朱禮艷，李思越，黃建聯(lián)，江銀梅，萬 碩，趙金龍，李振興,

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361022；2.安井食品集團(tuán)股份有限公司，福建廈門 361022；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

大豆蛋白因其高營養(yǎng)價(jià)值和功能特性，成為食品工業(yè)中最重要的植物蛋白來源之一[1]。研究表明食用大豆有降低血漿膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白等有益作用。因此大豆蛋白如今被廣泛用于肉類、乳制品、烘焙產(chǎn)品和食用醬等原料中[2]。但是，大豆也是公認(rèn)的八大食物過敏原之一，是人類常見的食物過敏原[3]。大豆過敏的患病率在一般人群中約為0.3%～0.4%，幼兒比成人更容易受到影響[4]。大豆過敏患者癥狀輕微時(shí)會(huì)出現(xiàn)嘴唇或面部腫脹、皮膚紅腫、抽搐、嘔吐、肚痛或肚瀉等，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致過敏性休克，甚至死亡[5]。

一些研究已經(jīng)證明至少有16種過敏原可以與大豆過敏患者血清的IgE結(jié)合，其中Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和β-伴大豆球蛋白的α亞基（Gly m Bd 60K）是大豆中的主要過敏原[6]。眾所周知，對(duì)食物過敏唯一有效的治療方法就是避免食用這些食物，但是現(xiàn)在食物配料多種多樣，食物的組成變得十分復(fù)雜，很難避免食用大豆成分[7]。因此，建立針對(duì)大豆過敏原的方便、快捷、靈敏、特異的檢測(cè)方法，對(duì)于保護(hù)大豆過敏患者的消費(fèi)安全和身體健康有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，針對(duì)大豆過敏原的檢測(cè)主要有液相色譜技術(shù)、生物傳感器、生物質(zhì)譜技術(shù)等，其中酶聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)[8-10]。但是在對(duì)大豆過敏原的ELISA檢測(cè)方法的研究中，研究較多的過敏原是β-伴大豆球蛋白、Gly m 4、Gly m 8等單一過敏原，針對(duì)混合過敏原蛋白的ELISA研究報(bào)道較少[11-13]?；旌线^敏原蛋白可以制備出含有諸多抗體位點(diǎn)的抗體，這樣抗體可最大程度上與抗原及待檢樣品結(jié)合，較準(zhǔn)確地對(duì)潛在過敏原進(jìn)行檢測(cè)，不容易出現(xiàn)漏檢的情況[14]。因此，本研究選擇大豆多組分混合過敏原蛋白作為免疫原，建立雙抗夾心ELISA方法和間接競(jìng)爭ELISA方法[15-17]，用這兩種方法來檢測(cè)加工條件下的樣品，比較在實(shí)際加工樣品和真實(shí)食物樣品中的檢測(cè)能力，并確定這兩種方法各自適用的檢測(cè)條件，從而為大豆過敏原便捷、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)種植；羊多抗血清、兔多抗血清 北京華大蛋白公司制備；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、TMB單組份顯色液、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；吐溫20、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、濃硫酸、丙酮 均為分析純；BCA蛋白定量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；高筋小麥粉、低筋小麥粉、黃油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；細(xì)砂糖 廣州市華僑糖廠；豆奶、醬油、餅干、黃豆醬、芝麻糊、雞蛋、牛奶等食品 均購自青島利群超市。

800TS吸收光酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆混合過敏原的提取 先將大豆研磨成細(xì)小粉末，過80目篩后，收集大豆粉，之后在4 ℃條件下，加入一定量的丙酮，脫脂、脫色；按照1:10（g/mL）比例加入細(xì)胞裂解液，在室溫條件下充分混勻（約3 h），之后在12000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，收集上清液，將上清液通過0.22 μm的濾膜過濾，得到大豆多組分混合過敏原溶液，于-20 ℃保存。

1.2.2 多克隆抗體的制備 羊多抗血清和兔多抗血清是由北京華大蛋白公司制備，具體操作步驟如下：用1.2.1提取得到的大豆混合過敏原溶液免疫羊和新西蘭雄兔，用不含大豆蛋白的飼料喂養(yǎng)剛斷奶的小羊和新西蘭兔，待體重達(dá)到2 kg左右時(shí)進(jìn)行免疫，每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，共免疫4次。在第三次免疫后，可對(duì)羊和兔進(jìn)行少量血液的采集，之后利用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，合格后，經(jīng)過一次的沖擊加強(qiáng)免疫，可大量采血。采血前這兩種動(dòng)物禁食24 h，以防血脂過高。得到的血液于37 ℃靜置2 h，之后4 ℃過夜，次日9500 r/min，4 ℃條件下離心20 min，分裝并于-80 ℃保存。

得到的血清采用Protein A/G親和層析柱進(jìn)行純化。取少量的血清與等體積的1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）混合，上樣于預(yù)先用0.15 mol/L NaCl（pH7.0）的緩沖液平衡好的Protein A/G Sepharose親和層析柱。依次用0.15 mol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4（pH7.0）的緩沖液流洗，0.1 mol/L甘氨酸（pH3.0）的緩沖液洗脫。最終獲得純化的IgG抗體，將純化的多克隆抗體進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析[18]，分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 夾心ELISA定量檢測(cè)方法的建立

1.2.3.1 夾心ELISA基本檢測(cè)程序 用碳酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH9.6）稀釋多克隆抗體到一定質(zhì)量濃度，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃過夜。然后用PBST（PBS含0.05%吐溫-20，pH7.4）洗滌3次，每孔300 μL，每次5 min左右，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干，之后的洗滌步驟與此步驟完全相同。用1% BSA封閉，37 ℃溫育120 min左右，洗滌拍干后，每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液（大豆混合過敏原溶液、食物樣本或者PBST作為對(duì)照），37 ℃孵育60 min后洗滌拍干，接著每孔加入100 μL一定濃度的另一株多克隆抗體，37 ℃孵育60 min后洗滌拍干；之后每孔加入100 μL稀釋到一定倍數(shù)的酶標(biāo)抗體溶液，在37 ℃反應(yīng)30 min后洗滌拍干，TMB底物溶液避光顯色10 min，最后以2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)定OD450值，計(jì)算P/N值（其中P為陽性樣品值，N為陰性對(duì)照值）[19-20]。

1.2.3.2 捕獲抗體、檢測(cè)抗體和酶標(biāo)二抗工作濃度的選擇 在相同的反應(yīng)條件下，采用1.2.3.1節(jié)的步驟分別對(duì)羊多克隆抗體（捕獲抗體）（1:3000、1:5000、1:8000、1:10000、1:12000）、兔多克隆抗體（檢測(cè)抗體）（1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000）和酶標(biāo)二抗（1:5000、1:8000、1:10000、1:12000、1:15000）進(jìn)行檢測(cè)，將抗原濃度設(shè)置為陽性5 μg/mL，PBST代替抗原為陰性，測(cè)定OD450值，并計(jì)算P/N值，確定最佳稀釋度。

1.2.3.3 檢測(cè)時(shí)間的確定 在抗體最佳工作濃度條件下，采用1.2.3.1節(jié)的步驟分別對(duì)抗原孵育時(shí)間（30、60、90 min）、檢測(cè)抗體孵育時(shí)間（30、60、90 min）、酶標(biāo)二抗工作時(shí)間（30、60、90 min）、TMB顯色時(shí)間（5、10、15 min）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將抗原濃度設(shè)置為陽性5 μg/mL，PBST代替抗原為陰性，測(cè)定OD450值，并計(jì)算P/N值，確定最佳檢測(cè)條件。

1.2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 按照確定好的實(shí)驗(yàn)條件，檢測(cè)不同濃度抗原（0.0078～30 μg/mL），測(cè)定OD450值并繪制校準(zhǔn)曲線，找出線性范圍，確定最終的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 競(jìng)爭ELISA定量檢測(cè)方法的建立

1.2.4.1 競(jìng)爭ELISA基本檢測(cè)程序 將大豆過敏原用0.05 mol/L pH9.6 CBS稀釋液稀釋后，各孔加100 μL于96孔酶標(biāo)板中，4 ℃包被過夜后拍干，用PBST洗滌緩沖液重復(fù)洗滌三次，每次5 min，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標(biāo)板拍干，之后的洗滌步驟與此步驟完全相同。用5%脫脂奶粉封閉液進(jìn)行封閉，每孔加入300 μL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中封閉120 min后，棄掉封閉液，用PBST洗滌緩沖液洗滌拍干；將50 μL一抗和50 μL不同濃度的蛋白溶液混合，在37 ℃預(yù)孵育10 min后加入孔內(nèi)，每孔100 μL，37 ℃恒溫孵育90 min后將液體倒出，洗滌拍干；將稀釋到一定倍數(shù)的酶標(biāo)二抗加入所有孔中，每孔100 μL，37 ℃恒溫孵育60 min后將液體倒出，洗滌拍干，TMB底物溶液避光顯色10 min，最后以2 mol/L H2SO4溶液終止反應(yīng)，測(cè)定OD450值[21-22]。

1.2.4.2 最佳包被抗原濃度的優(yōu)化 以制備得到的大豆過敏原（10 mg/mL）為標(biāo)品，從蛋白濃度為10 μg/mL時(shí)開始進(jìn)行梯度稀釋，兔多克隆抗體以稀釋倍數(shù)為2×104時(shí)開始往下稀釋。選擇吸光度值在1.3附近，且空白值低于0.1的參數(shù)為最終工作濃度。

1.2.4.3 最佳一抗、二抗工作濃度的優(yōu)化 將抗原稀釋至最佳濃度，進(jìn)行包被，來優(yōu)化兔多克隆抗體和羊抗兔酶標(biāo)二抗的工作濃度。兔多克隆抗體的稀釋倍數(shù)為1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105，分別在96孔板中縱向加入，羊抗兔酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為2×104、4×104、8×104、1.6×105、3.2×105，分 別 在96孔板中橫向加入。用棋盤法選擇吸光度值在1.3附近，且空白值低于0.1的參數(shù)為最終工作濃度。

1.2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 確定抗原、抗體最佳的工作濃度后，按照1.2.4.1的操作步驟測(cè)定不同大豆過敏原濃度下的吸光度值。以大豆過敏原作為競(jìng)爭物，起始濃度為100 μg/mL，以4倍梯度稀釋，共12個(gè)濃度，在最優(yōu)條件下進(jìn)行競(jìng)爭ELISA實(shí)驗(yàn)。將標(biāo)準(zhǔn)品各濃度的OD值換算成B/B0（其中B為各蛋白濃度在450 nm下的OD值，B0是空白對(duì)照的平均值），以B/B0為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)四參數(shù)擬合公式y(tǒng)=（A-D）/[1+（x/C）-B]+D對(duì)該曲線進(jìn)行擬合（其中D表示吸光度下限值，代表著S型曲線的下漸近線；而A表示吸光度上限值，代表著S型曲線的上漸近線；C為吸光度增長速度開始發(fā)生變化的濃度值；B為吸光度增加速率參數(shù)，相當(dāng)于曲線的斜率）。依據(jù)LOD=B0-3SD（SD為空白對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)偏差）計(jì)算檢測(cè)限。

1.2.5 實(shí)際加工樣品的制備 本研究中制備兩種實(shí)際加工食品，分別是面包和蛋糕，進(jìn)行實(shí)際樣品回收率的測(cè)定，這種方法能夠評(píng)估加工對(duì)提取和回收目標(biāo)蛋白的實(shí)際影響以及檢測(cè)效率。

制作面包的過程為：將5 g酵母加在125 g水中攪拌至酵母融化，再將250 g高筋小麥粉、50 g細(xì)砂糖、30 g黃油和50 g雞蛋加入進(jìn)行和面，直至面團(tuán)能抻成很薄的薄膜，之后將面團(tuán)靜置醒發(fā)30 min，將成型好的面團(tuán)放入烤盤中再次醒發(fā)，醒發(fā)至原體積的2～3倍，烤爐預(yù)熱至上火180 ℃，下火200 ℃，烘烤15 min，取出冷卻后即可。在本實(shí)驗(yàn)中需要兩種面包，一種是未添加大豆的面包，一種是添加大豆的面包（在烘烤前將一定量的大豆粉均勻的鋪在面團(tuán)表面）。烘焙結(jié)束后，按照最佳前處理方法對(duì)兩種面包進(jìn)行蛋白提取，待用。

制作蛋糕的過程為：將5個(gè)雞蛋蛋白用打蛋器打至粗泡狀態(tài)，在蛋白里加入15 g細(xì)砂糖，繼續(xù)打至細(xì)膩的泡沫，再加入15 g細(xì)砂糖，繼續(xù)打至可呈現(xiàn)紋路的狀態(tài)，最后再加入20 g的細(xì)砂糖，繼續(xù)打至干性發(fā)泡的狀態(tài)（當(dāng)提起打蛋器的時(shí)候，蛋白能拉出一個(gè)短小直立的尖角），另外將5個(gè)蛋黃與30 g細(xì)砂糖攪拌均勻至蛋黃顏色變淺，再邊攪拌邊加入50 mL色拉油和50 mL牛奶，最后篩入90 g低筋小麥粉，慢慢地?cái)噭蛑凉饣?xì)膩無顆粒。蛋黃糊攪拌完成后，取蛋白霜入蛋黃糊中，翻拌均勻至光滑細(xì)膩無顆粒。把蛋糕放入預(yù)熱好的烤箱中，上下火，170 ℃，烘烤40 min，取出即可。在本實(shí)驗(yàn)中需要兩種蛋糕，一種是未添加大豆的蛋糕，一種是添加大豆的蛋糕（在烘烤前將一定量的大豆粉均勻的鋪在面團(tuán)表面）。烘焙結(jié)束后，按照最佳前處理方法對(duì)兩種蛋糕進(jìn)行蛋白提取，待用。

1.2.6 加標(biāo)樣品的制備 將三種不含大豆蛋白的食物（橙汁、巧克力、牛肉醬）打碎，然后將1 g食物碎加入總體積為5 mL的0.01 mol/L pH8.5 CBS（含0.05% SDS和0.05% DTT）中，用提取得到的大豆混合過敏原溶液進(jìn)行加標(biāo)，使終濃度為0.5、2、5 μg/mL。在4 ℃下渦旋振蕩孵育1 h，然后10000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，每個(gè)梯度重復(fù)3次，根據(jù)下式計(jì)算回收率。

1.2.7 真實(shí)食物樣品的制備 從超市購買豆奶、醬油、餅干、黃豆醬、芝麻糊5種經(jīng)過劇烈加工過的食品，這些食品經(jīng)過了發(fā)酵或高溫烘焙等，采用雙抗夾心ELISA和競(jìng)爭ELISA分別檢測(cè)其中是否含有大豆過敏原，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較。提取步驟與上述相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。并運(yùn)用Origin軟件進(jìn)行作圖，采用IBM SPSS Statistics 19.0（SPSS，Chicago，Illinois，USA）進(jìn)行單因素方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，查看樣本顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆混合過敏原的制備

提取后的大豆混合過敏原溶液經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后，通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析。如圖1所示。

圖1 大豆混合過敏原的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of soybean mixed allergens

大豆中過敏原蛋白眾多，致敏原數(shù)據(jù)庫共收錄38種，包括16種IgE介導(dǎo)的過敏原。但目前根據(jù)蛋白含量多少和致敏能力的大小，大豆球蛋白（22、

52～55 kDa）、Gly m Bd 30K（30～35 kDa）、Gly m Bd 28K（28 kDa）和β-伴大豆球蛋白（50、63～67、75 kDa）被認(rèn)為是大豆中最主要的過敏原。通過SDS-PAGE結(jié)果，可以看到主要的過敏原均已提取得到，與文獻(xiàn)中所報(bào)道的情況基本一致[6]。

2.2 兔多抗和羊多抗純化結(jié)果

將兔血清和羊血清進(jìn)行Protein A/G親和層析柱純化后，得到的SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。純化的IgG抗體的分子量為150 kDa左右，本實(shí)驗(yàn)采用還原性電泳，泳道1和2顯示，IgG在還原條件下主要顯示為25 kDa的輕鏈和50 kDa的重鏈，說明經(jīng)過Protein A/G親和層析柱的純化，得到了純度較高的兔多克隆抗體和羊多克隆抗體。

圖2 Protein A/G柱純化兔多抗和羊多抗的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of polyclonal antibodies of rabbit and sheep purified by protein A/G column

2.3 夾心ELISA定量檢測(cè)方法的建立

2.3.1 最佳捕獲抗體、檢測(cè)抗體和酶標(biāo)二抗工作濃度的確定 如圖3顯示，當(dāng)捕獲抗體稀釋5000倍時(shí)，P/N值最大；當(dāng)檢測(cè)抗體稀釋8000倍時(shí)，P/N值最大；當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋10000倍時(shí)，P/N值最大。最終考慮抗體等試劑的價(jià)格因素和食品安全風(fēng)險(xiǎn)因素等最終確定了如下實(shí)驗(yàn)條件，羊多克隆抗體用作捕獲抗體以5000倍稀釋；兔多克隆抗體作為檢測(cè)抗體以8000倍稀釋；酶標(biāo)二抗以10000倍稀釋。

圖3 夾心ELISA的抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化Fig.3 Optimization of antibody dilution ratio of sandwich ELISA

2.3.2 最佳檢測(cè)時(shí)間的確定 如圖4所示，隨著抗原孵育時(shí)間和TMB顯色時(shí)間的增加，OD值也在增加，但由于整個(gè)反應(yīng)過程陰性空白OD值非常低，故P/N值也在增加，當(dāng)抗原孵育時(shí)間為60 min、TMB顯色時(shí)間為10 min時(shí)，OD值已經(jīng)超過1.0，滿足實(shí)驗(yàn)要求，所以為了節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率，確定抗原孵育時(shí)間為60 min，TMB顯色時(shí)間為10 min。當(dāng)檢測(cè)抗體孵育時(shí)間和酶標(biāo)二抗工作時(shí)間增加到90 min時(shí)，P/N值均開始降低且OD值增加不多，故選擇60 min作為檢測(cè)抗體的孵育時(shí)間和酶標(biāo)二抗的工作時(shí)間。

圖4 夾心ELISA的工作時(shí)間優(yōu)化Fig.4 Optimization of ELISA working time

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確立 在上述最適反應(yīng)條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將抗原設(shè)置為不同濃度（0.0078～30 μg/mL），并進(jìn)行線性回歸分析，選取其中具有線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍（0.0625、0.25、1、2、3、4、6 μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。此曲線的回歸方程為y=0.2333x+0.0692，R2為0.995，其中x表示抗原的濃度，y表示不同濃度抗原的吸光度，從結(jié)果來看，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

2.4 競(jìng)爭ELISA定量檢測(cè)方法的建立

2.4.1 最佳抗原包被濃度的確定 結(jié)果如表1所示。從橫向看，隨著抗原濃度的降低，OD值也越來越低，當(dāng)抗原濃度為2.5 μg/mL時(shí)，已經(jīng)達(dá)到飽和，因此最終確定包被抗原的濃度為2.5 μg/mL。

表1 棋盤法優(yōu)化包被抗原的濃度Table 1 Results of chessboard method for optimination coating concentration

2.4.2 最佳一抗、二抗工作濃度的優(yōu)化 結(jié)果見表2。當(dāng)兔多克隆抗體稀釋倍數(shù)為20000倍時(shí)，已經(jīng)達(dá)到飽和，當(dāng)稀釋倍數(shù)從2×104倍增加到4×104倍時(shí)，吸光度值有非常明顯的降低，故可先將一抗稀釋倍數(shù)定為20000倍，再觀察二抗，當(dāng)二抗稀釋倍數(shù)為8×104倍時(shí)，OD值可達(dá)到1.3，且背景值很低，所以可將二抗稀釋倍數(shù)定為80000倍。因此，確定包被抗原的最終濃度為2.5 μg/mL，兔多克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)為20000倍，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG的最佳稀釋倍數(shù)為80000倍。

表2 棋盤法優(yōu)化一抗和二抗的工作濃度Table 2 Results of chessboard method for optimination of primary antibody and secondary antibody

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 確定抗原、抗體最佳的工作濃度后，按照1.2.4.1的操作步驟測(cè)定不同大豆過敏原濃度下的吸光度值。從結(jié)果來看（圖5），檢測(cè)范圍為10～100000 ng/mL，最低檢測(cè)限為10 ng/mL。

2.5 競(jìng)爭ELISA方法和雙抗夾心ELISA方法的分析比較

2.5.1 實(shí)際加工樣品回收結(jié)果 在面包和蛋糕進(jìn)行烘烤前，將3.0 g大豆粉揉搓在20.0 g面團(tuán)中，進(jìn)行烘焙。制作完成后，按照大豆過敏原的提取方法對(duì)自制的面包和蛋糕進(jìn)行蛋白的提取，將提取的蛋白適度稀釋后，用競(jìng)爭ELISA方法和雙抗夾心ELISA方法分別檢測(cè)空白樣品和加入大豆過敏原的加工樣品。大豆中蛋白的含量約在40%～50%，可根據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行回收率的計(jì)算。添加回收結(jié)果見表3。

表3 競(jìng)爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法添加回收結(jié)果Table 3 Results of actual processed samples by competitive ELISA and double-antibody sandwich ELISA

從結(jié)果來看，在經(jīng)過高溫烘烤等劇烈加工后的食物樣品，競(jìng)爭ELISA檢測(cè)后的回收率要高于雙抗夾心ELISA的回收率，該結(jié)果與De等[21]的研究結(jié)果一致。這可能都是因?yàn)樵趧×业募庸l件下，某些過敏原上的多個(gè)抗原表位被破壞，兩株抗體不能識(shí)別過敏原上的兩個(gè)不同的表位，而競(jìng)爭ELISA中抗體只需要識(shí)別單個(gè)表位，所以某些夾心ELISA方法檢測(cè)不到的蛋白，競(jìng)爭ELISA方法可以檢測(cè)得到。

2.5.2 加標(biāo)食品回收結(jié)果 將提取得到的大豆混合過敏原溶液加入三種不含大豆蛋白的食物（橙汁、巧克力、牛肉醬）中，使終濃度為0.5、2、5 μg/mL，用雙抗夾心ELISA方法和競(jìng)爭ELISA兩種方法來進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 競(jìng)爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法加標(biāo)回收結(jié)果Table 4 Results of competitive ELISA method and double-antibody sandwich ELISA method for the detection of labeled food

當(dāng)基質(zhì)樣品為橙汁時(shí)，從結(jié)果中可以看出雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)得到的回收率要高于競(jìng)爭ELISA，橙汁中成分簡單，加工不復(fù)雜，在這種環(huán)境中，夾心ELISA方法的準(zhǔn)確性和靈敏度均是要由于競(jìng)爭ELISA方法，這與Segura等[23]的研究一致。但是在巧克力和牛肉醬中，當(dāng)大豆過敏原的加標(biāo)濃度較低（0.5 μg/mL）時(shí)，雙抗夾心ELISA中沒有檢測(cè)到大豆過敏原，而競(jìng)爭ELISA方法中檢測(cè)到了大豆過敏原的存在，回收率為68%和76%，回收率不高的原因可能是因?yàn)榛|(zhì)中成分的復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)的影響，但整體上在這種基質(zhì)中成分較多，加工較為復(fù)雜的食物樣品檢測(cè)中，競(jìng)爭ELISA方法還是較為適用的。

2.5.3 真實(shí)樣品檢測(cè)結(jié)果 除了對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，還購買了五種在售食品，分別是豆奶、醬油、餅干、黃豆醬、芝麻糊，在這幾種食物的標(biāo)簽上，豆奶、醬油和黃豆醬這三種分別標(biāo)注了大豆成分，餅干和芝麻糊這兩種食物標(biāo)簽上未標(biāo)注大豆成分。采用競(jìng)爭ELISA和雙抗夾心ELISA方法對(duì)這5種食物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5。

表5 競(jìng)爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法對(duì)真實(shí)食品的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of competitive ELISA and double-antibody sandwich ELISA on real food

結(jié)果顯示，在對(duì)芝麻糊中大豆過敏原的檢測(cè)中，夾心ELISA方法和競(jìng)爭ELISA方法都檢測(cè)到了微量大豆過敏原的存在，但是在芝麻糊食品標(biāo)簽上沒有標(biāo)注大豆過敏原成分，這可能是由于在食品的生產(chǎn)環(huán)節(jié)造成了交叉污染導(dǎo)致的。在餅干當(dāng)中均未檢測(cè)到大豆過敏原成分，這與標(biāo)簽和配料表上描述的一致，在對(duì)醬油和黃豆醬的檢測(cè)中，競(jìng)爭ELISA方法比夾心ELISA方法檢測(cè)到的大豆過敏原含量要略高一些，這可能也是因?yàn)辄S豆醬和醬油都屬于發(fā)酵類食品，發(fā)酵對(duì)食物中的蛋白有影響，會(huì)導(dǎo)致某些蛋白過敏原性的降低，或者大分子蛋白的降解，或者對(duì)過敏原的表位造成破壞，進(jìn)而導(dǎo)致夾心ELISA方法無法完全準(zhǔn)確地測(cè)出其中所含過敏原的含量[24]。在對(duì)豆奶中大豆過敏原的檢測(cè)中，夾心ELISA方法要比競(jìng)爭ELISA方法的靈敏度和準(zhǔn)確性更好一些，這與之前的研究結(jié)果是一致的，對(duì)于成分簡單，輕加工的食品來說，更適用于夾心ELISA方法進(jìn)行大豆過敏原的檢測(cè)，而對(duì)于深度加工，加工條件比較劇烈的食品來說，更適用于競(jìng)爭ELISA方法來檢測(cè)其中大豆過敏原的含量。

3 討論

本研究初步建立了檢測(cè)大豆過敏原的雙抗夾心ELISA方法和競(jìng)爭ELISA方法，通過實(shí)際加工樣品的回收實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)食品回收實(shí)驗(yàn)以及對(duì)真實(shí)食物樣本的檢測(cè)，對(duì)競(jìng)爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法的適用范圍進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，競(jìng)爭ELISA法更適用于食物基質(zhì)復(fù)雜，經(jīng)過深度加工的食品，而夾心ELISA法更適用于食物成分簡單，輕加工后的食品，兩種方法沒有優(yōu)劣之分，在各自的適用范圍內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)較準(zhǔn)確的檢測(cè)。

在進(jìn)行回收率的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)效應(yīng)的存在，越是復(fù)雜的食物體系，回收率會(huì)越低，可能是因?yàn)槭称坊|(zhì)的復(fù)雜組分之間會(huì)產(chǎn)生相互作用來影響過敏原的檢測(cè)，并且基質(zhì)組分和加工時(shí)的相互作用等因素可能會(huì)加大對(duì)過敏原檢測(cè)的影響[25-26]。所以在以后可增強(qiáng)對(duì)食品基質(zhì)效應(yīng)的影響以及食品加工對(duì)食物致敏性影響的研究。

綜上，本研究初步建立了大豆過敏原的兩種ELISA檢測(cè)方法，并進(jìn)行了比較。對(duì)之后食物樣品中大豆蛋白的快速檢測(cè)和篩選有積極的作用，使得可以通過檢測(cè)盡可能低量的過敏原來最大程度的降低過敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，具有一定的應(yīng)用前景和應(yīng)用價(jià)值。