孫樂常，曾 添，林端權(quán)，翁 凌，劉光明，繆 松,3,4，曹敏杰,

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建廈門 361021；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連 116034；3.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建廈門 361021；4.愛爾蘭農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)與食品發(fā)展局Teagasc食品研究中心，芒斯特科克 999014）

雞蛋是人類日常飲食中最常見且不受宗教和種族影響的食物之一，同時(shí)也是人們?nèi)粘ｏ嬍持袃r(jià)格低廉但營養(yǎng)價(jià)值極高的食物。蛋清蛋白具有良好的凝膠性、起泡性和乳化性等多種功能特性，常被用作添加劑廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[1]。目前，蛋清蛋白主要以粉狀與液態(tài)形式進(jìn)行商品化銷售。相較于蛋清液，蛋清蛋白粉具有運(yùn)輸方便、貨架期長、均一性高和微生物安全等特點(diǎn)，具有更大的市場應(yīng)用價(jià)值[1]。

目前，工業(yè)上蛋清粉的制備方法以噴霧干燥和真空冷凍干燥為主，并輔以一定的前處理或改性。噴霧干燥生產(chǎn)效率高且成本較低，但熱處理會(huì)導(dǎo)致敏感的蛋清成分，如卵類粘蛋白[2]等變性，從而可能影響蛋清蛋白整體的功能特性。Katekhong等[3]與代曉凝等[4]研究發(fā)現(xiàn)采用噴霧干燥的高溫會(huì)使蛋清蛋白的構(gòu)象部分展開，暴露的巰基增加，有助于蛋白質(zhì)的聚集，從而有利于蛋清粉的凝膠性。另一方面，冉樂童等[5]將蛋清液巴氏殺菌后進(jìn)行噴霧和冷凍干燥，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥蛋清粉的起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化性優(yōu)于噴霧干燥，但熱穩(wěn)定性較噴霧干燥低。Kudre等[6]將蛋清蛋白進(jìn)行磷酸化預(yù)處理后再進(jìn)行干燥，則發(fā)現(xiàn)冷凍干燥磷酸化蛋清蛋白具有更高的乳化性、持油力與凝膠性，而起泡性能力則低于噴霧干燥[7]。由此可見，蛋清蛋白的冷凍干燥與噴霧干燥相比各具優(yōu)勢，且一定的前處理會(huì)對干燥蛋清蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響[5,8]。系統(tǒng)揭示干燥過程中蛋白的理化性質(zhì)及其功能特性的變化規(guī)律對蛋清蛋白在不同食品生產(chǎn)加工中的科學(xué)應(yīng)用具有重要意義。目前，國內(nèi)外對干燥蛋清蛋白的研究大多圍繞干燥的條件[9-11]或一定的改性處理[1,6]對凝膠性及其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[7,12-13]等方面，而對天然蛋清蛋白的直接干燥及其理化性質(zhì)與功能特性的變化機(jī)理卻缺乏系統(tǒng)性研究。

基于此，本文以雞蛋清蛋白為對象，通過測定內(nèi)源性熒光、表面疏水性、游離巰基含量、二級結(jié)構(gòu)組成、溶解度、接觸角以及表面張力等指標(biāo)，表征蛋清蛋白經(jīng)過噴霧干燥或真空冷凍干燥處理后的構(gòu)象變化，同時(shí)分析蛋清蛋白的乳化性和起泡能力等功能特性，以探究不同干燥方式對蛋清蛋白功能特性的影響機(jī)理，旨在為蛋清粉在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋、玉米油 福建省廈門市集美區(qū)大潤發(fā)超市，雞蛋放置于4 ℃冰箱中備用，玉米油放置于室溫陰涼處；苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS） 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白 美國Thermal公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，電泳純）和丙烯酰胺 Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

WSC-S色差計(jì) 中國上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；G:BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司；BZY-1全自動(dòng)表面張力儀 中國上海Sunny衡平科學(xué)儀器有限公司；CA-100接觸角測量儀 上海盈諾精密儀器有限公司；Avanti JA-10高速冷凍離心機(jī)、pH計(jì) 美國Beckman公司；Vector-22傅里葉變換紅外光譜儀 瑞士Bruker公司；FP-8200熒光分光光度計(jì) 日本Jasco公司；TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；Alpha 1-4 LDplus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Echo Revolve 熒光倒置顯微鏡 美國Tousimis公司；DHR-2流變儀 美國TA儀器公司；Phenom Pro掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom-World Pr公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋清液的制備及干燥 參照Chang等[14]的方法并做適當(dāng)修改。將蛋清和蛋黃分離，取蛋清用1 mol/L HCl調(diào)pH至6.0，攪拌15 min后再次調(diào)pH至6.0，于4 ℃攪拌30 min，8000 g離心10 min后除去不溶性蛋白，取上清液得到蛋清液（EWP-C）存放于4 ℃冷庫中備用，分別按下述條件制備相應(yīng)的干燥蛋白粉。

干熱噴霧干燥蛋清粉（EWP-P）：進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃，出風(fēng)溫度 70 ℃；蠕動(dòng)泵12 r/min。

真空冷凍干燥蛋清粉（EWP-D）：-70 ℃預(yù)凍過夜；真空度0.63 Pa，冷凍干燥溫度-48 ℃、時(shí)間2 d；溶液厚度5～8 mm。

1.2.2 SDS-PAGE分析 將蛋清液和蛋清粉溶液的蛋白濃度調(diào)整為10 mg/mL。添加約7%的β-巰基乙醇作還原處理進(jìn)行對比。分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，蛋白上樣量為40 mg，電流為12 mA。電泳結(jié)束后，將膠取出用考馬斯亮藍(lán)染色液在室溫下染色1 h，然后用脫色液脫色，最后利用凝膠成像儀分析蛋白質(zhì)條帶。

1.2.3 白度的測量 用色差儀直接測定蛋清粉的亮度值（L*）、紅（a*）、黃（b*）。測定5次取平均值。L*為正值表示偏亮，反之偏暗；a*為正值偏紅，反之偏綠；b*為正值偏黃，反之偏藍(lán)。白度的計(jì)算公式如下：

式中：L*、a*、b*值分別為經(jīng)不同干燥處理蛋清粉的亮度、紅度和黃度。

1.2.4 內(nèi)源性熒光測定 參考Yu等[15]的方法測定了各樣品的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度。將EWP樣品稀釋至0.1 mg/mL。采用熒光分光光度計(jì)記錄激發(fā)波長為258、275和295 nm的時(shí)的熒光光譜，發(fā)射光譜范圍為300～500 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.2.5 表面疏水性測定 根據(jù)熒光探針劑ANS法測定樣品的表面疏水性。將樣品稀釋至0.025～0.1 mg/mL，取2 mL樣品與8 μL ANS（20 mmol/L）混勻，渦旋振蕩3 s，避光20 min測定熒光強(qiáng)度，測試所用的激發(fā)波長為390和470 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.2.6 總游離巰基和表面游離巰基測定 用Ellman's法[16]分析了蛋清液和不同干燥方式蛋清粉之間蛋白質(zhì)中總游離巰基和表面游離巰基的區(qū)別，摩爾消光系數(shù)為13600 M-1cm-1。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析 用瑪瑙研缽將蛋清粉樣品磨細(xì)，將樣品與溴化鉀混合，壓成片狀后測量。25 ℃下，在4000～500 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)對每個(gè)樣品進(jìn)行分析。每個(gè)樣品以空氣為背景、KBr為空白對照進(jìn)行掃描。每次測量都是32次掃描的疊加。用Omnic軟件基線校正和傅里葉自取卷積后使用PeakFit軟件對1600～1700 cm-1區(qū)域進(jìn)行歸一化。利用高斯峰和曲線擬合模型對二級結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行定量估計(jì)。

1.2.8 溶解度測定 參照Latorres等[17]的方法測定蛋清粉的溶解度并做適當(dāng)修改。稱取0.2 g蛋清粉溶解于20 mL DDW，用1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH將溶液的pH調(diào)節(jié)至2.0，4.0，6.0，8.0和10.0，混合溶液在30 ℃下以100 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 min，然后7500×g，離心10 min，取上清，用Lowry法測定上清液蛋白質(zhì)含量。全蛋白含量用蛋白溶解液（20 mmol/L PBS，2% SDS，8 mol/L Urea，pH8.0）充分溶解蛋白樣品后的蛋白含量表示。

1.2.9 接觸角測定 接觸角是三相（液、固、氣）接觸點(diǎn)的切角，是測定粉體潤濕性的常用參數(shù)。由于潤濕行為是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，因此可以通過監(jiān)測接觸角的變化率來量化潤濕過程。參照Li等[18]的方法，用接觸角測量儀測量粉體的水接觸角變化。設(shè)置的參數(shù)為5 μL水滴體積和介質(zhì)滴定速率。記錄0～60 s的接觸角。每個(gè)樣品的測量至少重復(fù)5次。

1.2.10 表面張力測定 采用全自動(dòng)表面張力儀，以及鉑金板法測定不同pH下濃度為1%（w/v）的蛋清溶液表面張力。

1.2.11 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定 蛋清蛋白的乳化活性指數(shù)（emulsifying ability index，EAI）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability index，ESI）參考Dabbour等[19]的方法并作適當(dāng)修改。制備不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0）含1%（w/v）蛋清蛋白的溶液，取15 mL溶液與5 mL玉米油混合，在10000 r/min條件下高速均質(zhì)1 min。分別在0、30 min時(shí)從離心管底部取50 μL溶液，加入到4950 μL 0.1% SDS溶液中，渦旋5 s混勻，立即在500 nm波長處測定吸光度。

式中：T為濁度（2.303）；A0為0 min時(shí)吸光度；DF為稀釋倍數(shù)（100）；ρ為蛋白質(zhì)濃度（g/mL）；φ為油相與水相的比例（0.25）；Δt為時(shí)間差/min；At為放置30 min后吸光度。

1.2.12 起泡性和泡沫穩(wěn)定性 參考Dabbour等[19]的方法測定蛋清蛋白的起泡性（foaming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（foaming stability，F(xiàn)S），將蛋清蛋白溶液稀釋至1%（w/v），調(diào)節(jié)pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，用高速分散器以10000 r/min的速度均質(zhì)1 min，記錄均質(zhì)前后體積。將樣品靜置30 min后，再次記錄樣品體積。

式中：V1為均質(zhì)前體積（mL）；V2為均質(zhì)后體積（mL）；V3為均質(zhì)30 min后體積（mL）。

1.2.13 乳液的微觀結(jié)構(gòu)分析

1.2.13.1 乳液的制備 蛋清蛋白乳液的制備參考Xu等[20]的方法并略作修改。90 mL含1%（w/v）蛋清蛋白溶液的超純水作為乳液的水相，10 mL玉米油為油相，10000 r/min條件下高速均質(zhì)2 min，分別50 MPa高壓均質(zhì)0、1、2次（分別用EWP-P0、EWPP1、EWP-P2和EWP-D0、EWP-D1、EWP-D2表示）。加入0.02% NaN3作為防腐劑，抑制細(xì)菌增長。

1.2.13.2 熒光倒置顯微鏡 用熒光倒置顯微鏡觀察蛋清液及不同干燥方式蛋清粉均質(zhì)不同次數(shù)后乳液的微觀結(jié)構(gòu)。取20 μL乳液置于載玻片上，并用蓋玻片小心的蓋住。平衡2 min后，拍攝放大率為400倍下的蛋清蛋白乳液的微觀結(jié)構(gòu)照片。

1.2.13.3 激光掃描共聚焦顯微鏡 參考Xu等[20]的方法并作適當(dāng)修改。將樣品用0.1%（w/v）的尼羅紅和FITC試劑染色，并在黑暗中孵育10 min。在室溫下避光環(huán)境中由Leica TCS SP8系統(tǒng)在激發(fā)波長為488 nm下（放大倍數(shù)為400倍）進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)均至少重復(fù)三次取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差，利用IBM SPSS Statistics 21軟件和Duncan多重檢驗(yàn)方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析，并采用Origin 9.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式蛋清蛋白的SDS-PAGE分析

如圖1所示，蛋清中主要含有三種蛋白：卵清蛋白（45 kDa）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（76 kDa）和卵粘蛋白。卵粘蛋白主要有α-和β-兩個(gè)亞基，α-卵粘蛋白又分為兩種類型：α1-和α2-，分子量分別為150和220 kDa；β-卵粘蛋白的分子量為400～720 kDa[21]。非還原條件下SDS-PAGE上方出現(xiàn)許多高聚物條帶，添加β-巰基乙醇后，高聚物條帶消失，表明該高聚物由蛋白通過二硫鍵聚合而成。蛋清蛋白中原有的卵類粘蛋白與溶菌酶在本實(shí)驗(yàn)室并未被檢測到，可能是由于卵類粘蛋白在蛋清前處理將稀釋、調(diào)節(jié)pH和攪拌時(shí)會(huì)發(fā)生絮凝，形成白色絮狀物，從而被離心除去[2,22]。溶菌酶的不可逆變性臨界點(diǎn)是77 ℃，因此噴霧干燥（溫度高達(dá)180 ℃）過程中溶菌酶可能會(huì)變性從而造成損失[23]。此外，冷凍干燥也會(huì)造成溶菌酶的損失，如Kudre等[6]在比較日本鵪鶉（Coturnix japonica）和白來航雞（White Leghorn）冷凍干燥蛋清粉的SDS-PAGE時(shí)也發(fā)現(xiàn)了冷凍干燥過程中溶菌酶損失的現(xiàn)象。蛋清蛋白各組分在還原條件（圖1A）下的分子量略大于非還原條件（圖1B），這是因?yàn)镾DS與蛋白質(zhì)結(jié)合會(huì)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)形成一種長橢圓棒狀結(jié)構(gòu)，加入足夠量的SDS和β-巰基乙醇可使蛋白質(zhì)的遷移速率僅與蛋白質(zhì)分子大小有關(guān)[24-25]。未加入β-巰基乙醇（非還原狀態(tài)）時(shí)蛋白質(zhì)遷移速度更快可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中的二硫鍵未打開，蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合形成長橢圓棒狀物的長軸較短，遷移速度更快，因此蛋白質(zhì)條帶的分子量較小。EWP-C、EWP-P和EWP-D蛋白條帶幾乎沒有區(qū)別，表明本實(shí)驗(yàn)的干燥條件未對蛋清蛋白組分造成明顯影響。

圖1 蛋清液和不同干燥方式蛋清粉蛋白質(zhì)模式圖Fig.1 Protein pattern of egg white proteins by different drying methods

2.2 不同干燥方式蛋清蛋白的外觀和色澤分析

如圖2所示，EWP-P為細(xì)膩的鵝黃色顆粒粉末，EWP-D為松散的黃色片狀物。EWP-P的L*、a*和b*值分別為53.90±0.23、-2.06±0.70和6.04±0.21。EWP-D的L*、a*和b*值分別為49.89±0.36、-1.65±0.26和3.84±0.50（表1）。EWP-P的b*值較大是因?yàn)榈扒宓鞍字械钠咸烟窃趪婌F干燥過程中與蛋白發(fā)生了美拉德反應(yīng)[3]。此外，真空冷凍干燥需將樣品進(jìn)行冷凍預(yù)處理，冷凍過程中，蛋清蛋白會(huì)發(fā)生褐變反應(yīng)，故EWP-D最終呈現(xiàn)出的顏色較EWP-P黃（圖2）。EWP-P的顏色較EWP-D白（圖2），可能是因?yàn)楦蔁釃婌F干燥的干燥速度快，蛋清中的蛋白質(zhì)受熱時(shí)間短。因此在本實(shí)驗(yàn)干燥條件下，干熱噴霧干燥所得的蛋清蛋白粉更亮、更白，易被消費(fèi)者接受。

圖2 不同干燥方式EWP的宏觀圖Fig.2 Macrograph of EWP for different drying methods

表1 干熱噴霧干燥蛋清粉和真空冷凍干燥蛋清粉的色差Table 1 Color difference of dry heat spray drying and vacuum freeze-drying egg white powder

2.3 不同干燥方式蛋清蛋白的內(nèi)源性熒光分析

蛋白質(zhì)的固有熒光來自于內(nèi)部的芳香族氨基殘基（酪氨酸 Tyr、色氨酸 Trp、苯丙氨酸 Phe），其熒光最大值（λmax）、強(qiáng)度對其微環(huán)境的極性極其敏感，因此可用來表征蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化，其中Trp、Tyr和Phe的特有熒光激發(fā)波長分別為295、275和258 nm[15]。如圖3所示，與EWP-C相比，不同干燥方式制備的蛋清粉的固有熒光強(qiáng)度降低但熒光峰的位置未有明顯的遷移。EWP-P的熒光強(qiáng)度低于EWP-D于EWP-C，可能是因?yàn)閲婌F干燥的干燥溫度高，蛋清蛋白變性程度大，芳香族氨基酸殘基暴露于更極性環(huán)境中，進(jìn)而發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象。此外，EWP-P的熒光強(qiáng)度較低還可能是由于蛋清蛋白中含有葡萄糖，在高溫下會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，屏蔽了芳香族氨基殘基[4]。

圖3 蛋清液及不同干燥方式EWP的內(nèi)源性熒光Fig.3 Endogenous fluorescence of EWP in egg white liquid and different drying methods

2.4 游離巰基和表面疏水性分析

總游離巰基包含蛋白質(zhì)分子內(nèi)部和表面的游離巰基。巰基的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，如溶解度、乳化性和膠凝性能等[26]。如圖4所示，EWPC、EWP-P和EWP-D的總游離巰基分別是103.81±2.10、93.40±5.93和113.61±7.63 μmol/L，其游離巰基分別是41.96±8.31、56.18±2.88和45.39±1.97。與EWP-C相比，EWP-P表面游離巰基含量顯著升高（P＜0.05）、總游離巰基含量顯著降低（P＜0.05）。而EWP-D與EWP-C相比總巰基和表面游離巰基含量差異不顯著（P＞0.05）。這可能與噴霧干燥過程中卵清蛋白的變性有關(guān)，天然狀態(tài)的卵清蛋白中含有埋藏于球狀分子內(nèi)部的游離巰基，而高溫破壞了卵清蛋白的空間結(jié)構(gòu)使內(nèi)部巰基暴露在蛋白表面[27]。三種蛋清蛋白的表面疏水性與表面游離巰基含量變化趨勢一致， EWP-C和EWP-D的表面疏水性差異不顯著（P＞0.05），但其表面疏水性顯著低于EWP-P組（P＜0.05），這可能也與噴霧干燥的高溫環(huán)境有關(guān)，該環(huán)境下蛋清蛋白部分展開，導(dǎo)致內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，從而表面疏水性增高。代曉凝等[4]將自然發(fā)酵后的蛋清液分別進(jìn)行冷凍、熱風(fēng)和噴霧干燥處理，比較三種蛋清粉與溴酚藍(lán)的結(jié)合率從而判斷其表面疏水性大小為：冷凍干燥＞噴霧干燥＞熱風(fēng)干燥，推測是噴霧干燥發(fā)生美拉德反應(yīng)引入親屬基團(tuán)所致。這與本文研究不一致，可能是因?yàn)榈扒迩疤幚聿煌?，自然發(fā)酵時(shí)微生物可能會(huì)改變蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)。

圖4 不同干燥方式蛋清粉的總游離巰基（TSH）、表面游離巰基（SH）和表面疏水性（H0）Fig.4 Total free sulfhydryl group (TSH), surface free sulfhydryl group (SH) and surface hydrophobicity (H0) of egg white powder by different drying methods

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

不同干燥方式蛋清蛋白的紅外光譜如圖5所示。EWP-P和EWP-D在酰胺A帶（3700～3200 cm-1）處有強(qiáng)吸收峰，EWP-P的峰強(qiáng)大于EWP-D，表明干燥方式會(huì)影響蛋清蛋白的水合能力，這可能與蛋白質(zhì)分子中N-H鍵舒展并與氫鍵形成了締合體，或蛋白質(zhì)分子與葡萄糖以共價(jià)鍵結(jié)合有關(guān)[4]。酰胺B帶（2961.64 cm-1）的弱吸收峰主要由C-N鍵產(chǎn)生。酰胺I帶 （1600～1700 cm-1）信號主要由C-O鍵伸縮振動(dòng)引起，與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有關(guān)，涉及β-折疊（1600～1640 cm-1）、無規(guī)則卷曲（1640～1650 cm-1）、α-螺旋（1650～1660 cm-1）和β-轉(zhuǎn)角（1660～1700 cm-1）[28]。采用Peak fit軟件對不同干燥方式蛋清蛋白的酰胺I帶峰強(qiáng)進(jìn)行高斯曲線擬合分析，根據(jù)峰面積計(jì)算其二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量，結(jié)果如表2。EWP-P和EWP-D的二級結(jié)構(gòu)以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主，EWPP的β-折疊含量增加主要與卵轉(zhuǎn)鐵蛋白熱變性有關(guān)[29]，同時(shí)分子間的β-折疊結(jié)構(gòu)也易轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角

表2 不同干燥方式蛋清粉的二級結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure content of egg white powder by different drying methods

圖5 不同干燥方式蛋清蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 FTIR of egg white proteins in different drying modes

結(jié)構(gòu)[29]。而α-螺旋下降可能是因?yàn)闊嶙冃詫?dǎo)致α-螺旋中的氫鍵斷裂，進(jìn)而發(fā)生了解螺旋現(xiàn)象[30]。EWPP無規(guī)則卷曲增加，表明其部分有序結(jié)構(gòu)向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，蛋白變性明顯，結(jié)構(gòu)的隨機(jī)性增強(qiáng)。

2.6 不同干燥方式蛋清蛋白的溶解度分析

溶解性是蛋白重要的功能特性之一，與接觸角、表面張力、乳化性等密切相關(guān)。如圖6A，不同pH下不同干燥方式的蛋清粉溶解度的測量。EWP-P的溶解度隨著pH的升高先減小后增大，這可能是因?yàn)樵谒嵝院蛪A性環(huán)境中球狀蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生部分展開，形成熔融球狀構(gòu)象，變得更加靈活，更容易與水分子作用[31]。pH為6.0時(shí)蛋清蛋白的溶解度最低，可能是因?yàn)樵損H與蛋清蛋白中大部分蛋白的等電點(diǎn)相近，蛋白帶電荷量較少，因此容易發(fā)生沉淀。與EWPP相比，EWP-D在pH6.0時(shí)溶解度的下降程度較小，這可能與真空冷凍干燥后蛋清蛋白的微觀結(jié)構(gòu)呈片狀，具有較大的比表面積有關(guān)，也可能是因?yàn)槔鋬龈稍锏鞍踪|(zhì)在脫水過程中蛋白質(zhì)變性低，促進(jìn)了可溶性聚集物生成[5,19]。EWP-D的溶解度遠(yuǎn)大于EWP-P，這是因?yàn)閲婌F干燥是直接將蛋清液霧化后再干燥，其蛋清粉表面會(huì)形成一個(gè)光滑、抗?jié)裥缘谋∧?，最終導(dǎo)致蛋白的溶解性降低，復(fù)水性差且易結(jié)塊[32]。而真空冷凍干燥經(jīng)過冷凍升華，可保持食品原有的形狀故具有很好的速溶性和復(fù)水性[33]。Shaviklo等[34]也發(fā)現(xiàn)噴霧干燥的含添加劑（花粉）蛋白的蛋白質(zhì)溶解度明顯低于凍干蛋白。

圖6 不同干燥方式蛋清粉的功能性質(zhì)Fig.6 Functional properties of egg white powder by different drying methods

2.7 不同干燥方式蛋清蛋白的接觸角分析

接觸角值作為時(shí)間函數(shù)的變化，表征了潤濕行為，是評價(jià)粉體潤濕性的常用指標(biāo)。當(dāng)樣品的接觸角大于90°時(shí)，表明其疏水性較強(qiáng)，反之則親水性較強(qiáng)[35]。不同干燥方式制備的蛋清蛋白粉與水相的接觸角如圖6B所示，EWP-P在0 s時(shí)的接觸角為99.62°，表現(xiàn)出疏水性特征；EWP-D的接觸角為65.97°，表明其具有較好的親水性。樣品與水滴接觸60 s后，由于水進(jìn)入到了粉末內(nèi)部，兩種樣品的接觸角不斷減小，EWP-P的接觸角下降到97.07°，EWPD的接觸角下降到59.59°，EWP-D在60 s內(nèi)接觸角的下降速率更大，表明其具有更好的潤濕性，這可能與干燥后粉末的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。冉樂童等[5]利用掃描電鏡觀察了冷凍干燥與噴霧干燥蛋清蛋白粉的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)EWP-P粉末是球狀帶孔的結(jié)構(gòu)，且粒徑較小，而EWP-D則呈現(xiàn)出較大、松散的片狀結(jié)構(gòu)。相較于EWP-P的球狀結(jié)構(gòu)，EWP-D的松散片狀結(jié)構(gòu)可能更有利于水分在其內(nèi)部的自由流動(dòng)，因此具有更好的潤濕性[18]。

2.8 不同干燥方式蛋清蛋白的表面張力分析

表面張力是液體自由表面或兩種不相溶液體之間界面上的一種拉力，與蛋白質(zhì)的乳化性和起泡性息息相關(guān)。從圖6C可知，在2.0～10.0的pH范圍內(nèi)EWP-P的表面張力均大于EWP-D，這可能是EWPD較高的溶解度影響了蛋白質(zhì)在界面的擴(kuò)散速度所導(dǎo)致[36]。在pH2.0時(shí)，EWP-P和EWP-D的表面張力最大，分別為48.36±0.50和48.30±0.26 mN/m。隨著pH的增大EWP-P和EWP-D的表面張力均先減小后增大，與溶解度（圖6A）的趨勢相似，這可能是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，卵清蛋白表面的疏水基團(tuán)會(huì)增加，從而降低了蛋白質(zhì)分子在界面上吸附的動(dòng)力學(xué)障礙，所以EWP-P和EWP-D的表面張力在酸性環(huán)境下更大[37]。

2.9 乳化能力和起泡能力分析

蛋白質(zhì)的溶解度和表面張力等特性在決定其乳化能力等方面起著重要作用。如圖7A，EWP-P和EWP-D的乳化性隨著pH的增高先減小后增大，與溶解度（圖6A）和表面張力（圖6C）的趨勢一樣。pH為2.0時(shí)，兩者的乳化能力最好，其乳化性分別為5.98±0.04和6.25±0.02 m2/g，乳化穩(wěn)定性分別為151.48和277.85 min。酸性環(huán)境下卵清蛋白表面暴露了更多的疏水氨基酸和帶電基團(tuán)，可以有效地幫助乳狀液體系的形成和物理穩(wěn)定，因此在酸性環(huán)境下EWP-P和EWP-D的乳化性和乳化穩(wěn)定性均更高[37]。EWP-D的乳化性優(yōu)于EWP-P，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的乳化性與其溶解度密切相關(guān)，溶解度較大，乳化性也相對較高[38]。此外，卵清蛋白是一種典型的含糖鏈的球蛋白，其糖鏈具有較強(qiáng)的界面吸附作用，有利于油水界面的乳化[39-40]。EWP-P在噴霧干燥時(shí)的美拉德反應(yīng)消耗了蛋清蛋白中的糖，故其乳化性較小。

泡沫的形成依賴于由蛋白質(zhì)形成的界面膜及其在懸浮液中保持氣泡和減緩聚結(jié)速率的能力，其中蛋白質(zhì)的發(fā)泡能力和穩(wěn)定性與蛋白與水相在界面上的相互作用有關(guān)，受蛋白分子柔性、凈電荷、構(gòu)象和疏水性的影響[39-40]。蛋清蛋白在pH2.0～10.0條件下的起泡性如圖7C所示，EWP-D的起泡性優(yōu)于EWPP，這可能是由于EWP-D的溶解度較高，在起泡過程中蛋白能迅速展開，形成能同時(shí)連接水相溶劑與空氣界面的兩性介質(zhì)，而自身的帶電性又可產(chǎn)生一定的靜電排斥，使蛋白分子在空氣-水界面上呈現(xiàn)規(guī)律性排列，而不會(huì)發(fā)生聚集[19,41]。相比之下，EWP-P在高溫發(fā)生的美拉德反應(yīng)會(huì)使蛋白形成更大的空間位阻，進(jìn)而延緩了蛋白質(zhì)在空氣/液體界面的吸附[1]。pH為6.0時(shí)，EWP-P和EWP-D的起泡性較低，分別是10.19%±1.01%和11.7%±0.66%，這是由于該pH下蛋白的溶解度和表面張力較低，蛋白易發(fā)生聚集，故不易形成泡沫。Dabbour等[19]研究向日葵蛋白時(shí)也發(fā)現(xiàn)所有的蛋白樣品在pH6.0時(shí)的起泡性最低，且冷凍干燥樣品的起泡性優(yōu)于對流烘箱干燥樣品。另一方面，泡沫穩(wěn)定性與蛋白膜的強(qiáng)度有關(guān)，蛋白質(zhì)在攪打時(shí)，蛋白質(zhì)分子被吸附在空氣-水界面，蛋白質(zhì)分子重新排列，使其疏水部分朝向氣相方向，這種變化容易引起巰基的氧化，在空氣-水界面與相鄰的蛋白質(zhì)分子中的巰基形成二硫鍵，從而增強(qiáng)界面膜的強(qiáng)度，有利于泡沫穩(wěn)定性[1]。EWP-P的泡沫穩(wěn)定性大于EWP-D，可能是因?yàn)閲婌F干燥可能導(dǎo)致更多的蛋白質(zhì)展開，表面游離巰基含量較多。另一方面可能是因?yàn)镋WP-P發(fā)生了美拉德反應(yīng)，在空氣-水界面上可以形成的厚的粘彈性美拉德產(chǎn)物層，有利于泡沫穩(wěn)定性的增加[42]。Zeng等[43]研究不同干燥方式對雞皮膠原蛋白多肽時(shí)也發(fā)現(xiàn)噴霧干燥使其蛋白樣品的泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于冷凍干燥樣品。

圖7 不同干燥方式蛋清粉的乳化能力和起泡能力Fig.7 Emulsifying ability and foaming ability of egg white powder by different drying methods

2.10 不同干燥方式蛋清蛋白的乳液微觀結(jié)構(gòu)分析

EWP-P和EWP-D經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)0、1、2次后所得乳液的微觀結(jié)構(gòu)如圖8所示。未高壓均質(zhì)的蛋清蛋白乳液油滴大，且不均一，蛋白質(zhì)容易從油水界面解離出來，使小油滴聚集形成大油滴。均質(zhì)1次后蛋清蛋白乳液的油滴尺寸減小，分散性提高，且未發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，其原因可能是高壓均質(zhì)后，蛋清蛋白乳液被高壓剪切力切割形成小分子，使蛋清蛋白粒徑減小，更多的蛋白質(zhì)吸附至油-水界面，為液滴間提供足夠的排斥力，從而阻止乳析的發(fā)生，使蛋清蛋白乳液的穩(wěn)定性增強(qiáng)[44]。均質(zhì)2次后，兩者均出現(xiàn)了小程度的團(tuán)聚現(xiàn)象，形成了較大的油滴，這可能是因?yàn)榫|(zhì)次數(shù)增多，體系出現(xiàn)了“過處理”效應(yīng)，高壓使蛋清蛋白乳液的油滴變小，油滴之間的運(yùn)動(dòng)速率加快，增加了相互碰撞的次數(shù)，從而破壞界面膜，導(dǎo)致油滴聚集[45]。劉競男等[44]研究高壓對大豆分離蛋白的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)隨著均質(zhì)次數(shù)的增多，大豆分離蛋白的乳液體系出現(xiàn)了“過處理”效應(yīng)，這被歸因?yàn)椴糠纸怆x的大豆蛋白分子重新通過新的二硫鍵形成了聚集體。EWP-P的團(tuán)聚現(xiàn)象比EWP-D的更明顯，可能是因?yàn)镋WP-P的溶解度較低且表面巰基含量較高，故更易于聚集。以上結(jié)果表明，EWP-D乳液的穩(wěn)定性高于EWP-P，說明真空冷凍干燥更有利于蛋清蛋白的乳液穩(wěn)定。

圖8 不同干燥方式蛋清粉乳液的微觀結(jié)構(gòu)（400×）Fig.8 Microstructure of egg white powder emulsion by different drying methods (400×)

3 結(jié)論

蛋清蛋白經(jīng)過不同干燥方式干燥后，其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致理化和功能特性不同。噴霧干燥會(huì)使蛋清蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)和巰基暴露，同時(shí)還會(huì)與蛋清中的糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，最終使蛋白的溶解度、乳化性以及起泡能力下降，但其較高的表面疏水性有利于維持泡沫的穩(wěn)定。冷凍干燥蛋清蛋白干燥前后的結(jié)構(gòu)變化較小，蛋白基本保持原有的空間構(gòu)象。相較于噴霧干燥蛋清蛋白，冷凍干燥蛋清蛋白具有較大的比表面積與溶解度，表面張力更小，因此蛋白的乳化能力和起泡性更優(yōu)。隨著冷凍干燥技術(shù)與裝備的日益成熟，本研究的結(jié)果可為冷凍干燥蛋清蛋白在新食品開發(fā)與加工中的應(yīng)用提供理論參考。