn)行冷藏。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 通過參考盛潔[16]、王玉茜[17]等酸奶單因素實(shí)驗(yàn)的方法，以感官評分為指標(biāo)，確定各因素的適宜水平范圍。研究酸奶發(fā)酵劑添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）、紅棗汁添加量（10%、12%、14%、16%、18%、20%）、肉蓯蓉汁添加量（5%、6%、7%、8%、9%、10%）、白砂糖的添加量（4%、5%、6%、7%、8%、9%）、蜂蜜的添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）對肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶品質(zhì)的影響。采用控制變量法，考察某一因素時，其他條件固定為酸奶發(fā)酵劑的添加量為4%，紅棗汁的添加量為18%，肉蓯蓉汁的添加量為8%，蜂蜜的添加量為5%，白砂糖的添加量為7%。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，參考成堃[18]、李翔[19]等響應(yīng)面試驗(yàn)方法。選取對復(fù)合酸奶品質(zhì)影響較大的3個因素（紅棗汁添加量、肉蓯蓉汁添加量、蜂蜜添加量）作為考察對象，以復(fù)合酸奶的感官評價為響應(yīng)值，使用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，構(gòu)建模型，進(jìn)行擬合分析，從而獲得復(fù)合酸奶的最佳工藝條件，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平如表1 所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Response surface design factors and levels

1.2.4 產(chǎn)品的感官評價 選10 名專業(yè)的感官評價人員組成評定小組，進(jìn)行感官評價。根據(jù)酸奶的評價指標(biāo)（口感、組織狀態(tài)、氣味、色澤）對產(chǎn)品進(jìn)行評分。收集組內(nèi)成員的評定結(jié)果，取3次平均值作為感官評價的結(jié)果，感官評價標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 酸奶感官評定表Table 2 Sensory evaluation of yogurt

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 DNA/CS-N-G/GCE修飾電極的制備 參考孫伯祿等[20]的方法，首先將GCE分別在含有0.3和0.05 μm的拋光粉（Al2O3）的麂皮上反復(fù)打磨至光滑，然后將其分別放入甲醇和蒸餾水中各超聲10 min，將其拿出用蒸餾水沖洗表面，放到自然處晾干。在處理好的GCE 表面滴涂10 μL 1.0 mg/mL的CS-NG（0.2% CS：稱取殼聚糖0.2 g，用2%的醋酸定容至100 mL；將1 mg N-G與1 mL的0.2% CS，超聲2 h），在30 ℃紅外燈下進(jìn)行烤干，在表面形成一層薄膜。然后滴涂5 μL 1.5 mg/mL鯡精DNA溶液（取15 mg DNA，用二次蒸餾水定容至10 mL），4 ℃自然晾干。用pH7.0的PBS溶液洗去電極表面吸附不牢的DNA，得到DNA/CS-N-G/GCE。每修飾一層，采用循環(huán)伏安法[21]（CV），對修飾好的電極進(jìn)行測量，循環(huán)伏安法條件為：電壓范圍為-0.4～0.8 V；掃速100 mV/s。電解質(zhì)溶液為5 mmol/L [Fe（CN）6]3-/4-，0.1mol/L KCL溶液。

1.2.5.2 DNA氧化損傷的過程檢測 以Ru（NH3）63+為探針溶液（1.0 mmol/L 含50 mmol/L KCl）采用SWV（方波伏安法）對修飾好的DNA/CS-N-G/GCE電極進(jìn)行掃描（振幅為25 mV，掃描電壓范圍為-0.4～0.8 V）得到損傷前的電化學(xué)響應(yīng)[22]。將相同的電極打磨修飾，完成后放入含有抗氧化劑的Fenton試劑（pH7.0的PBS溶液，含1 mmol/L FeSO4和5 mmol/L H2O2）中室溫溫育30 min（抗氧化劑：L-抗壞血酸被Fenton溶液稀釋為1 mmol/L），拿出后用pH7.0的PBS溶液沖洗電極，再將其置入Ru（NH3）63+溶液中進(jìn)行SWV掃描，檢測對DNA損傷的抑制作用。同理，將再次修飾好的電極，放入Fenton試劑中室溫溫育30 min，將其取出后用pH7.0的PBS溶液沖洗電極，沖洗完后進(jìn)行掃描，得到損傷后的電化學(xué)響應(yīng)。

1.2.5.3 復(fù)合酸奶抗氧化性的檢測 重復(fù)1.2.5.2 中對DNA損傷過程的檢測，在此基礎(chǔ)上將修飾好的電極再放入分別含有L-抗壞血酸（VC）、復(fù)合酸奶、和原味酸奶的Fenton試劑中室溫溫育30 min，用pH7.0的PBS溶液沖洗電極，電極置入Ru（NH3）63+溶液中進(jìn)行方波伏安掃描（每檢測一次，電極重新進(jìn)行打磨修飾），根據(jù)峰電流比值來衡量抗氧化劑的抗氧化性能。復(fù)合酸奶及原味酸奶用Fenton溶液稀釋成抗氧化劑溶液，濃度為17.6 mg/mL。

1.2.5.4 DPPH自由基清除能力的檢測 通過對L-抗壞血酸（VC）、復(fù)合酸奶和原味酸奶對DPPH 自由基清除能力的檢測，驗(yàn)證電化學(xué)生物傳感器評價肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶抗氧化能力的可靠性，通過參考徐艷等[23]方法對復(fù)合酸奶DPPH自由基清除抗氧化活性進(jìn)行了評價，并以原味酸奶和VC為對照。首先復(fù)合酸奶、原味酸奶和VC分別用蒸餾水進(jìn)行萃取，配制成5、10、15、20、25 mg/mL的溶液。接著取1 mL的樣品溶液，加入1 mL的0.2 mmol/L的DPPH溶液（稱取0.0079 g DPPH粉末，用無水乙醇溶解定容至100 mL棕色容量瓶），在27 ℃條件下加熱15 min，然后在波長517 nm處測定吸光度值（Ai）；取1 mL的樣品溶液，加入1 mL的0.2 mmol/L的DPPH溶液，在517 nm處測定樣品本底吸光值（Aj）；以蒸餾水代替樣品作為空白對照測定空白吸光度值（A0）；所有樣品重復(fù)3次。分別計(jì)算復(fù)合酸奶、原味酸奶和VC對DPPH自由基的清除率（R），計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design Expert 8.0.5 軟件對數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行響應(yīng)面分析；用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和T檢驗(yàn)分析；抗氧化性能數(shù)據(jù)分析采用Excel 2016版本，使用Origin Pro 2020 軟件進(jìn)行繪圖。所有實(shí)驗(yàn)均平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酸奶發(fā)酵劑添加量對酸奶感官評分的影響酸奶發(fā)酵劑的添加量對復(fù)合酸奶感官評分的影響由圖1可知，隨著酸奶發(fā)酵劑添加量的增加，復(fù)合酸奶的感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)酸奶發(fā)酵劑添加量為2%時，不足以產(chǎn)生足夠多的乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵不完全，組織性較差，感官評分最低。隨著添加量的增加，感官評分逐漸上升，當(dāng)酸奶發(fā)酵劑的添加量為4%時，感官評分最高，分值平均值為87分，這時組織狀態(tài)均勻、酸度適中。當(dāng)酸奶發(fā)酵劑添加量大于4%時，隨著添加量的不斷增大，酸奶的味道發(fā)生變化，感官評分開始下降，這有可能是因?yàn)槿樗岷吭黾?，有乳清析出，影響了感官評分。因此，酸奶發(fā)酵劑最佳添加量為4%。

圖1 酸奶發(fā)酵劑添加量對酸奶的影響Fig.1 Effect of yogurt starter addition on yogurt

2.1.2 紅棗汁添加量對酸奶感官評分的影響 紅棗汁的添加量對復(fù)合酸奶感官評分的影響由圖2可知，隨著紅棗汁添加量的增大，復(fù)合酸奶的感官評分呈先增大后減小的趨勢，紅棗汁添加量為10%時，復(fù)合酸奶中棗味不明顯，味道偏淡，影響了復(fù)合酸奶的感官評分，隨著紅棗汁量的增加，感官評分逐漸上升，當(dāng)紅棗汁添加量為18%時，復(fù)合酸奶口感細(xì)膩、顏色鮮亮，感官評分最高，分值平均值為92分，紅棗汁添加量高于18%時，感官評分降低，產(chǎn)品棗味過濃，掩蓋了酸奶的香氣，組織狀態(tài)差，有乳清析出。因此，紅棗汁最佳添加量為18%。

圖2 紅棗汁添加量對酸奶的影響Fig.2 Effect of the amount of red jujube juice addition on yogurt

2.1.3 肉蓯蓉汁添加量對酸奶感官評分的影響 肉蓯蓉汁的添加量對復(fù)合酸奶感官評分的影響由圖3可知，隨著肉蓯蓉汁添加量的增加，復(fù)合酸奶的感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當(dāng)添加量為5%時，肉蓯蓉的香氣被紅棗和酸奶的風(fēng)味掩蓋，風(fēng)味較差，因此評分較低。隨著肉蓯蓉汁的不斷添加，感官評分逐漸上升，當(dāng)肉蓯蓉汁的添加量為8%時，復(fù)合酸奶的感官評分最高，分值平均值為90分，這時復(fù)合酸奶的紅棗香氣、肉蓯蓉特征香氣與奶香相互諧調(diào)、口感爽滑細(xì)膩。當(dāng)肉蓯蓉汁添加量高于8%時，感官評分迅速下降，此時復(fù)合酸奶肉蓯蓉澀味較重，影響食欲。因此，肉蓯蓉汁最佳添加量為8%。

圖3 肉蓯蓉汁添加量對酸奶的影響Fig.3 Effect of Cistanche deserticola juice addition on yogurt

2.1.4 蜂蜜添加量對酸奶感官評分的影響 蜂蜜的添加量對復(fù)合酸奶感官評分的影響由圖4 可知，隨著蜂蜜添加量的增加，復(fù)合酸奶的感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，蜂蜜的添加量為1%時，復(fù)合酸奶的口感不夠爽滑、狀態(tài)稀薄、風(fēng)味不易被接受，因此復(fù)合酸奶的感官評分最低。隨著蜂蜜添加量的不斷增加，復(fù)合酸奶的感官評分也不斷增加，當(dāng)蜂蜜的添加量為5%時，復(fù)合酸奶的風(fēng)味較好、酸甜適宜、粘稠度高，在此條件下復(fù)合酸奶的感官評分最高，分值平均值為89分。當(dāng)添加量超過5%時，酸奶過甜、風(fēng)味變差、凝固狀態(tài)變差，酸奶表面出現(xiàn)顆粒物質(zhì)。因此，蜂蜜最佳添加量為5%。

圖4 蜂蜜添加量對酸奶的影響Fig.4 Effect of honey addition on yogurt

2.1.5 白砂糖添加量對酸奶感官評分的影響 白砂糖的添加量對復(fù)合酸奶感官評分的影響由圖5可知，隨著白砂糖添加量的增加，復(fù)合酸奶的感官評分呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。白砂糖添加量為4%時感官評分最低，這主要是因?yàn)閺?fù)合酸奶甜度不夠、口感發(fā)酸、香氣不良。隨著白砂糖添加量不斷增加，感官評分逐漸上升，當(dāng)白砂糖添加量為7%時，感官評分最高，分值平均值為87分，這時復(fù)合酸奶其香味協(xié)調(diào)，甜度適中。白砂糖會影響酸奶的質(zhì)地和甜度，當(dāng)白砂糖添加量超過7%時，會導(dǎo)致酸奶甜度過高，影響酸度，且酸奶凝乳不均勻。因此，白砂糖最佳添加量為7%。

圖5 白砂糖添加量對酸奶的影響Fig.5 Effect of white granulated sugar addition on yogurt

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶的感官評分為響應(yīng)值（Y），選取紅棗汁的添加量（A）、肉蓯蓉汁的添加量（B）、蜂蜜的添加量（C）為主要因素的自變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[24]，進(jìn)一步優(yōu)化肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶的工藝，隨機(jī)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)方案與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的方差分析 采用Design Expert 8.0.5軟件對表3 進(jìn)行回歸擬合與方差分析[25]得回歸方程：

回歸方程方差分析見表4。由表4 可知，模型的P值＜0.0001為極顯著，失擬項(xiàng)P值＞0.05為不顯著，證明結(jié)果與實(shí)際符合。一次項(xiàng)A、B、C和交互項(xiàng)AC、BC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.0001），其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。決定系數(shù)R2=0.9835，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9685說明此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高，試驗(yàn)誤差小，預(yù)測結(jié)果較好。根據(jù)F值的大小，得出肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶感官評分受各因素的影響次序?yàn)椋篊（蜂蜜的添加量）＞B（肉蓯蓉汁的添加量）＞A（紅棗汁的添加量）。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

2.2.3 產(chǎn)品的感官評分的響應(yīng)面圖分析 通過對回歸方程的分析[26]，得到以感官評分為響應(yīng)值的紅棗汁、肉蓯蓉汁和蜂蜜添加量這3個因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖6～圖8。

圖6 紅棗汁添加量和肉蓯蓉汁添加量的相互作用對復(fù)合酸奶感官評分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the interaction between the addition of red jujube juice and Cistanche deserticola juice on sensory evaluation of composite yoghurt

圖8 肉蓯蓉汁添加量和蜂蜜添加量的相互作用對復(fù)合酸奶感官評分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the interaction between Cistanche deserticola juice and honey on sensory score of composite yoghurt

由圖6a可知，肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶的感官評分隨著紅棗汁和肉蓯蓉汁的添加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但總體起伏較為平緩，變化值不是很明顯。從圖6b可知，紅棗汁和肉蓯蓉汁添加量之間交互作用的等高線趨近于圓形，表明兩者之間的交互作用對感官評分影響不顯著。

由圖7a可知，當(dāng)蜂蜜添加量一定時，感官評分隨著紅棗汁添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，總體起伏較為平緩。當(dāng)紅棗汁添加量一定時，感官評分隨著蜂蜜添加量的增加呈現(xiàn)先緩慢增加后快速減少的趨勢，總體起伏較大，所以蜂蜜添加量對感官評分具有較大的影響。從圖7b可知，蜂蜜和紅棗汁添加量交互作用等高線趨近于橢圓形，表明二者之間的交互作用對感官評分影響極顯著。

圖7 紅棗汁添加量和蜂蜜添加量的相互作用對復(fù)合酸奶感官評分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the interaction of red jujube juice and honey on sensory evaluation of composite yoghurt

由圖8a可知，當(dāng)肉蓯蓉汁添加量一定時，感官評分隨著蜂蜜添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，從總體上看變化值并不明顯，但蜂蜜添加量感官評價的分值始終高于肉蓯蓉汁添加量感官評價的分值。當(dāng)蜂蜜添加量一定時，感官評分隨著肉蓯蓉汁添加量的增加呈現(xiàn)先緩慢增加后快速減少的趨勢，總體起伏較大，所以肉蓯蓉汁添加量對感官評分也具有較大的影響。從圖8b可知，肉蓯蓉汁和蜂蜜添加量交互作用的等高線趨近于橢圓形，表明二者之間的交互作用對感官評分影響極顯著。

2.2.4 復(fù)合酸奶工藝參數(shù)的確定 利用Design Expert 8.0.5軟件對所得回歸方程進(jìn)行分析求解，確定復(fù)合酸奶制備工藝的最佳參數(shù)。當(dāng)紅棗汁、肉蓯蓉汁和蜂蜜的添加量分別為18%、8%、5%時，復(fù)合酸奶的品質(zhì)最優(yōu)，感官評分為92.2分，與預(yù)測值92.5分極為接近。說明真實(shí)值與該模型預(yù)測值二者擬合良好，對復(fù)合酸奶進(jìn)行配方優(yōu)化具有可操作性[27]。

2.3 復(fù)合酸奶的抗氧化活性評價

2.3.1 修飾電極的電化學(xué)表征 由圖9 可知，曲線a為[Fe（CN）6]3-/4-在裸GCE電極上的氧化還原峰，在裸電極表面修飾CS-N-G后，氧化還原峰值增大（曲線b），這主要是CS和N-G促進(jìn)了電子轉(zhuǎn)移，使電極具有良好的導(dǎo)電性[28]，在修飾DNA/CS-N-G/GCE后，[Fe（CN）6]3-/4-上的氧化還原峰基本消失（曲線c），當(dāng)DNA/CS-N-G/GCE在Fenton試劑中損傷一段時間后，[Fe（CN）6]3-/4-的氧化還原峰有所上升（曲線d），這表明當(dāng)DNA負(fù)載到電極上時形成的膜阻礙了[Fe（CN）6]3-/4-電極上的電化學(xué)響應(yīng)[29]，當(dāng)ds-DNA形成的膜被破壞后，[Fe（CN）6]3-/4-的氧化還原峰有所上升，但峰值較低。

圖9 電極在5.0 mmol/L [Fe（CN）6]3-/4-溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.9 Cyclic voltammetry of the electrode in 5.0 mmol/L[Fe（CN）6]3-/4- solution

2.3.2 DNA損傷以及復(fù)合酸奶抗氧化性的電化學(xué)檢測 由圖10A可知DNA/CS-N-G/GCE 在Fenton試劑中損傷30 min后所檢測到的氧化還原峰最高（曲線c），損傷前所檢測到的氧化還原峰最低（曲線a），這主要是由于ds-DNA在電極表面形成了一層薄膜，從而阻礙了電極上的電化學(xué)響應(yīng)峰電流下降。將修飾好的電極放入Fenton試劑中進(jìn)行溫育，在反應(yīng)的過程中生成了·OH攻擊膜內(nèi)的ds-DNA，對DNA造成了損傷，進(jìn)而氧化還原峰上升[30]。當(dāng)在Fenton試劑中加入VC形成抗氧化劑時，其氧化還原峰（曲線b）有所下降，說明抗壞血酸作為抗氧化劑對Fenton反應(yīng)引起的DNA損傷具有良好的保護(hù)作用。在圖10B中，修飾好的電極以Ru（NH3）63+為探針，檢測到損傷前（曲線a）的氧化還原峰最低，當(dāng)在Fenton溶液中加入L-抗壞血酸（VC曲線b）、復(fù)合酸奶（曲線c）、原味酸奶（曲線d）形成抗氧化劑時，其所檢測到的氧化還原峰與損傷后（曲線e）檢測到最高的氧化還原峰相比有所下降，這主要是VC、復(fù)合酸奶以及原味酸奶作為抗氧化劑，能夠有效的清除一些自由基，對DNA損傷具有一定的保護(hù)作用，而VC作為強(qiáng)抗氧化劑其清除自由基的能力高于復(fù)合酸奶和原味酸奶，而復(fù)合酸奶中添加了肉蓯蓉和紅棗，肉蓯蓉中的苯乙醇苷以及紅棗中的多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用。因此，由DNA生物傳感器評價抗氧化活性結(jié)果可知，其抗氧化能力為L-抗壞血酸（VC）＞復(fù)合酸奶＞原味酸奶。

圖10 電極的DNA損傷檢測和復(fù)合酸奶抗氧化性的電化學(xué)檢測的方波伏安圖Fig.10 DNA damage detection of electrodes and the electrochemical test chart of the antioxidant activity of compound yogurt by square wave voltammetry

2.3.3 DPPH自由基清除能力的測定 由圖11可知，DPPH 自由基清除率隨著樣品濃度的增加而增加，通過擬合方程計(jì)算得L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶和原味酸奶的DPPH 由基的IC50值分別為4.54、15.65、22.94 mg/mL，其抗氧化活性大小依次為L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶、原味酸奶，這主要是肉蓯蓉中的苯乙醇苷以及紅棗中的多酚類物質(zhì)增強(qiáng)了復(fù)合酸奶的抗氧化性。

圖11 不同樣品對DPPH 自由基清除率的影響Fig.11 Effect of different samples on scavenging effect of DPPH free radical

2.3.4 電化學(xué)生物傳感器穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的研究重復(fù)1.2.5抗氧化活性測定的步驟，相同的實(shí)驗(yàn)條件下（各抗氧化劑的濃度為1 mmol/L），通過電化學(xué)生物傳感器評價和DPPH自由基清除法對L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶和原味酸奶的抗氧化活性分別進(jìn)行評價，每個方法進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，記錄檢測值，對測得的每一種抗氧化劑的峰電流值以及自由基清除率結(jié)果進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算和T檢驗(yàn)分析，結(jié)果見表5～表8。

表8 三種抗氧化劑DPPH 自由基清除率樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 8 Three antioxidant DPPH free radical scavenging rate sample T-test analysis results

由表5可知，三種抗氧化劑由方波伏安法檢測的峰電流值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.3%、3.8%、4.6%。

表5 三種抗氧化劑峰電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Relative standard deviation of peak current value for three antioxidants

由表6 結(jié)果，DPPH自由基的清除率由大到小依次為L-抗壞血酸（VC）、復(fù)合酸奶、原味酸奶，且RSD值分別為3.7%、4.1%、4.9%。

表6 三種抗氧化劑DPPH自由基清除率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6 Three antioxidants DPPH radical scavenging rate relative standard deviation

根據(jù)電化學(xué)生物感器評價和DPPH自由基清除法對三種抗氧化劑進(jìn)行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果可知，在相同條件下，電化學(xué)生物傳感器評價的結(jié)果優(yōu)于DPPH自由基清除法的評價結(jié)果，表明用來檢測復(fù)合酸奶抗氧化性的電化學(xué)生物傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

由表7、表8可知，L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶和原味酸奶的電化學(xué)生物傳感器測定的峰電流值以及自由基清除率的P值均小于0.01為極其顯著，說明用電化學(xué)生物傳感器和DPPH自由基的清除體系對L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶、原味酸奶進(jìn)行抗氧化活性評價具有可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠，且電化學(xué)生物傳感器評價與DPPH自由基清除結(jié)果一致，三種抗氧化劑的抗氧化活性為L-抗壞血酸＞復(fù)合酸奶＞原味酸奶。由此證明構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器用于復(fù)合酸奶抗氧化性評價時具有較佳的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，且方法相對便捷高效。

表7 三種抗氧化劑峰電流值的樣本T檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 7 Sample T-test analysis results of peak current value for three antioxidants

3 結(jié)論

以感官評分為指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對影響肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶感官評分的紅棗汁、肉蓯蓉汁和蜂蜜的添加量3個因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，同時利用DNA電化學(xué)生物傳感器和DPPH自由基清除體系對復(fù)合酸奶的抗氧化活性進(jìn)行評價。由單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果可得復(fù)合酸奶的最佳工藝為：紅棗汁添加量為18%、肉蓯蓉汁的添加量為8%、蜂蜜的添加量為5%，由此工藝所得酸奶質(zhì)地均勻、組織細(xì)膩、口感更佳，感官評分最高。在同等優(yōu)化條件下，當(dāng)DNA/CS-N-G/GCE 生物傳感器用于抗氧化活性評價時L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶和原味酸奶的峰電流值分別為6.5×10-5、8.5×10-5、1.05×10-4A，其抗氧化活性大小分別為L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶、原味酸奶。DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證顯示，L-抗壞血酸、復(fù)合酸奶和原味酸奶的IC50值依次為4.54、15.65、22.94 mg/mL，該結(jié)果與生物傳感器的評價結(jié)果一致。這表明本工藝所制備的肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶具有一定的抗氧化作用，不僅為肉蓯蓉紅棗復(fù)合酸奶工藝的優(yōu)化提供了參考，而且還為生物傳感技術(shù)介入食品功能性評價拓展了思路。