范三紅，薛虎貴，白寶清，薛騰達，藺佳鈺，張錦華,

（1.山西大學生命科學學院，山西太原 030006；2.山西大學，特色植物資源研究與利用山西重點實驗室，山西太原 030006）

食醋作為一種調(diào)味品，其生產(chǎn)歷史悠久，因有護肝[1-2]、抗氧化[3]等功效，深受我國人民的喜愛。山西陳醋采用固態(tài)發(fā)酵方式，發(fā)酵過程中微生物生長繁殖與其代謝活動，以及特有蒸、酵、熏、淋、曬等加工工藝，使山西陳醋含有豐富的營養(yǎng)與呈味物質(zhì)[4-5]，形成酸、綿、香、甜、鮮等標志風味。山西陳醋釀造是一個開放式，多微發(fā)酵的過程，大量微生物參與這一過程并不斷進行演替，對陳醋的品質(zhì)發(fā)揮重要作用[6]，有報道指出分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是揭示釀造過程代謝機理的重要手段[7]。因此，研究陳醋釀造過程中微生物動態(tài)變化對提高和改善食醋品質(zhì)具有重要意義。

目前，通過分離培養(yǎng)[8]和聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）[9]等方法研究陳醋釀造過程中的微生物已經(jīng)較成熟。但這些方法存在著一定缺陷，如分離培養(yǎng)方法由于培養(yǎng)環(huán)境與微生物實際生存環(huán)境不一樣等因素，不能使樣品中所有微生物都分離出來[9]，PCR-DGGE存在分辨率低、識別物種少等問題[10]。隨著高通量測序技術(shù)的普及與應(yīng)用，不僅提升了研究微生物群落組成的覆蓋率和效率[11]，也極大地拓寬了人們對微生物群落組成和演替的認識。在食醋領(lǐng)域通過高通量測序方法分析微生物群落的研究逐漸增加，在曬醋[12-14]、永春老醋[6]、浙江玫瑰醋[15]、鎮(zhèn)江香醋[16]、涼州熏醋[17]等均有應(yīng)用。高通量測序技術(shù)在陳醋中的應(yīng)用也有報道，夢燕華[18]和崔寧波[19]應(yīng)用高通量測序技術(shù)分別研究了陳醋釀造過程中的細菌多樣性和真菌多樣性，Zhu等[20]研究了釀造過程中的醋酸發(fā)酵階段的微生物變化，Nie等[21]系統(tǒng)探討了陳醋整個釀造階段的細菌和真菌多樣性。這些研究為認識陳醋釀造過程中微生物群落變化發(fā)揮了重要作用。

與之前的研究相比，本實驗選取山西陳醋發(fā)酵所用醋曲和發(fā)酵過程中的醋醅為研究對象，利用高通量測序技術(shù)不僅系統(tǒng)研究了山西陳醋發(fā)酵過程中細菌和真菌群落動態(tài)變化，同時也做了延伸，對酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段的差異菌屬進行了探討，為找出山西陳醋酒精釀造階段和醋酸釀造階段的標志微生物，以及下一步建立相應(yīng)的快檢方法和微生物標準體系來檢驗陳醋發(fā)酵有無異常提供了理論基礎(chǔ)和保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋曲、醋醅 于2021年4月～5月，在山西省陽泉市某醋廠采集同一生產(chǎn)批次使用的醋曲和醋醅樣品；Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer New England Biolabs公 司；GeneJET膠回收試劑盒 Thermo Scientific公司；CTAB基因組DNA提取試劑盒 北京百奧萊博科技有限公司；NaH2PO4、Na2HPO4均為分析純，天津博迪化工股份有限公司。

H2100R型臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司；MX-S型渦旋混合儀 北京佳航博創(chuàng)科技有限公司；S.SW-CJ-1FD型凈化工作臺 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SC-3614型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；NanoBio 200型超微量分光光度計 奧普天成（廈門）科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng) 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司；T100型PCR擴增儀 美國Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 醋曲樣品（C0）：生產(chǎn)所用曲塊粉碎之后，采用5點取樣法，充分混勻后取500 g置于無菌密封袋中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

醋醅樣品：分別取發(fā)酵第1 d（C1）、第3 d（C2）、第5 d（C3）、第7 d（C4）、第10 d（C5）、第13 d（C6）、第16 d（C7）、第20 d（C8）、第25 d（C9）醅樣，取樣點位置為醋醅表面下35 cm，采樣500 g置于無菌密封袋中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品預處理 樣品前處理方法參照文獻[22]進行，每個樣品設(shè)置3個平行處理。

1.2.3 樣品總DNA提取 采用CTAB法對樣品進行總DNA提取，將得到的總DNA通過1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測參數(shù)如下：Marker上樣量2 μL，樣品上樣量3 μL，電泳時間40 min，瓊脂糖濃度1.0%，電壓100 V。

1.2.4 PCR擴增和高通量測序 檢測DNA的純度和濃度合格后，以基因組DNA為模板，采用引物

341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）/805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）和1737F（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）/2043R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）分別對細菌16S rDNA V3～V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)基因序列進行PCR擴增。PCR擴增體系30 μL：Phusion Master Mix（2×）

15 μL，Primer（2 μmol/L）3 μL，gDNA（1 ng/μL）10 μL，ddH2O 2 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預變性1 min；98 ℃10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃，5 min。擴增結(jié)束后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物用GeneJET膠回收試劑盒回收。檢測合格的擴增產(chǎn)物通過北京諾禾致源科技股份有限公司Illumina NovaSeq 6000平臺進行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

下機數(shù)據(jù)首先去除barcode和引物序列，使用FLASH（V1.2.11）軟件進行雙端測序reads拼接。Fastp（V0.23.0）軟件進行質(zhì)控；Usearch（10.0.259）軟件去除嵌合體；利用QIIME2（版本 2021.8）軟件進行OTU（Operational Taxonomic Unit）劃分并進行物種注釋和Alpha多樣性分析；T-test通過R軟件（3.6.3）來實現(xiàn)；采用SPSS（IBM23）軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

采用Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)對山西陳醋發(fā)酵過程中微生物多樣性進行分析。由表1可知，分析比較Chao1指數(shù)可以看出，C1樣品與其他樣品相比，細菌群落和真菌群落的Chao1指數(shù)最大，說明醋曲樣品中所包含的細菌和真菌群落物種數(shù)最多；C2樣品的Chao1指數(shù)比C1樣品小，推測原因可能是由于發(fā)酵初期微生物不能完全適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，生長和繁殖受限所致[13]。分析比較Simpson指數(shù)可以看出，細菌Simpson指數(shù)在0.587±0.072～0.918±0.213波動，真菌Simpson指數(shù)在0.494±0.115～0.827±0.549波動，變化幅度雖然不大，但也說明真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)在發(fā)酵過程中發(fā)生變化[14]。從這兩個指數(shù)可以看出，山西陳醋發(fā)酵所用醋曲和醋醅的微生物群落的多樣性和豐富度具有差異性。

表1 細菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Bacterial and fungal Alpha diversity index

2.2 不同發(fā)酵階段Venn圖分析

參考相關(guān)文獻并結(jié)合本實驗發(fā)酵工藝及過程將樣品分為三組[17]。由于醋曲為糖化發(fā)酵劑[23]，富含的微生物是陳醋發(fā)酵的原動力，醋曲作為微生物發(fā)酵的起點，將醋曲樣品（C0）設(shè)為組R1、酒精發(fā)酵階段（C1～C4）設(shè)為組R2、醋酸發(fā)酵階段（C5～C9）設(shè)為組R3。

由圖1可知，在整個發(fā)酵過程中共檢測得到細菌OTU數(shù)為344個，不同階段的細菌OTU數(shù)為R1（77）＜R2（196）＜R3（275），存在于R1、R2和R3中特有細菌OTU數(shù)分別為14、48、131個，三個階段共有細菌OTU數(shù)為53個，R1和R2共有的細菌OTU數(shù)為60個，R2和R3共有的細菌OTU數(shù)最多，為141個，R1和R3共有的細菌OTU數(shù)最少，為56個。三個階段中，醋曲樣品中獲得的細菌OTU數(shù)最少，隨著發(fā)酵的進行，細菌OTU數(shù)逐漸增加，R2細菌OTU數(shù)達到了R1兩倍多，這可能是因為酒精發(fā)酵時，加入其它的原料，從而引入新的菌種[13]。其次，隨著酒精發(fā)酵的進行不斷涌現(xiàn)出新的菌種。在R3組中細菌OTU數(shù)最多，獨有細菌OTU數(shù)也最多。這表明參與醋酸發(fā)酵階段的細菌種類最為豐富，可能由于隨著發(fā)酵進行，一些數(shù)量低的微生物逐漸適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境而不斷富集，達到了被高通量測序檢測的閾值。

圖1 不同階段細菌Venn圖Fig.1 Venn diagram of bacteria at different stages

由圖2可知，在整個發(fā)酵過程中共檢測得到真菌OTU數(shù)為661個，不同階段的真菌OTU數(shù)為R1（50）＜R3（234）＜R2（523），分別存在于R1、R2和R3中特有的真菌OTU數(shù)為10、416、127個，三個階段共有的真菌OTU數(shù)為38個。R1和R2，R1和R3共有的真菌OTU數(shù)均為39個，R2和R3共有的真菌OTU數(shù)最多，為106個。三個階段中，醋曲樣品中獲得的真菌OTU數(shù)最少，酒精發(fā)酵階段中真菌OTU數(shù)最多達到峰值。這是因為經(jīng)過前期的糖化作用，酒精發(fā)酵階段養(yǎng)料充足，適合真菌生長繁殖，所以會使真菌種類數(shù)增多[15]。

圖2 不同階段真菌Venn圖Fig.2 Venn diagram of fungi at different stages

2.3 山西陳醋發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)演替分析

2.3.1 基于門水平細菌群落結(jié)構(gòu)演替分析 由圖3可知，不管是在醋曲樣品（C0）還是醋醅樣品（C1～C9）中，優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），在發(fā)酵階段一直存在，且這兩個菌門在每個樣本中相對豐度之和都達到了98%以上，其中，除了在C9節(jié)點中占主導地位的細菌菌門是變形菌門（Proteobacteria）外，其余樣本都是厚壁菌門（Firmicutes）占主導地位，且在C4節(jié)點中厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度達到最大值，為96.5%。厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）在酒精發(fā)酵階段，整體變化幅度不大，而在醋酸發(fā)酵階段，厚壁菌門（Firmicutes）呈下降趨勢。這一細菌含量變化規(guī)律與浙江玫瑰醋[15]研究結(jié)果類似，分析原因可能是山西陳醋在醋酸發(fā)酵前期階段，每天都會定時翻醅來提供氧氣，而變形菌門（Proteobacteria）中包含許多好氧型細菌[24]，翻醅就為這些細菌提供了有利生長環(huán)境，使其相對豐度在醋酸發(fā)酵階段呈上升趨勢，隨著發(fā)酵時間的延長逐漸占據(jù)主導地位，這與永春老醋發(fā)酵過程中變形菌門（Proteobacteria）的研究結(jié)果相似[6]。

圖3 陳醋發(fā)酵過程中門水平細菌相對豐度動態(tài)分析Fig.3 Dynamic analysis of phylum level bacterial relative abundance during fermentation of aged vinegar

2.3.2 基于屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)演替分析 如圖4，在醋曲（C0）中，優(yōu)勢物種為芽孢桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella），其相對豐度分別為20.7%和60.7%，還有少量的醋桿菌屬（Acetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）被檢出，分別占0.1%、1.8%和3.8%。魏斯氏菌屬（Weissella）有產(chǎn)β-葡糖苷酶的特性，能夠降解發(fā)酵原料中的纖維素[25]。同時它還具有產(chǎn)乳酸、產(chǎn)抑菌物質(zhì)等[26]特性。小麥是山西陳醋制曲中的主要原料之一，富含淀粉和纖維素[27]，這為魏斯氏菌屬（Weissella）的生長繁殖創(chuàng)造了有利條件，在制曲發(fā)酵過程中促使其成為絕對優(yōu)勢菌屬。芽孢菌屬（Bacillus）可賦予大曲豐富的酶系，如α-淀粉酶、蛋白酶等[28]，還會代謝產(chǎn)生許多氨基酸物質(zhì)，如L-酪氨酸等物質(zhì)[29]，對曲香的形成具有重要作用。

圖4 陳醋發(fā)酵過程中屬水平細菌相對豐度動態(tài)分析Fig.4 Dynamic analysis of relative abundance of genus level bacteria during fermentation of aged vinegar

在酒精發(fā)酵階段（C1～C4），乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）表現(xiàn)出此消彼長的變化趨勢。魏斯氏菌屬（Weissella）主要來源于醋曲，在此階段呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢，相對豐度從55.3%下降到6.4%，而乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度從24.4%上升到72.7%，表現(xiàn)出增長的趨勢，逐漸成為優(yōu)勢菌群。片球菌屬（Pediococcus）整體占比不大。但是，在此階段，隨著發(fā)酵的進行，其相對豐度不斷增加。葡萄球菌屬（Staphylococcus）、醋桿菌屬（Acetobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus）在此階段也被檢出，相對豐度整體變化幅度不大，說明這些菌屬在此階段處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。其中，葡萄球菌屬（Staphylococcus）是最常見的一類致病菌，可分泌毒素和酶引起假膜性腸炎等疾病[30]，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵的進行，其相對豐度最終下降到0.07%，含量極低。乳酸菌大部分是兼性厭氧或厭氧菌[31]，其代謝產(chǎn)物乳酸可以改善和調(diào)節(jié)陳醋風味，在發(fā)酵中還有調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)的作用[32]，在酒精發(fā)酵時，會把發(fā)酵缸內(nèi)的原料進行壓實，這樣除了表層接觸空氣外，內(nèi)部基本處于無氧狀態(tài)，適合乳酸菌生長繁殖，隨著酒精發(fā)酵的不斷進行，發(fā)酵缸內(nèi)的原料逐漸被利用，整個體系處于高乙醇環(huán)境，促使不耐高乙醇環(huán)境的細菌死亡[15]，乳桿菌屬（Lactobacillus）則不斷成為占據(jù)主導地位的絕對優(yōu)勢菌屬。

在醋酸發(fā)酵階段（C5～C9），乳桿菌屬（Lactobacillus）一直是優(yōu)勢菌屬，其相對豐度表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在C6發(fā)酵節(jié)點其相對豐度達到最大值，為81.2%；C8到C9時期，乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度下降，占比由76.8%下降到48.3%。魏斯氏菌屬（Weissella）在此階段一直下降，由4.8%下降到0.4%。這一結(jié)果表明隨著發(fā)酵進行魏斯氏菌屬（Weissella）逐漸無法適應(yīng)釀造環(huán)境。醋桿菌屬（Acetobacter）相對豐度隨著發(fā)酵的進行不斷上升，由C5節(jié)點的7.4%增加到C9節(jié)點的49.7%而成為整個體系的優(yōu)勢菌屬，這與鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中醋桿菌屬（Acetobacter）變化趨勢一致[16]。此外，不動桿菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）等菌屬也被檢出，這些菌屬雖然相對豐度很低，但始終穩(wěn)定存在于整個發(fā)酵過程中。有報道表明，不動桿菌屬（Acinetobacter）中有部分致病菌可以長期存在于醫(yī)療環(huán)境以及器械中，感染人體大腦、呼吸道等部位后，可引起腦膜炎、肺炎等相關(guān)疾病[33]，部分非致病菌可以分泌產(chǎn)生維生素和磷脂[34]等營養(yǎng)物質(zhì)。明串珠菌屬（Leuconostoc）中存在一小部分感染后使人引起敗血癥等疾病的致病菌[35]，部分非致病菌可以代謝產(chǎn)生多種酸和醇[36]等風味物質(zhì)。在本山西陳醋釀造工藝中，當酒精發(fā)酵結(jié)束后，會在每個發(fā)酵缸內(nèi)接入發(fā)酵第3 d的醋醅（引醅），之后幾天只是小面積的翻醅，內(nèi)部相對來說仍是處于無氧環(huán)境，乳桿菌屬（Lactobacillus）依舊可以生長，所以相對豐度會出現(xiàn)短期的上升，引醅之后，每天就會進行大面積的翻醅，確保醅料松散能夠通氧，同時發(fā)酵液中的酸度值也不斷降低，抑制乳桿菌屬（Lactobacillus）的生長，使其相對豐度下降，而醋桿菌屬（Acetobacter）是一類好養(yǎng)型菌屬，其代謝產(chǎn)生的醋酸是山西陳醋中有機酸的主要成分，每天的翻醅通氧有利于其生長代謝[18]，所以相對豐度逐漸升高而起到主導作用，成為影響陳醋品質(zhì)的優(yōu)勢菌屬。

2.4 山西陳醋發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)演替分析

2.4.1 基于門水平真菌群落結(jié)構(gòu)演替分析 圖5為真菌在門水平的時序動態(tài)變化。在整個過程中共檢出7個真菌門，其中優(yōu)勢菌門為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），子囊菌門（Ascomycota）在醋曲和之后的發(fā)酵過程中一直處于絕對優(yōu)勢地位，在醋曲（C0）中含量最高，相對豐度達到了98.9%。擔子菌門（Basidiomycota）在C1節(jié)點迅速繁殖，相對豐度達到最高，為14.1%，在此后的發(fā)酵過程中，擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度雖有所減少，但一直穩(wěn)定存在。這一結(jié)果表明該菌門真菌能夠適應(yīng)陳醋釀造環(huán)境，且對陳醋的釀造產(chǎn)生影響。

圖5 陳醋發(fā)酵過程中門水平真菌相對豐度動態(tài)分析Fig.5 Dynamic analysis on relative abundance of phylum level fungi during fermentation of aged vinegar

2.4.2 基于屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)演替分析 如圖6，在醋曲（C0）中，優(yōu)勢菌屬為伊薩酵母屬（Issatchenkia）、曲霉屬（Aspergilus）和米勒酵母屬（Millerozyma），相對豐度分別為43.7%、24.4%和19.1%。這一結(jié)果與清香型大曲相似，在清香型大曲發(fā)酵過程中伊薩酵母屬（Issatchenkia）和東方伊薩酵母菌（Issatchenkla orientalis）為絕對優(yōu)勢菌種[37]。此外，曲霉屬（Aspergilus）在大曲的發(fā)酵成熟時期起著重要的作用[26]，根據(jù)之前的報道，利用高通量測序分析大米曲、糯米曲、玉米曲、小麥曲和高粱曲的真菌群落結(jié)構(gòu)時，曲霉屬在這五種曲中都有被檢出[38]，與本研究結(jié)果相近。

圖6 陳醋發(fā)酵過程中屬水平真菌相對豐度動態(tài)分析Fig.6 Dynamic analysis of relative abundance of genus level fungi during fermentation of aged vinegar

在酒精發(fā)酵階段（C1～C4），伊薩酵母屬（Issatchenkia）和曲霉屬（Aspergilus）仍然是主要的優(yōu)勢菌屬。伊薩酵母屬（Issatchenkia）在酒精發(fā)酵前期（C1和C2）呈現(xiàn)上升趨勢，相對豐度由43.8%上升到67.2%，之后進入穩(wěn)定期，無明顯變化?，F(xiàn)有報道指出，酵母菌屬（Saccharomyces）是陳醋酒精發(fā)酵階段的主要真菌菌屬[19,21]，與本研究結(jié)果有差異，推斷原因可能為陳醋生產(chǎn)所用原料不同所致。伊薩酵母屬（Issatchenkia）是一種比較重要的非釀酒酵母，因在發(fā)酵時具有耐乙醇、耐酸和耐高溫以及能代謝產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯的特點[39]而受到人們關(guān)注，發(fā)酵前期原料相對充分，有利于酵母代謝，所以該菌屬迅速繁殖，出現(xiàn)短暫上升，隨著發(fā)酵的進行，微生物適應(yīng)了體系的環(huán)境，便會趨于穩(wěn)定[40]。曲霉屬（Aspergilus）在此階段波動變化，相對豐度維持在6.7%～23.6%之間，該菌屬能夠產(chǎn)生糖化酶、淀粉酶[41-42]，對原料中的淀粉起到很好的糖化作用，相關(guān)研究表明曲霉屬（Aspergilus）還與異戊醇、異丁醇、乙酸乙酯等風味物質(zhì)有關(guān)[43]。此外，小菇屬（Mycena）只有在這個階段被檢出，小菇屬真菌最主要的作用是用于人工栽培天麻的萌發(fā)真菌類群，近些年，因具有食用、藥用價值而被人們所關(guān)注[44]。

在醋酸發(fā)酵階段（C5～C9），伊薩酵母屬（Issatchenkia）仍然是主要菌屬，在此階段呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在C6發(fā)酵節(jié)點，相對豐度達到峰值，占比為81.3%。由于霉菌的細胞壁結(jié)構(gòu)為：外層β-葡聚糖，中層糖蛋白，內(nèi)層幾丁質(zhì)；酵母的細胞壁結(jié)構(gòu)為：內(nèi)層為葡聚糖層，中間層主要由蛋白質(zhì)組成，外層為甘露聚糖層，在酸性條件下這種“三明治型”細胞壁結(jié)構(gòu)仍能穩(wěn)定存在而不被破壞[45]，所以，伊薩酵母屬（Issatchenkia）和曲霉屬（Aspergilus）在醋酸發(fā)酵階段仍能存在。小菇屬（Mycena）在此階段并未檢出，可能醋酸發(fā)酵階段的高酸性環(huán)境并不適合其生長繁殖，還有一些相對豐度雖然較低的菌屬，但是適應(yīng)環(huán)境的能力較強，在整個發(fā)酵過程中都有被檢出，如米勒酵母屬（Millerozyma）、枝孢屬（Cladosporium）、棒孢酵母屬（Clavispora）、假絲酵母屬（Candidia）等，這些菌屬在釀造中也發(fā)揮了作用，如枝孢屬（Cladosporium）可以產(chǎn)纖維素酶[46]，假絲酵母屬（Candidia）有很好的發(fā)酵能力和耐酒精能力，可以水解還原糖生成乙醇，乙酸乙酯和檸檬酸等物質(zhì)[47]。

2.5 兩大發(fā)酵階段差異菌屬篩選

據(jù)之前報道，Zhu等[20]將山西陳醋醋發(fā)酵階段分為前期、中期和末期三個時期，并找出這三個時期的差異顯著細菌菌屬，進一步加深了人們對醋酸發(fā)酵階段的認識。目前對酒精發(fā)酵階和醋酸發(fā)酵階段的潛在差異菌屬的研究較少。針對這一關(guān)鍵問題，本研究進行組間T-test分析，將進一步研究找出這兩大釀造階段的潛在差異顯著菌屬。由圖7和圖8可知，兩大發(fā)酵階段（R2表示酒精發(fā)酵階段，R3表示醋酸發(fā)酵階段）在屬水平共發(fā)現(xiàn)6個差異顯著菌屬，其中包括5個細菌菌屬和1個真菌菌屬，分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、土芽孢桿菌屬（Geobacillus）和曲霉屬（Aspergillus）。

圖7 細菌群落結(jié)構(gòu)的T-test分析Fig.7 T-test analysis of bacterial community structure

圖8 真菌群落結(jié)構(gòu)的T-test分析Fig.8 T-test analysis of fungal community structure

3 結(jié)論

本研究通過以山西陳醋發(fā)酵所用醋曲和醋醅為研究對象，利用高通量測序技術(shù)對樣本細菌16S rDNA V3～V4區(qū)域和真菌ITS1區(qū)域進行檢測，從而對山西陳醋釀造過程中的微生物動態(tài)變化進行探究。結(jié)果表明，在醋曲（R1）中，主要的細菌菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella），主要真菌菌屬為伊薩酵母屬（Issatchenkia）、曲霉屬（Aspergilus）和米勒酵母屬（Millerozyma）。其中，芽孢桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）為醋曲賦予了α-淀粉酶、蛋白酶等豐富的霉系，對曲香的形成發(fā)揮了重要的作用。因此，在制作醋曲時應(yīng)注重對這些菌屬的檢測以保證醋曲的質(zhì)量。在酒精發(fā)酵階段（R2），乳桿菌屬（Lactobacillus）逐漸減少，魏斯氏菌屬（Weissella）逐漸增多，伊薩酵母屬（Issatchenkia）和曲霉屬（Aspergilus）是主要的真菌菌屬，特別地，小菇屬（Mycena）僅在此階段被檢出，其在酒精發(fā)酵的代謝機理不明確，仍需進一步探討。在醋酸發(fā)酵階段（R3），乳桿菌屬（Lactobacillus）和醋桿菌屬（Acetobacter）是主要細菌菌屬，伊薩酵母屬（Issatchenkia）仍然是主要真菌菌屬，枝孢屬（Cladosporium）、假絲酵母屬（Candidia）等菌屬雖然相對豐度較低，卻存在于整個發(fā)酵過程，對陳醋的品質(zhì)發(fā)揮作用，后續(xù)進一步重視對這些低豐度菌屬的研究。通過T-test分析發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬（Staphylococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、土芽孢桿菌屬（Geobacillus）和曲霉屬（Aspergillus）為酒精發(fā)酵階段和醋酸發(fā)酵階段的差異菌屬，為下一步建立快檢方法奠定了基礎(chǔ)，也為山西陳醋產(chǎn)品的發(fā)展和品質(zhì)革新提供了理論支撐。