孟 欣，艾國峰，姜國濤，謝克毅，姜愛莉

（煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005）

甲殼素（C8H13O5N）n，又稱甲殼質(zhì)，由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷鍵縮合而成，廣泛存在于甲殼動物、軟體動物的骨骼、昆蟲外殼及真菌的細(xì)胞壁中[1-2]。天然甲殼素的溶解性能較差，導(dǎo)致其應(yīng)用受到極大限制。殼聚糖（chitosan）作為甲殼素脫除N-乙?；蟮漠a(chǎn)物[3-4]，其溶解性得到極大改善，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生[5]、食品工業(yè)[6]、輕紡工業(yè)[7]和農(nóng)業(yè)[8]。

目前工業(yè)及研究中利用甲殼素生產(chǎn)殼聚糖的方法主要采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，不僅消耗大量試劑，而且對環(huán)境造成嚴(yán)重污染，增加了后續(xù)污染物的處理成本。而利用生物法酶解甲殼素獲得殼聚糖，得到較高品質(zhì)殼聚糖產(chǎn)物的同時，避免了強(qiáng)酸強(qiáng)堿的使用，實現(xiàn)了環(huán)境友好的目標(biāo)。甲殼素脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）（E.C.3.5.1.41），專一脫除甲殼素中N-乙?；鵞9-10]，將甲殼素轉(zhuǎn)化為殼聚糖。目前，利用生物酶法制備殼聚糖已經(jīng)成為甲殼素工業(yè)應(yīng)用最具發(fā)展前景的技術(shù)之一[11]。現(xiàn)階段的甲殼素脫乙酰酶微生物來源較窄，真菌以魯氏毛霉[12]、構(gòu)巢曲霉[13]、藍(lán)色犁頭霉[14]等為主，細(xì)菌主要包括芽孢桿菌[15-16]、弧菌[17]等。目前甲殼素脫乙酰酶價格較為昂貴[10-18]，而且產(chǎn)量有限，難以進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用，因此，篩選產(chǎn)CDA性能優(yōu)良的新菌種仍是解決CDA工業(yè)化應(yīng)用的重要課題之一[19]。

本研究前期發(fā)現(xiàn)一瓶自然發(fā)酵的蝦皮具有較高的固體溶解率，從中選擇篩選能夠降解天然甲殼素的菌株，以產(chǎn)酶活力和甲殼素脫乙酰度為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，鑒定產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌種 將蝦皮洗凈后干燥，埋于校園楊樹根部土壤，用于自然富集產(chǎn)甲殼素脫乙酰酶的微生物，數(shù)月后取出土樣；甲殼素 上海麥克林生物化工有限公司；對硝基-N-乙酰苯胺 生物試劑，上海源葉生物有限公司；NaCl、K2HPO4、MgSO4等試劑 均為分析純。

D-1 型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；BCM-1000A 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHZB-500 細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱 江蘇科析儀器有限公司；MQD-B3R 三層組合式搖床培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋

常州國華電器有限公司；SCIENTZ-IID 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；ZD-2 自動電位滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實驗培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：甲殼素2.0 g，對硝基-N-乙酰苯胺

1.0 g，NaCl 0.05 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，F(xiàn)e2(SO4)30.001 g，瓊脂 2.0 g，去離子水 100 mL，pH7.2。

富集培養(yǎng)基：甲殼素 2.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaCl 0.05 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，F(xiàn)e2(SO4)30.001 g，瓊脂 2.0 g，去離子水 100 mL，pH7.2。

斜面培養(yǎng)基：蔗糖 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaCl 0.05 g，MgSO40.01 g，瓊脂 2.0 g，去離子水 100 mL。

復(fù)篩培養(yǎng)基：甲殼素2.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.05 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，F(xiàn)e2(SO4)30.001 g，去離子水 100 mL，pH7.3。

種子培養(yǎng)基：蔗糖1.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.05 g，MgSO40.01 g，去離子水100 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甲殼素3.0 g，(NH4)2SO40.3 g，

NaCl 0.05 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.02 g，NaHPO40.6 g，去離子水100 mL，pH7.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 初篩培養(yǎng) 采用平板涂布法[20]。稱取10 g自然發(fā)酵的蝦皮，放入裝有90 mL無菌水（含玻璃珠）的錐形瓶中，充分振蕩后用無菌水按梯度稀釋，分別吸取10-3、10-4、10-5梯度的稀釋液200 μL，涂布于初篩培養(yǎng)基，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。產(chǎn)CDA的菌株周圍會出現(xiàn)黃色，根據(jù)顯色圈的深淺判斷產(chǎn)酶能力的高低。挑取菌落周圍顯黃色的菌株，于富集培養(yǎng)基進(jìn)一步劃線分離純化至得到單一菌落，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中保存。

1.3.2 復(fù)篩培養(yǎng) 初篩培養(yǎng)基中篩選出來的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩[20]，300 mL錐形瓶中裝入復(fù)篩發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，30 ℃，180 r/min培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在室溫條件下于8000 r/min離心15 min，所得上清液即為胞外 CDA酶粗酶液；離心后剩余的底部濕潤固體平均分為兩部分，一部分用無菌水洗滌數(shù)次后進(jìn)行冷凍干燥，干燥后加入冷Tris-HCl緩沖液進(jìn)行細(xì)胞破碎，8000 r/min離心10 min，上清液為胞內(nèi)CDA粗酶液[21]；另一部分用于測定脫乙酰度（degree of deacetylation，DD）。每個菌株做3組平行。根據(jù)酶活力和DD的高低，篩選出降解甲殼素能力較高的菌株。

1.3.2.1 CDA酶活測定 比色管中加入0.05 mol/L、50 ℃ 預(yù)保溫的磷酸鹽緩沖液3 mL，200 mg/L對硝基-N-乙酰苯胺1 mL，粗酶液1 mL，50 ℃ 水浴反應(yīng)15 min后沸水浴終止反應(yīng)，用去離子水定容至10 mL，8000 r/min離心10 min，于400 nm處測定上清液的OD值。以相同濃度高溫滅活的粗酶液為空白[21]。酶活按照公式（1）計算，上述反應(yīng)條件下每小時產(chǎn)生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位。

式中：A400：酶解液樣品的吸光值；A0：空白的吸光值；T：酶促反應(yīng)時間，h；k：線性系數(shù)（0.0648）。

1.3.2.2 脫乙酰度（DD）的測定 發(fā)酵液離心后的底部濕潤固體，40 ℃烘干，準(zhǔn)確稱量2.0 g干燥固體，加入過量的HCl溶解，用0.5 mol/L的NaOH溶液滴定，每0.25 mL記錄一次pH，在pH突躍點附近縮小間隔改以滴加0.1 mL記錄一次[22]。作pH-V電位滴定曲線，找出兩個突躍點，按公式（2）計算脫乙酰度：

式中：ΔV：兩個“突躍點”之間消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；c1：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；10-3：單位換算系數(shù)；16：氨基的摩爾質(zhì)量，g/mol；m1：試樣質(zhì)量，g。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌落形態(tài)和菌體染色制片參考《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]和《微生物學(xué)分類》[24]，顯微鏡下觀察菌株X4的形態(tài)特征并對其進(jìn)行初步鑒定。

1.3.3.2 菌株X4分子鑒定 菌株X4由煙臺鑫晟諾生物工程有限公司進(jìn)行16S rRNA測序。序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，分析該菌株與其他菌株的同源性，并結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，對菌株X4進(jìn)行分類鑒定。

1.3.4 菌株X4種子生長曲線 從X4菌株斜面上挑取2環(huán)菌苔接入種子培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔1 h測定600 nm處菌液的OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.5 菌株X4發(fā)酵生長曲線和產(chǎn)酶曲線 接種對數(shù)生長期的種子液至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔24 h取樣，采用顯微鏡直接計數(shù)法測定發(fā)酵液中菌株X4的生物量，以不同培養(yǎng)時間X4生物量為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線。同時測定甲殼素脫乙酰酶酶活并繪制出菌株X4產(chǎn)酶曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實驗組設(shè)置三個平行，實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示，采用SPSS軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩

微生物產(chǎn)生的CDA可脫除對硝基-N-乙酰苯胺（無色）的N-乙酰基，使之轉(zhuǎn)化為黃色的對硝基苯胺[25]，該特性可用于產(chǎn)CDA菌株的篩選。通過含有對硝基-N-乙酰苯胺的平板篩選得到6株可以使平板變色的菌株，平板初篩及顯色情況見圖1和表1。其中菌株X4的平板培養(yǎng)基顯色最為明顯，說明該菌株產(chǎn)脫乙酰酶的能力最強(qiáng)。

表1 菌株平板培養(yǎng)基顯色情況Table 1 Color of strains in plate culture medium

圖1 菌株初篩平板培養(yǎng)基Fig.1 Initial screening plate of strains

2.2 搖瓶復(fù)篩

2.2.1 六株菌的CDA酶活 將6株菌分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，測定粗酶液中的CDA酶活

（圖2）。結(jié)果表明，6株菌的胞內(nèi)酶活顯著高于胞外酶活（P＜0.05），說明菌株主要是以產(chǎn)胞內(nèi)CDA為主。菌株X4、X5產(chǎn)胞內(nèi)酶能力較好，菌株X4與其他菌株相比產(chǎn)胞內(nèi)酶活最為突出（P＜0.05），培養(yǎng)5 d后酶活可達(dá)到8.210 U/mL，說明菌株X4具有較強(qiáng)的開發(fā)潛力。

圖2 六株菌的胞內(nèi)酶、胞外酶活力Fig.2 Extracellular and intracellular enzyme activities of six strains

2.2.2 菌株對甲殼素的脫乙酰度 將6株菌分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，測定甲殼素脫乙酰度（圖3）。結(jié)果表明，六株菌均具有脫除甲殼素脫乙?；哪芰?，不同菌株對甲殼素的脫乙酰度具有顯著性差異（P＜0.05），6株菌甲殼素的脫乙酰度分別為7.289%、8.865%、8.872%、8.642%、10.646%和7.545%，菌株X5對甲殼素的脫乙酰度顯著高于其他五株菌（P＜0.05）。綜合CDA酶活測定結(jié)果，選定菌株X4進(jìn)行16S rRNA序列分析和生化鑒定，并進(jìn)一步研究其產(chǎn)酶情況。

圖3 六株菌的甲殼素脫乙酰度Fig.3 Chitin deacetylation degree of six strains

2.3 菌株X4的菌種鑒定

2.3.1 菌株X4形態(tài)學(xué)觀察 菌株X4在富集培養(yǎng)基上生長迅速，菌落呈土黃色，背面呈褐黃色，菌落表面濕潤（圖4a）。通過革蘭氏染色對其鏡檢（圖4b）發(fā)現(xiàn)，該菌為革蘭氏陽性菌，結(jié)構(gòu)呈短桿狀。

圖4 菌株X4的形態(tài)學(xué)特征Fig.4 Morphological characteristics of strain X4

2.3.2 菌株X4分子鑒定 對菌株X4進(jìn)行16S rRNA測序，將測序所得基因序列在NCBI上通過BLAST比對后，初步鑒定得出X4為賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillussp.）。采用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），菌株X4與Lysinibacillus louembei在同一分支，表明二者親緣關(guān)系最近，進(jìn)一步證明菌株X4為賴氨酸芽孢桿菌。

圖5 基于菌株X4 16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain X4

2.4 菌株X4種子生長曲線

由圖6可知，菌株X4在培養(yǎng)前期，隨著培養(yǎng)時間的延長，種子液中的菌體密度逐步提高，培養(yǎng)至15 h，種子液中的菌體密度達(dá)到峰值，隨后隨著培養(yǎng)時間的進(jìn)一步延長，種子液中的菌體密度趨于穩(wěn)定并略有下降趨勢。生長曲線表明菌株X4接種5 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，11 h到19 h菌株處于穩(wěn)定期，從20 h后開始進(jìn)入衰亡期。根據(jù)菌株X4的生長曲線，發(fā)酵產(chǎn)酶生產(chǎn)時，以培養(yǎng)8 h的培養(yǎng)液作為種子液最佳。

圖6 菌株X4生長曲線Fig.6 Growth curve of strain X4

2.5 菌株X4發(fā)酵生長及產(chǎn)酶曲線

微生物的生長極易受到外界環(huán)境的影響，由圖7可知，將菌株X4接種于以（NH4）2SO4為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中時，其生長速度慢于以蛋白胨為氮源的種子培養(yǎng)基，但隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株X4的菌體密度逐步提高，可以迅速利用發(fā)酵底物進(jìn)行產(chǎn)酶。菌株產(chǎn)酶呈現(xiàn)穩(wěn)步增長的趨勢，培養(yǎng)至120 h時，其胞內(nèi)和胞外酶活分別達(dá)到1.564、 1.461 U/mL。與復(fù)篩時相比，酶活明顯下降，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，胞外酶活呈現(xiàn)出下降趨勢，可能是因為產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的變化、菌體的生長進(jìn)入了平穩(wěn)期且開始出現(xiàn)衰亡、酶產(chǎn)物的累積和發(fā)酵體系pH發(fā)生[26]改變導(dǎo)致。

圖7 菌株X4生長和產(chǎn)酶曲線Fig.7 Time course of growth and enzyme formation of strain X4

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)外關(guān)于產(chǎn)CDA酶菌株的報道較多，大部分為真菌。菌株產(chǎn)酶能力及CDA酶的活力是其工業(yè)應(yīng)用的重要前提，以產(chǎn)CDA的菌株為對象進(jìn)行的產(chǎn)酶發(fā)酵技術(shù)也是目前CDA研究的熱點領(lǐng)域[27-28]。但是，目前大多數(shù)研究仍以膠體甲殼素作為發(fā)酵底物，針對天然甲殼素的研究相對較少。

本研究以天然甲殼素為發(fā)酵底物，對菌株X4進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)CDA酶活不高，后期可以考慮從以下幾方面對菌株進(jìn)行馴化處理，并優(yōu)化其發(fā)酵條件：其一，進(jìn)行紫外誘變[28]，獲得高產(chǎn)菌株。陳虹等[29]利用紫外線作為誘變劑處理霉菌，經(jīng)誘變后的菌株產(chǎn)CDA的酶活力達(dá)到了88.2%；秦汪艷[30]以絲狀真菌Penicillium janthinellumUV-0S為出發(fā)菌株，紫外誘變處理其孢子液，結(jié)果表明誘變后菌株的CDA酶活是誘變前的2.13倍。其二，對菌株進(jìn)行基因工程改造[18]，如利用大腸桿菌作為載體，將該菌株的產(chǎn)酶方式由胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為胞外。其三，利用誘導(dǎo)的方式，通過添加產(chǎn)酶誘導(dǎo)物[31-33]，提高CDA產(chǎn)量并縮短發(fā)酵周期。

本文以天然甲殼素作為唯一碳源，從自然發(fā)酵的蝦皮中篩選得到1株具備高產(chǎn)CDA潛力的菌株X4，通過形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA序列分析，初步確定其為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.）。對該菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其胞內(nèi)CDA酶活達(dá)到8.210 U/mL，對發(fā)酵底物甲殼素的脫乙酰度為8.641%。將該菌株培養(yǎng)8 h的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)至120 h后胞內(nèi)酶活為1.564 U/mL，胞外酶活為1.461 U/mL。由于天然甲殼素難以被CDA利用和酶本身的復(fù)雜性，本實驗分離得到的菌株所產(chǎn)CDA的作用機(jī)制和特征還有待進(jìn)一步的研究。