陳玉子，譚樂(lè)和，劉啟兵，吳 剛,4，張彥軍,4，徐 飛,4，朱科學(xué),4,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬(wàn)寧 571533；3.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院藥理學(xué)教研室，海南?？?571199；4.海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質(zhì)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南萬(wàn)寧 571533）

腸道是人體重要的消化吸收?qǐng)鏊?，特別是腸道內(nèi)微生物，其所攜帶的基因數(shù)量約為已知人類基因組的150倍[1]，被認(rèn)為是人體的另一個(gè)“重要器官”[2]。腸道微生物參與了人體的基本生物學(xué)過(guò)程，如炎癥性腸病、肥胖、糖尿病、酒精性肝病、癌癥等諸多慢性疾病的發(fā)生發(fā)展均與腸道微生物紊亂密切相關(guān)[3-6]。食源性多糖可調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)和改變腸道微環(huán)境（如降低腸道pH），刺激腸道組織中的巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞抵抗癌癥等疾病[7]，對(duì)人體腸道健康有著正向的調(diào)節(jié)作用。

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllusLam.）作為一種?？颇静ぬ}屬熱帶果樹(shù)，被冠以“熱帶珍果”、“熱帶水果皇后”的美稱。菠蘿蜜果肉含有豐富糖類化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、多酚、脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[8-9]。課題組前期研究證實(shí)，菠蘿蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp，JFP-Ps）主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸組成，平均分子量為1668 ku，具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)等活性[10]。JFP-Ps的免疫增強(qiáng)活性可能與其促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、提高抗氧化活性及誘導(dǎo)細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1β分泌水平有關(guān)[11]。

基于前期研究基礎(chǔ)，本研究擬通過(guò)Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)小鼠16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行定性分析，從操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）、不同水平物種組成分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）等方面，研究灌胃JFP-Ps兩周后小鼠腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)的變化，初步探究JFP-Ps對(duì)小鼠腸道微生物的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果將為其在動(dòng)物疾病模型上的研究和腸道益生產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜多糖（polysaccharide from jackfruit pulp，JFP-Ps） 本課題組提供，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸組成，平均分子量為1668 ku；清潔級(jí)雄性昆明小鼠（體質(zhì)量20.0±2.0 g）

湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002）；糞便DNA提取試劑盒天根生物科技有限公司；瓊脂糖 美國(guó)Invitrogen公司；Q5 DNA聚合酶（M0491L） 美國(guó)新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室；DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司；PicoGreen雙鏈DNA定量試劑盒 美國(guó)Invitrogen公司；TruSeq Nano DNA文庫(kù)制備試劑盒 美國(guó)Illumina公司；其他化學(xué)試劑 均為分析純。

微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀 美國(guó)BioTek公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Illumina MiSeq PE 250測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物的飼養(yǎng)和分組 24只雄性昆明小鼠飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗循環(huán)室中，控制相對(duì)濕度為60%±10%，溫度為23±2 ℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為四組，對(duì)照組（灌胃與多糖組相同體積的蒸餾水）、JFP-Ps（50 mg/kg BW）組、JFP-Ps（100 mg/kg BW）組和JFP-Ps（200 mg/kg BW）組。實(shí)驗(yàn)小鼠每天灌胃1次，連續(xù)灌胃2周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵照海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)規(guī)定（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（瓊）2017-0013）。

1.2.2 樣品采集與提取 于實(shí)驗(yàn)第2周最后一天，采集新鮮小鼠糞便，液氮冷卻，-80 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

采用TIANamp糞便DNA試劑盒提取糞便DNA，微量分光光度計(jì)評(píng)估分離的DNA濃度和純度，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)DNA完整性。

1.2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增 以糞便樣品DNA為模板，正向引物338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'和反向引物806R：5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3'，PCR擴(kuò)增V3～V4區(qū)16S rRNA。PCR反應(yīng)體系：5 μL 5×反應(yīng)緩沖液、5 μL 5×GC緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTP、1 μL 10 μmol/L正向引物、1 μL 10 μmol/L反向引物、2 μL模板、0.25 μL Q5 DNA聚合酶和8.75 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。進(jìn)一步使用Axygen凝膠提取試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并根據(jù)Quant-it PicoGreen dsDNA分析試劑盒進(jìn)行鑒定。DNA測(cè)序文庫(kù)使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建。所有V3和V4區(qū)PCR產(chǎn)物在Illumina MiSeq PE 250平臺(tái)上測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用QIIME的UCLUST功能，選取高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)，以97%的相似度聚類為可操作的分類單元（OTU）。采用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)（http://greengenes.secondgenome.com/）[12]，作 為OTU分類地位鑒定的模板序列，通過(guò)將OTU代表序列與對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列相比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。根據(jù)觀測(cè)到的OTU數(shù)確定細(xì)菌的α多樣性，包括稀疏曲線以及多樣性指數(shù)。根據(jù)OTU劃分獲得每個(gè)樣本在門和屬分類水平上的群落組成結(jié)構(gòu)和微生物類群數(shù)量。采用未加權(quán)UniFrac主成分分析、未加權(quán)UniFrac組間差異比較分析，在QIIME和R軟件中進(jìn)行β多樣性分析。利用偏最小二乘法判別分析和LEfSe分析進(jìn)行菌群比較以及組間差異分析。最后根據(jù)預(yù)測(cè)得到的各功能類群在各樣本中的豐度分布，使用R軟件計(jì)算各樣本（組）共有功能類群的數(shù)量，并通過(guò)Venn圖直觀地呈現(xiàn)各組所共有和獨(dú)有的功能類群所占的比例。利用PICRUSt將現(xiàn)有的16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)相對(duì)比，預(yù)測(cè)分析JFP-Ps對(duì)菌群代謝功能的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。使用SPSS 20軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析，然后進(jìn)行Dunnett多重比較檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin 9.9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 JFP-Ps對(duì)小鼠腸道菌群的多樣性分析

如圖1所示，隨著樣本量的增加，稀釋曲線呈上升的趨勢(shì)，但上升的速度逐漸降低，最后成為一條比較平緩的曲線，達(dá)到Chao1平臺(tái)期。隨著測(cè)序樣品數(shù)量的增加，OTU的數(shù)量越來(lái)越有限，直到達(dá)到飽和點(diǎn)，這表明測(cè)序的深度已經(jīng)覆蓋了檢測(cè)樣品中的所有物種。通過(guò)物種等級(jí)豐度曲線評(píng)估物種豐富度和均勻度，如圖2所示，物種豐度等級(jí)曲線長(zhǎng)且平滑程度高，進(jìn)一步證實(shí)了本研究中樣本的物種豐富度高，且分布均勻。

圖1 菌群α多樣性指數(shù)之Chao1指數(shù)Fig.1 Chao1 index for α diversity

圖2 物種豐度等級(jí)曲線Fig.2 Species rank-abundance curve

為評(píng)估不同濃度菠蘿蜜多糖對(duì)微生物群落組成的影響，PCA結(jié)果如圖3所示，JFP-Ps（200 mg/kg BW）組與對(duì)照組明顯分離，表明JFP-Ps能夠顯著（P＜0.05） 調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的組成和數(shù)量。PLSDA結(jié)果顯示，JFP-Ps組和對(duì)照組小鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)具有明顯的組間差異（圖4）。經(jīng)過(guò)對(duì)組內(nèi)和組間差異的比較和分析，所有組間差異均大于組內(nèi)差異（圖5）。

圖3 腸道菌群PCA分析Fig.3 Principal component analysis of mice fecal bacteria

圖4 腸道菌群PLS-DA分析Fig.4 Partial least squares discrimination analysis of mice fecal bacteria

圖5 未加權(quán)unifrac組間差異比較分析Fig.5 Unweighted unifrac comparison and analysis of differences between groups

2.2 JFP-Ps對(duì)小鼠腸道菌群物種組成分析

JFP-Ps在門水平上對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響如圖6所示，各組小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、脫鐵桿菌門（Deferribacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和TM7等10種菌門構(gòu)成，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）為腸道優(yōu)勢(shì)菌群，在腸道菌群中所占的比例分別為46.15%和44.04%（表1）。

表1 基于門水平的腸道菌群占比（%）Table 1 Proportion of intestinal microorganisms at phylum level (%)

圖6 基于門水平的小鼠腸道菌群分析Fig.6 Microbial composition analysis of fecal samples from mice at the phylum level

如圖7所示，在屬水平上，各組小鼠腸道菌群主要由普雷沃菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、異桿菌屬（Allobaculum）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和副擬桿菌（Parabacteroides）等菌屬構(gòu)成。與對(duì)照組相比，JFP-Ps（50 mg/kg BW和200 mg/kg BW）組中瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、異桿菌屬（Allobaculum）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）等菌屬水平增加，普雷沃菌屬（Prevotella）和帕拉普氏菌屬（Paraprevotella）等菌屬水平減少。但JFP-Ps（100 mg/kg BW）組中擬桿菌屬（Bacteroides）和副擬桿菌（Parabacteroides）等菌屬豐度增加，JFP-Ps（200 mg/kg BW）組顯著增加了異桿菌屬（Allobaculum）的豐度（表2）。結(jié)果表明，JFP-Ps可以改變小鼠腸道菌屬豐度。

圖7 基于屬水平的小鼠腸道菌群分析Fig.7 Microbial composition analysis of fecal samples from mice at the genus level

表2 基于屬水平的腸道菌群占比（%）Table 2 Proportion of intestinal microorganisms at genus level (%)

2.3 JFP-Ps對(duì)小鼠腸道菌群物種差異性分析

線性判別分析（LDA）如圖8所示，對(duì)照組、JFPPs（50 mg/kg BW，100 mg/kg BW，200 mg/kg BW）組分別有4，4，14，8種關(guān)鍵微生物類群。對(duì)照組中小鼠腸道菌群差異物種主要屬于擬桿菌門（Prevotella、CF231和Prevotellaceae）和厚壁菌門（Holdemania）；JFP-Ps（50 mg/kg BW）組中小鼠腸道菌群差異物種主要屬于軟壁菌門（Tenericutes和Mollicutes）和擬桿菌門（Peptostreptococcaceae和SMB53）。JFP-Ps（100 mg/kg BW）組中小鼠腸道菌群差異物種主要屬于擬桿菌門（Bacteroides、Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae、Parabacteroides和Alistipes），疣微菌門（Verrucomicrobiaceae、Akkermansia、Verrucomicrobiae、Verrucomicrobia和Verrucomicrobiales）和厚壁菌門（Christensenella、Phascolarctobacterium、Robinsoniella和_Eubacterium_）。JFP-Ps（200 mg/kg BW）組中小鼠腸道菌群差異物種主要屬于TM7（TM7_3、TM7、CW040和F16），厚壁菌門（Allobaculum、Clostridiaceae）、變形菌門（Rickettsiales）和放線菌門（Atopobium）。JFP-Ps增加了腸道菌群的多樣性，通過(guò)將這種差異折射到各個(gè)層級(jí)結(jié)構(gòu)的分類樹(shù)上，如圖9進(jìn)化分支圖所示，JFP-Ps的干預(yù)導(dǎo)致物種間豐度差異顯著的菌門分別為Verrucomicrobia、Tenericutes、TM7（P＜0.05）。

圖8 腸道菌群菌屬水平LDA值分布柱狀圖Fig.8 Histogram of LDA scores at genus level

圖9 腸道菌群的進(jìn)化分支圖Fig.9 Cladogram of mice fecal bacteria

2.4 JFP-Ps對(duì)腸道菌群代謝功能的影響

根據(jù)PICRUSt功能預(yù)測(cè)，對(duì)照組和JFP-Ps處理組共享4532個(gè)功能類群，同時(shí)，對(duì)照組，JFP-Ps（50 mg/kg BW、100 mg/kg BW、200 mg/kg BW）組分別擁有22、112、147、39個(gè)獨(dú)有的功能類群（圖10）。表明JFP-Ps可以增加腸道微生物功能類群的數(shù)量。將16S rRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，如圖11結(jié)果所示，腸道微生物群參與了碳水化合物、氨基酸、能量、核苷酸、輔助因子以及維生素等物質(zhì)的代謝過(guò)程，其中，參與碳水化合物代謝的腸道微生物豐度最高。

圖10 共有功能類群Venn圖分析Fig.10 Venn analysis of common functional groups

圖11 KEGG代謝功能預(yù)測(cè)分析Fig.11 KEGG metabolic functional predictive analysis

3 討論

腸道微生物對(duì)于人體的新陳代謝和免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要[13-14]。腸道微生物的優(yōu)勢(shì)菌群主要包括擬桿菌門和厚壁菌門，其編碼了大量的碳水化合物活性酶（CAZymes），并將大部分碳水化合物降解為能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15]。高脂肪飲食能夠增加小鼠體內(nèi)厚壁菌門（Firmicutes）/擬桿菌門（Bacteroidetes）的比率，并降低疣微菌門（Verrucomicrobia）的比例，補(bǔ)充來(lái)自蘿卜葉的多糖成分（PRG）能夠恢復(fù)腸道菌群的組成[16-17]。腸道菌群的豐富度和多樣性與腸道相關(guān)疾病通常呈負(fù)相關(guān)[18]，擬桿菌門（Bacteroidetes）是腸道微生物維持機(jī)體健康狀態(tài)和穩(wěn)態(tài)的主要參與者，在免疫失調(diào)、代謝綜合征等疾病中具有積極的作用[19]，厚壁菌門（Firmicutes）豐度的降低會(huì)導(dǎo)致肝脂質(zhì)代謝增強(qiáng)[20]?；陂T水平的腸道菌群組成分析表明，JFPPs能夠調(diào)節(jié)厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）菌群組成，提高了腸道菌群的多樣性和豐富度，這與Li等[21]的研究結(jié)果一致。本研究表明JFP-Ps能夠調(diào)節(jié)厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度，提高腸道菌群的多樣性，從而有效的促進(jìn)人體健康。

在微生物多樣性研究中，相似程度大于97%的序列可歸類一個(gè)可操作分類單元（OTU），選擇具有代表性的序列進(jìn)行物種注釋[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、脫鐵桿菌門（Deferribacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和TM7等10種菌門構(gòu)成。Feng等[23]發(fā)現(xiàn)在門水平上，腸道中主要有10種厭氧微生物，與本研究結(jié)果相似。

普雷沃菌屬（Prevotella）可以分解碳水化合物，從而導(dǎo)致總SCFAs和丙酸鹽的產(chǎn)量更高[24]，其與宿主肥胖存在正相關(guān)[25]，并且可誘導(dǎo)腸道炎癥和口腔炎癥等多種疾病[26]。研究表明，異桿菌屬（Allobaculum）的豐度與ANGPTL4的表達(dá)呈正相關(guān)[27]，血管生成素樣蛋白4（ANGPTL4）是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，也是腸道微生物群和脂肪沉積的循環(huán)介質(zhì)。顫螺菌屬（Oscillospira）與腸道菌群多樣性呈正相關(guān)，其豐度可以用于預(yù)測(cè)低體重指數(shù)[28]。低聚半乳糖對(duì)維持大鼠腸屏障功能有明顯作用，這可能與益生菌乳桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的數(shù)量增加有關(guān)[29]。擬桿菌屬（Bacteroides）可以使膽鹽水解，將結(jié)合型膽汁酸轉(zhuǎn)化為非結(jié)合型膽汁酸，并通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮其潛在的代謝調(diào)節(jié)作用[30]。瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、勞特氏菌屬（Blautia）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和顫螺菌屬（Oscillospira）是一類產(chǎn)SCFAs菌群[31-32]。SCFAs作為重要的菌群代謝產(chǎn)物，可以驅(qū)動(dòng)宿主與腸道微生物之間的相互作用[33]，并與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合提高宿主免疫力，為上皮細(xì)胞提供能量以刺激細(xì)胞增殖、分化和成熟，減少細(xì)胞的凋亡[34]。在屬水平上，進(jìn)一步通過(guò)差異分析，篩選出JFP-Ps顯著調(diào)控的菌群。本研究發(fā)現(xiàn)，JFP-Ps可使小鼠腸道中菌屬豐度發(fā)生改變，不同程度增加擬桿菌屬（Bacteroides）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、顫螺菌屬（Oscillospira）、異桿菌屬（Allobaculum）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和副擬桿菌（Parabacteroides）等分解碳水化合物菌屬及產(chǎn)SCFAs菌屬的豐度。本研究進(jìn)一步通過(guò)PICRUSt功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)參與碳水化合物代謝的腸道微生物類群的豐度最多，這與Yang等[35]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，JFP-Ps可通過(guò)調(diào)節(jié)擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）等腸道優(yōu)勢(shì)菌群的組成和結(jié)構(gòu)，增加腸道菌群的多樣性，通過(guò)改變腸道中分解碳水化合物菌屬和產(chǎn)SCFAs菌屬的豐度，發(fā)揮腸道微生物調(diào)節(jié)作用，改善宿主腸道微生態(tài)健康，研究結(jié)果為JFP-Ps在腸道益生產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。