孟凡徳，史學(xué)偉

（1.新疆兵團(tuán)第五師科技局，新疆博樂 833400；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

梅奇酵母（Metschnikowia）是一種廣泛存在葡萄 表皮的野生酵母，主要作用于葡萄酒發(fā)酵前期[1]，可增加葡萄酒香氣等風(fēng)味物質(zhì)，有效抑制葡萄酒“變質(zhì)”[2]。氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一種多位點(diǎn)2A級[3]致癌物。早在50多年前，Lofroth等首次在啤酒中檢測到氨基甲酸乙酯[4]，而后許多研究中，在白蘭地、葡萄酒[5]和中國黃酒等酒精飲料[6]均有發(fā)現(xiàn)。參與EC合成的前體物質(zhì)主要是氨甲酰基團(tuán)，如尿素、瓜氨酸和氨甲酰磷酸[7]等。EC代謝途徑一般分為三種，分別是：尿素與乙醇、瓜氨酸及氰化物途徑，其中尿素與乙醇的反應(yīng)是最為常見的氨基甲酸乙酯生成途徑[8]。除此以外，酵母菌通過氮代謝分解精氨酸可以間接控制EC形成[9]。

通過添加酸性脲酶來[10-11]控制EC前體物質(zhì)的形成、調(diào)控EC形成條件和水解法降低EC含量可以控制酒類飲料中EC形成。相對于梅奇酵母的研究大都集中于在釀造過程與釀酒酵母（Saccharomyces uvarum）混菌發(fā)酵生產(chǎn)低醇葡萄酒[12-13]，部分學(xué)者篩選一株可以降解EC的釀酒酵母[14]，同時(shí)對篩選可降解EC的菌株優(yōu)化了其產(chǎn)酶條件[15-17]。除此以外，對于降低酒精飲料中EC研究報(bào)道也層出不窮。程艷等[18]利用高通量誘變降低EC前體物質(zhì)從而降低其含量，吳殿輝[19]對黃酒專用的釀酒酵母的基因組進(jìn)行改造降低EC含量。通過微生物酶解降低葡萄酒中EC含量的方法是一種安全、有效、綠色的方法，但是由于不同酒體的環(huán)境條件不同，具有降解EC能力的菌株呈現(xiàn)出較低的發(fā)酵性能，難以在葡萄酒的釀造中使用，并且分離純化釀酒酵母后所產(chǎn)的EC降解酶在高乙醇、低酸條件下，酶的活性往往會(huì)受到明顯地抑制。綜上所述，篩選EC降解菌及分離純化高耐酸性、高乙醇耐受性的EC降解酶在目前來說具有重要的意義。

頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）在環(huán)境檢測[20]、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)[21]和農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測[22]、測定葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分含量測定[23]時(shí)作為首選檢測技術(shù)。本研究以前期實(shí)驗(yàn)室報(bào)道出的一株具有較好的EC降解能力[24]的魯考弗梅奇酵母菌（Metschnikowia reukaufii）為研究對象，采用硫酸銨鹽析、離子交換層析方法對該酵母菌所產(chǎn)的EC酶進(jìn)行分離純化，并進(jìn)一步研究該降解酶的酶學(xué)性質(zhì)，為該菌株產(chǎn)EC的工業(yè)化生產(chǎn)及EC酶在后期處理葡萄酒中EC的使用提供理論借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

供試葡萄酒 新疆張?jiān)０捅つ芯艟魄f（MR）和新疆西域明珠酒莊（SR）；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、牛血清蛋白 天津盛奧化學(xué)試劑有限公司；NaCl、KH2SO4、Na2SO4、CH3OH、NaOH、HCl、檸檬酸、檸檬酸鈉、（NH4）2SO4、Na2HPO4奧博星生物技術(shù)公司；CH3CH2OH（99%）、乙醚（90%）、丙酮

天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氨基甲酸乙酯、D5-氨基甲酸乙酯（99.9%） Sigma公司；上述試劑除特別標(biāo)明以外，均為分析純；3-辛醇（99%） 北京索萊寶科技有限公司；正構(gòu)烷烴混標(biāo)（C7～C33） 廣州威佳科技有限公司。

722光柵分光光度計(jì) 上海精若科學(xué)儀器有限公司；VCX500超聲細(xì)胞破碎儀 Sonics & Materials. Ins；PS2001瓊脂糖凝膠電泳儀、Gel DC XR凝膠成像系統(tǒng) 北京六一生物科技有限公司；FRESCO 21低溫高速離心機(jī) Thermo Fisher Scientific；Agilent7890B GC與Agilent5977 MS檢測器、HP-5 Innowax毛細(xì)管柱 安捷倫分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液制備 參考劉曉慧[25]的方法。吸取1 mLMetschnikowia reukaufii菌種保藏液于50 mL活化培養(yǎng)基（蛋白胨1.0 g/L、葡萄糖2.0 g/L、酵母浸粉2.0 g/L，氨基甲酸乙酯5.0 g/L）中，28 ℃恒溫連續(xù)培養(yǎng)24 h。以1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基[26]（麥芽糖15.0 g/L，NH4Cl 5.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氨基甲酸乙酯7.5 g/L）中，以相同條件培養(yǎng)。以2%的接種量將處于對數(shù)生長期的種子液接種到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、170 r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h，以制得發(fā)酵液。

發(fā)酵液在低溫條件下，6000 r/min離心10 min棄上清液收集菌體。用0.05 mol/L、pH3.0～7.0檸檬酸緩沖液沖洗菌體，離心收集菌體，重復(fù)操作2次后得到菌體，再次以適量體積檸檬酸緩沖液洗滌菌體于冰浴中超聲破碎細(xì)胞30 min，4 ℃、8000 r/min離心10 min，此時(shí)上清液即為粗酶液。

1.2.2 EC酶的分離純化 采用楊廣明[27]和張美珍等[28]的方法并做了部分改進(jìn)。取50 mL粗酶液，向其中緩慢分別加入60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%（NH4）2SO4，充分混勻，4 ℃靜置過夜沉淀。4 ℃、8000 r/min離心5 min，得到沉淀后加少量蒸餾水復(fù)溶，透析袋透析48 h，每8 h換一次水直至完全去除（NH4）2SO4。使用Hitrap DEAE FF預(yù)裝柱進(jìn)行離子交換層析，0.2 mol/L、pH7.9的PBS緩沖液進(jìn)行平衡，加入1 mol/L NaCl于PBS緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。

洗脫液使用超濾管進(jìn)行快速濃縮，之后使用凝膠層析法進(jìn)行最終酶的純化，該步驟使用Superdex 200凝膠柱。對純化后的EC酶進(jìn)行酶活的測定。

1.2.3 粗酶酶活及蛋白含量的測定 對1.2.1中粗酶液中粗酶及分離純化后EC酶的酶活進(jìn)行測定。酶活測定參照周雪燕等[16]的方法，采用Berthelot比色法。其中將常溫常壓下1 min分解相應(yīng)底物產(chǎn)生1 μmol氨的酶量為1個(gè)酶的活力單位稱之為酶活[17]。

對粗酶液中粗酶的蛋白質(zhì)含量測定參照Bradford[29]和丁霞等[30]方法，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒對蛋白含量進(jìn)行測定。

1.2.4 EC酶酶學(xué)性質(zhì)測定 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性：將純化后的降解酶分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃的不同溫度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)測定酶活，測定酶的最適反應(yīng)溫度。將降解酶置于上述溫度區(qū)間下恒溫30 min，將其轉(zhuǎn)移到最適溫度下進(jìn)行酶活的測定，確定EC酶的熱穩(wěn)定性。

最適pH及pH穩(wěn)定性：在最適溫度下，將酶置于3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的不同pH條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)測定酶活，得到降解酶的最適pH。將降解酶置于上述pH梯度下，以最適溫度恒溫30 min后測定酶活，研究降解酶的pH穩(wěn)定性。

乙醇耐受性試驗(yàn)：在最適pH條件下配制1%、3%、5%、7%、9%、12%、15%、18%的不同濃度的乙醇溶液，添加3% EC作為底物和3%的EC酶，測定反應(yīng)時(shí)的酶活。

1.2.5 EC酶對不同底物降解能力研究 參考谷曉蕾等[31]方法，在最適溫度和最適pH的條件下，在0.05 mol/L、pH3.0～7.0的檸檬酸緩沖液分別添加3%的氨基甲酸乙酯、尿素、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和瓜氨酸為底物，加入3% EC酶。取1 mL于比色管，50 ℃水浴反應(yīng)30 min, 測定OD625值。

1.2.6 EC酶對揮發(fā)性香氣物質(zhì)影響研究 將提取純化后的EC酶以3%的接種量接種至市售干紅葡萄酒中進(jìn)行反應(yīng)，24 h后測定相關(guān)成分。添加了EC酶的葡萄酒為實(shí)驗(yàn)組，未添加的市售干紅葡萄酒酒樣為對照組。

參考孫娜等[32]作改性方法，采用HS-SPMEGC-MS法測定市售干紅葡萄酒中揮發(fā)性香氣成分，并對其進(jìn)行定性定量分析。稱取1 g NaCl和5 mL加入酒樣于10 mL頂空瓶中，同時(shí)加入2 μL 1 μg/L 3-辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品在45 ℃平衡20 min，恒溫以500 r/min持續(xù)60 min，萃取結(jié)束解吸5 min。使用Agilent7890B GC與Agilent5977 MS檢測器與HP-5 Innowax毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）進(jìn)行檢測。進(jìn)樣口溫度設(shè)定為230 ℃，氦氣作為載氣，流速設(shè)定為1.0 mL/min。將GC爐溫度保持在40～180 ℃，3 mL/min，5 min時(shí)上升到230 ℃。在離子源溫度270 ℃、電子能源70 eV時(shí)，獲得電子沖擊質(zhì)譜，總離子色譜儀（TICs）掃描范圍為35～500 m/z，速率5次/s。

定性分析：根據(jù)化合物保留指數(shù)RI（Retention Index，RI）（≥800）及NIST14譜庫檢索處理初步確定揮發(fā)性成分名稱。其中，通過正構(gòu)烷烴（C7～C33）混標(biāo)物的保留時(shí)間來計(jì)算未知化合物的RI值，保留指數(shù)根據(jù)改進(jìn)的Kovats法計(jì)算得到[33]。

定量分析：以3-辛醇為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度根據(jù)公式（1）計(jì)算[34]。

式中：X：香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/L；A：所測峰面積；A0：內(nèi)標(biāo)物峰面積；C：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差顯示，采用Smica 14.1和Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖分析，R語言用做聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化前后EC酶酶活及蛋白含量變化

采用Berthelot比色法對分離到含有EC酶的粗酶液進(jìn)行酶活測定，分別比較了純化前后的酶活及蛋白含量的變化（圖1）。純化前酶活0.16 U/mL，純化后酶活提高至0.35 U/mL；與之相反，純化前蛋白含量4.43 mg/L，純化后蛋白含量降低至2.62 mg/L。結(jié)果表明，經(jīng)過純化后的EC酶酶活提高了約1.2倍，而蛋白含量大約降低了0.4倍，這主要是因?yàn)槠咸丫浦械拿复蠖鄶?shù)屬于是蛋白質(zhì)，在純化除去其他酶后，酶含量有所降低。

圖1 純化前后EC酶的相對酶活（A）和蛋白含量（B）的變化Fig.1 Changes of the relative enzyme activity (A) and protein content (B) of EC enzymes before and after purification

2.2 EC酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 EC酶的最適溫度及熱穩(wěn)定分析 通過測定EC酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明，EC酶的酶活性和穩(wěn)定性受不同溫度的影響較大（圖2）。Metschnikowia reukaufii菌株所產(chǎn)EC酶最適作用溫度為35 ℃，在該溫度下酶活達(dá)到了0.52 U/mL，并且在25～45 ℃范圍內(nèi)，EC酶酶活高于0.28 U/mL，且熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，這同之前所報(bào)道的結(jié)果相一致[35]。當(dāng)溫度持續(xù)30 min后在35 ℃時(shí)EC酶酶活達(dá)到0.51 U/mL，酶活降低速率極低，幾乎可以忽略不計(jì)。結(jié)果表明，EC酶最適作用溫度為35 ℃，熱穩(wěn)定性強(qiáng)。在后期使用中可將EC酶加入成品葡萄酒中置于35 ℃時(shí)，該酶可發(fā)揮的降解作用最大。

圖2 酶作用的最適溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）Fig.2 Optimum temperature (A) and thermal stability (B) of enzyme action

2.2.2 EC酶的最適pH及pH穩(wěn)定性分析 在釀酒過程中控制其初始pH可降低EC含量[36]，通過對比EC酶的最適pH及pH穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)（圖3）：當(dāng)pH處于5～6之間時(shí)，EC酶的酶活能夠保持在0.30 U/mL以上。當(dāng)pH為5.5時(shí)酶活最高，高達(dá)0.52 U/mL；當(dāng)pH大于7.0時(shí)，酶的活性受抑制作用比較明顯，酶活接近于0，失去活性。與此同時(shí)，當(dāng)EC酶在pH5.5條件下維持30 min后酶活雖降低到0.49 U/mL，但酶活降低速率依舊低于其他pH條件；結(jié)果表明，EC酶最適pH為5.5，且該酶在pH5～6之間時(shí)穩(wěn)定性較強(qiáng)，這也說明該酶酸穩(wěn)定性強(qiáng)，堿穩(wěn)定性較差。因此，該酶在弱酸性酒精飲料中能更好地發(fā)揮作用，例如干紅葡萄酒。

圖3 酶作用的最適pH（A）和pH穩(wěn)定性（B）Fig.3 Optimal pH (A) and pH stability (B) of enzyme action

2.2.3 EC酶的乙醇耐受性分析 隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸增加，EC酶的酶活呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為12%～14%，EC酶的酶活降低到0.12 U/mL（圖4），這可能是由于高濃度乙醇可能導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致活性的降低。文獻(xiàn)表明，當(dāng)葡萄酒中乙醇分?jǐn)?shù)為12%～14%時(shí)，使用EC酶可將EC含量降解至質(zhì)量濃度≤20 μg/L[37]。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為12%～14%，EC酶具有一定活性。

圖4 乙醇對酶活的影響Fig.4 Effect of ethanol on enzyme activity

2.3 EC酶的降解底物特異性分析

為了解EC酶對底物的特異性，添加EC、尿素、谷氨酸、谷氨酰胺等不同底物，底物特異性研究結(jié)果如圖5所示。EC酶對EC、尿素具有較高的降解效率，降解率分別為77.50%、82.40%，并且對合成EC相關(guān)的一些其他前體物質(zhì)（精氨酸和瓜氨酸）具有一定的降解能力，而對谷氨酸和谷氨酰胺卻沒有降解能力。表明該EC酶具有較強(qiáng)的底物專一性，且具有效清除EC及其前體物質(zhì)的能力。

圖5 EC酶對不同底物降解率Fig.5 Degradation rates of different substrates by EC enzymes

2.4 不同處理的干紅葡萄酒揮發(fā)性香氣成分比較分析

通過不同處理方法比較EC酶對葡萄酒揮發(fā)性性風(fēng)味物質(zhì)的影響，結(jié)果如圖6A所示。通過主成分分析得到該圖解釋了原變量總方差79.9%，主成分1解釋原始變量總方差71.2%，剩余8.7%由主成分2解釋。結(jié)果表明兩款葡萄酒的揮發(fā)性化合物具有一定的差異性，但是對同一種葡萄酒進(jìn)行接種純化后EC酶處理后，相較于MR酒樣SR酒樣香氣成分更具有一定的相似性。

圖6 兩款葡萄酒不同處理后揮發(fā)性化合物的主成分分析（A）及熱圖（B）Fig.6 Principal component analysis (A) and heat map (B) of volatile compounds in two wines with different treatments

通過揮發(fā)性化合物的聚類熱圖（圖6B）可以看出，兩種葡萄酒揮發(fā)性化合物的種類差別不大，但是含量差異明顯。SR酒樣在加入EC酶前后月桂酸乙酯、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸、乳酸乙酯、己酸乙酯、環(huán)丁醇、月桂酸含量均較高，無明顯變化，且在加入EC酶處理后酒樣中己酸乙酯含量增加；MR酒樣在加入EC酶純化后苯甲醇、正己酸、乳酸丙酯、異丁酸、癸酸異戊酯等含量較高，無明顯變化，在加入EC酶純化后十七烷-9-醇和（R）-（+）-β-香茅醇含量增加。結(jié)果表明：兩款酒經(jīng)過處理以后，各自的揮發(fā)性化合物組成及含量基本沒有變化，這說明EC酶對于葡萄酒的揮發(fā)性香氣物質(zhì)幾乎沒有影響。

3 結(jié)論

本研究通過對實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的一株魯考弗梅奇酵母（Metschnikowia reukaufii）所產(chǎn)的EC酶進(jìn)行分離純化后，分析了EC酶的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)分離純化后的EC酶的酶液蛋白含量雖減少，但其酶活提高了約1.2倍。EC酶酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，EC酶的最適作用溫度為35 ℃，最適作用pH為5.5，且該酶在pH為5～6時(shí)酶活穩(wěn)定性強(qiáng)。通過對降解底物的特異性研究發(fā)現(xiàn)，該酶對EC和尿素的降解能力較為突出，底物專一性強(qiáng)，具有清除EC及其前體物質(zhì)的能力。將此EC酶加入葡萄酒前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)并無明顯變化。綜上所述，魯考弗梅奇酵母所產(chǎn)EC酶具有一定活性和耐受性且不改變葡萄酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)，為該菌株產(chǎn)EC的工業(yè)化生產(chǎn)及EC酶在后期處理葡萄酒中EC的使用提供理論借鑒，但對于EC酶降解EC的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。