宋道光，陳 志,

（1.青海師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院，青海西寧 810008；2.青海師范大學(xué)，青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810008）

小葉金錢草（Hydrocotyle sibthorpioidesLam.）為傘形科天胡荽屬植物，中國傳統(tǒng)中藥之一[1]。可全草入藥，具有清熱解毒、利濕退黃、跌打淤腫以及抗菌等功效，民間及臨床上常用于治療黃疸型肝炎、結(jié)石及膽囊炎等病癥，但尚未被國家藥食同源性中藥材及保健食品目錄收錄?；瘜W(xué)成分方面，文獻(xiàn)報(bào)道小葉金錢草化學(xué)成分主要集中在黃酮及其苷類、萜類、甾醇、氨基酸、揮發(fā)油、香豆素類等化合物中[2-3]。藥理研究方面，小葉金錢草除具有極低的毒性外[4]，具有降血糖[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、抗氧化[7]、抗癌[8]以及肝損傷保護(hù)[9]等藥理活性。上述藥理活性與其中所含的多種生物活性物質(zhì)密切相關(guān)，例如黃酮類、三萜類和揮發(fā)油等，其中黃酮類化合物是其中一類非常重要的生物活性物質(zhì)，在自然界中分布廣泛，且具有抗癌、抑菌、抗衰老等多種生物活性[10]，能與食品中的一些成分發(fā)生相互作用繼而影響食品的品質(zhì)[11]，并應(yīng)用于減肥等保健食品中[12-13]。以上研究表明，金錢草中的黃酮類化合物是一類重要的活性成分。

熊峻等[3]對(duì)金錢草及其同屬植物中的黃酮類成分進(jìn)行了歸納總結(jié)，但文獻(xiàn)中對(duì)黃酮類成分的分離研究還局限在柱層析（硅膠、凝膠、MCI）及重結(jié)晶等傳統(tǒng)手段。為了更好的研究金錢草中的化學(xué)成分，通常會(huì)借助一些其他手段如響應(yīng)面法輔助以超聲提取，能夠優(yōu)化提取工藝達(dá)到更好的提取有效成分的目的[14]，此外高效液相色譜（HPLC）[15]、氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）[5]、超高效液相色譜質(zhì)譜（UPLC-MS）[7]也應(yīng)用于分析金錢草化學(xué)成分。因此，借助現(xiàn)代儀器分析手段能更好的對(duì)中藥中的化學(xué)成分進(jìn)行研究。截至2020版藥典，小葉金錢草仍未被收錄，因此對(duì)小葉金錢草化學(xué)成分進(jìn)行深入研究具有重要意義。

雖然已有諸多學(xué)者對(duì)金錢草中黃酮類成分進(jìn)行研究，但大多還局限于傳統(tǒng)手段，少有通過高速逆流色譜對(duì)金錢草化學(xué)成分進(jìn)行研究的報(bào)道，傳統(tǒng)植化分離手段大多存在分離時(shí)間長、效率低下、溶劑使用量大及部分分離物質(zhì)死吸附等缺點(diǎn)。高速逆流色譜（High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC）是1982年由美國國立衛(wèi)生院Ito博士研發(fā)的一種新型、連續(xù)高效的液液分配色譜技術(shù)，即按照某樣品在兩相不互溶的溶劑之間分配的一種技術(shù)[16]。除節(jié)約溶劑、縮短分離時(shí)間外，還可有效解決傳統(tǒng)柱色譜在分離時(shí)產(chǎn)生的不可逆吸附以及樣品在分離過程中遇到的變性問題[17]。占穎等[18]對(duì)高速逆流色譜在黃酮類天然產(chǎn)物的分離應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)分析，包括適合分離黃酮及其苷類的溶劑系統(tǒng)、分配系數(shù)、輔助添加劑、洗脫方式以及與傳統(tǒng)分離手段的結(jié)合情況等。本研究在前期對(duì)小葉金錢草乙酸乙酯萃取物研究的工作基礎(chǔ)上，采用HSCCC手段對(duì)小葉金錢草正丁醇萃取物中的黃酮苷類成分進(jìn)行進(jìn)一步分離研究，通過調(diào)整不同溶劑系統(tǒng)，采取梯度洗脫方式并結(jié)合前期總結(jié)的HSCCC樣品出峰經(jīng)驗(yàn)公式，優(yōu)化分離條件，為進(jìn)一步研究小葉金錢草的化學(xué)成分提供分離方法及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小葉金錢草 西寧城北百信大藥房，青海師范大學(xué)陳志教授鑒定為天胡荽屬植物天胡荽（Hydrocotyle sibthorpioidesLam.）；DM 301型大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂科技有限公司；葡聚糖凝膠 （Sephadex LH-20）、反相硅膠（ODS/RP-18） 安徽博美生物科技有限公司； 正己烷、正丁醇、乙醇、甲酸 分析純，天津市百世化工有限公司；乙腈 色譜純，天津星馬克科技發(fā)展有限公司；水 二次蒸餾水；核磁管（外徑5 mm，長7英寸） 美國Wilmad公司；DMSO-d6寧波旋光醫(yī)藥科技有限公司。

EV400旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 北京萊伯泰科儀器股份有限公司； KJ-11030AL型超聲波清洗器 深圳市科潔超聲科技有限公司； Waters 600高效液相色譜儀、真空脫氣過濾裝置、Waters 2998 PAD二極管陣列檢測器 美國Waters公司； HSCCC TBE-300B型高速逆流色譜儀 中國上海同田生化技術(shù)有限公司；N2000雙通道色譜工作站 浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；Bruker-500 MHz NMR（AVANCE III HD）核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小葉金錢草正丁醇萃取物的制備 將購買的小葉金錢草全草粉碎后過40目篩。提取方法參考課題組前期工作[19]，稱取20 kg藥材粉末分次置于KJ-11030AL型超聲波清洗器中，放置藥材前按液料比10:1加入70%（v/v）乙醇溶液，于600 W、40 kHz、60 ℃條件下超聲提取1 h，過濾所得藥渣再按以上方式繼續(xù)提取三次，總計(jì)提取4次。過濾液經(jīng)減壓濃縮后得棕褐色黏稠浸膏。浸膏加入蒸餾水20 L并在加熱條件下（60 ℃）超聲溶解，然后所得溶液依次用10倍體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次。濃縮正丁醇萃取液，凍干得正丁醇萃取物，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小葉金錢草正丁醇萃取物各分離樣品的制備

取正丁醇萃取物255 g，用5 L蒸餾水超聲溶解，DM 301型大孔吸附樹脂柱（10×50 cm）進(jìn)行富集并靜置過夜，使用乙醇/水（0:100、30:70、50:50、75:25、100:0）進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度各用五倍柱體積洗脫，20.0 mL/min流速洗脫。收集50%乙醇/水洗脫液，旋蒸除去溶劑并于-70 ℃冷凍干燥24 h，得大孔樹脂富集樣品。

取大孔樹脂富集樣品（10 g）加入100 mL蒸餾水溶解并過0.45 μm濾膜，Sephadex LH-20柱（3×100 cm）柱層析分離，分別用甲醇/水（0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、75:25、100:0）洗脫，每個(gè)比例洗脫2個(gè)柱體積[19]，1/20柱體積為一餾分，1.0 mLmin流速洗脫，收集40%甲醇洗脫組分，旋蒸除去溶劑并于-70 ℃冷凍干燥24 h，得Sephadex LH-20分離樣品。

Sephadex LH-20分離樣品（1 g）加入10 mL蒸餾水超聲溶解并過0.45 μm濾膜，ODS柱（2×100 cm）柱層析分離，分別用甲醇/水（0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、75:25、100:0）洗脫，每個(gè)比例洗脫2個(gè)柱體積，1/20柱體積為一餾分，1.0 mL/min流速洗脫，旋蒸除去溶劑并于-70 ℃冷凍干燥24 h，得ODS分離樣品，所得單體化合物經(jīng)HPLC檢測其純度。

1.2.3 分離樣品的高效液相色譜檢測 取一定量正丁醇萃取物（20 mg）、大孔樹脂富集樣品（6.5 mg）、Sephadex LH-20分離樣品（4 mg）、ODS分離樣品（2 mg），用1 mL乙腈溶解，0.45 μm濾膜過濾后，進(jìn)行HPLC分析，樣品純度按面積歸一化法計(jì)算。

色譜柱：Waters 600 SunFireTMC18柱（4.6×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸（15～30%乙腈，0～70 min），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長254 nm，進(jìn)樣10 μL分析。高效液相色譜（HPLC-PAD）紫外光譜掃描范圍：200～400 nm。

1.2.4 高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇

1.2.4.1 溶劑系統(tǒng)的確定 參考高速逆流色譜分離黃酮苷類化合物溶劑系統(tǒng)[20-21]。按照溶劑極性的不同，配制乙酸乙酯-正丁醇-水溶劑系統(tǒng)（體積比為1:1:1、2:1:2、4:1:4），正己烷-正丁醇-水溶劑系統(tǒng)（體積比為1:1:1、1:2:2、1:2:1）和正己烷-正丁醇-水-冰乙酸溶劑系統(tǒng)（體積比為1:2:1:0.1、1:1:1:0.1），考察乙酸乙酯、正己烷、正丁醇和冰乙酸對(duì)分配系數(shù)（k）的影響。

1.2.4.2 k值的測定 k值及分離度（α）的測定方法、參考值范圍參照文獻(xiàn)[19]。k值定義為：樣品溶解在不互溶的兩相溶劑中，上相中目標(biāo)化合物的色譜峰面積（S上）除以下相中目標(biāo)化合物的色譜峰面積（S下）（k=S上/S下），其中k的范圍為0.2～5.0，α的定義為α=k1/k2（k1＞k2），且α＞1.5。

1.2.5 高速逆流色譜法分離制備小葉金錢草中的黃酮苷 配制溶劑系統(tǒng)I：正己烷-正丁醇-水-冰乙酸（1:2:1:0.1，v/v/v/v）和系統(tǒng)II：正己烷-正丁醇-水-冰乙酸（1:1:1:0.1，v/v/v/v），于分液漏斗中充分振搖后在室溫下靜置過夜，分別將系統(tǒng)I、系統(tǒng)II的上下相分離并超聲脫氣20 min，以系統(tǒng)I的上相為固定相，系統(tǒng)I的下相為流動(dòng)相。儀器參數(shù)如下：循環(huán)水溫度45 ℃，主機(jī)正轉(zhuǎn)模式，轉(zhuǎn)速900 r/min，流動(dòng)相流速2 mL/min，檢測波長為254 nm，其余操作步驟同文獻(xiàn)[19]。固定相保留率（SF）計(jì)算方法為：SF（%）=[（螺旋管體積-流出固定相體積）/螺旋管體積]×100。其中溶劑系統(tǒng)I固定相保留率為，SF1（%）=[（300-110）]/300×100=63.3%，系統(tǒng)II的固定相保留率SF2（%）=[（300-115）]/300×100=61.6%。

開啟TBD 2000檢測系統(tǒng)，設(shè)置采集數(shù)據(jù)。取1.2.2中ODS分離樣品324 mg，用10 mL系統(tǒng)I上相液體溶解，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，記錄HSCCC色譜圖并收集分離組分。當(dāng)?shù)谝唤M色譜峰流出檢測器后，上相固定相不變，下相流動(dòng)相迅速切換為系統(tǒng)II的下相作為流動(dòng)相，繼續(xù)洗脫，繼續(xù)收集分離組分。

1.2.6 化合物核磁共振波譜表征 取單體化合物各10 mg，用0.5 mL DMSO-d6溶解，移入核磁管。通過核磁共振波譜儀對(duì)已分離化合物進(jìn)行波譜鑒定（1H NMR、13C NMR）。1H NMR參數(shù)：掃場范圍=-3.8247～16.1698 ppm，TD=65536，NS=8，DS=2，SWH=10000.000 Hz，F(xiàn)IDRES=0.152588 Hz，AQ=3.2767999 sec，RG=106.4，DW=50.000 usec，DE=6.50 usec，TE=298.0 K，D1=1.00000000 sec；13C NMR參 數(shù)：掃 場 范 圍=-18.3314～218.3255 ppm，TD=65536，NS=160，DS=4，SWH=29761.904 Hz，F(xiàn)IDRES=0.454131 Hz，AQ=1.1010048 sec，RG=192.1，DW=16.800 usec，DE=6.50 usec，TE=298.0 K，D1=2.00000000 sec，D11=0.03000000 sec。四甲基硅烷（TMS）定標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1H NMR、13C NMR圖譜在MestReNova 6.1.0軟件中處理，并進(jìn)行1H NMR化學(xué)位移積分和計(jì)算偶和常數(shù)（J），J的計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[19]。通過與文獻(xiàn)中化合物核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)一致即確定化合物結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)式通過ChemBioDraw 14.0畫出。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉金錢草各分離樣品HPLC分析

按照1.2.3方法分析樣品，正丁醇萃取物、DM 301大孔吸附樹脂富集樣品、Sephadex LH-20分離樣品以及ODS分離樣品的HPLC結(jié)果分別為圖1a～圖1d。由圖1a可知，正丁醇萃取物中大極性雜質(zhì)較多導(dǎo)致其他組分色譜峰并不明顯。而由圖1b可知，正丁醇萃取物經(jīng)DM 301大孔樹脂富集后，主要成分被明顯富集，但所包含的其它雜質(zhì)仍較多且復(fù)雜。經(jīng)Sephadex LH-20進(jìn)行純化后分析結(jié)果見圖1c，可知經(jīng)前期萃取富集和柱層析純化后，4個(gè)主要成分進(jìn)一步得到純化，其保留時(shí)間分別為：22.859，29.109，34.157和42.910 min。由1.2.3所述的色譜條件可知，正丁醇萃取物主要成分極性較大，因此大孔吸附樹脂富集樣品樣品經(jīng)Sephadex LH-20純化后，選擇ODS進(jìn)行進(jìn)一步分離，得到兩種單體化合物2、3和一組混合物，即ODS分離樣品。單體化合物純度分析見2.4，ODS分離樣品分析見圖1d，峰1、峰4為高速逆流色譜目標(biāo)分離成分。

圖1 不同萃取物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of different fractions

2.2 HSCCC溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化及確定

2.2.1 溶劑系統(tǒng)的確定 不同逆流色譜溶劑系統(tǒng)的k值變化如表1。根據(jù)HPLC分析及試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ODS分離樣品中的待分離目標(biāo)化合物極性較大且易溶于正丁醇和水，而逆流色譜中包含正丁醇的溶劑系統(tǒng)常被用于分離大極性化合物[22]。從表1可以看出，在包含乙酸乙酯的溶劑系統(tǒng)中（系統(tǒng)1、2、3），4號(hào)化合物的k均較大，不符合k的最適范圍， 另一方面，包含乙酸乙酯的溶劑系統(tǒng)具有更長的兩相分層時(shí)間，在HSCCC分離過程中兩相溶劑分層時(shí)間過長將不利于分離效果，因此不適合用作HSCCC分離的溶劑系統(tǒng)。

表1 ODS分離樣品在不同溶劑體系中的分配系數(shù)Table 1 Partition coefficients（K） of the reversed-phase silica gel sample in different two phase solvent systems

當(dāng)用正己烷替換溶劑系統(tǒng)中乙酸乙酯后（系統(tǒng)1和4），化合物的分配系數(shù)明顯減小而分離度明顯增加。當(dāng)正己烷比例減小或正丁醇比例增加時(shí)（系統(tǒng)4與5、6），化合物分配系數(shù)增加而分離度減小，但1號(hào)化合物的k太小而不利于分離，因此系統(tǒng)4、5、6不適合用作HSCCC分離的溶劑系統(tǒng)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Chen等[23]向溶劑系統(tǒng)中添加冰乙酸來改善化合物的分離。 因此在正己烷-正丁醇-水溶劑系統(tǒng)中加入冰乙酸來改善1號(hào)和4號(hào)化合物的分離，進(jìn)一步探索正己烷-正丁醇-水-冰乙酸溶劑比例。

2.2.2 正己烷-正丁醇-水-冰乙酸比例的確定 表1中（系統(tǒng)4和7，系統(tǒng)6和8）可以發(fā)現(xiàn)，溶劑系統(tǒng)中添加冰乙酸對(duì)化合物的分離度幾乎沒有影響，但卻有效地增加了目標(biāo)化合物的分配系數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)7（系統(tǒng)I）最適合分離1號(hào)化合物，系統(tǒng)8（系統(tǒng)II）最適合分離4號(hào)化合物。單一的一種溶劑系統(tǒng)難以做到同時(shí)1號(hào)和4號(hào)化合物，而HSCCC梯度洗脫方式能在確保1號(hào)化合物純度的情況下，在最短時(shí)間內(nèi)分離并節(jié)省4號(hào)化合物的分離時(shí)間，避免目標(biāo)化合物過早的與雜質(zhì)流出以確?；衔锏募兌?，因此選取上述兩種溶劑系統(tǒng)并以梯度洗脫方式分離目標(biāo)化合物。

2.3 HSCCC分離結(jié)果

參照1.2.5中并對(duì)ODS樣品進(jìn)行高速逆流色譜分離，得到2個(gè)分離組分（圖2）并進(jìn)行HPLC分析。收集圖2中88～102 min（組分I）及310～330 min（組分II）兩組分進(jìn)行HPLC分析，HPLC分析結(jié)果見2.4。

圖2 ODS分離樣品的高速逆流色譜圖Fig.2 HSCCC c hromatogra m of th e OD S s ample

2.4 單體化合物HPLC分析

按1.2.3的HPLC方法分析樣品，HSCCC中組分I對(duì)應(yīng)圖3a中1號(hào)化合物，Rt=22.859 min，純度97.7%，對(duì)應(yīng)圖1中1號(hào)色譜峰。HSCCC中組分II對(duì)應(yīng)圖3d中4號(hào)化合物，Rt=42.910 min，純度95.3%，對(duì)應(yīng)圖1中4號(hào)色譜峰。2.1中經(jīng)ODS分離得到的兩個(gè)單體化合物分別對(duì)應(yīng)圖3b中2號(hào)化合物，Rt=29.109 min，純度96.8%，即圖1中2號(hào)色譜峰。圖3c中3號(hào)化合物，Rt=34.157 min，純度95.7%，對(duì)應(yīng)圖1中3號(hào)色譜峰。將柱層析與高速逆流色譜所分離得到化合物經(jīng)冷凍干燥后稱重得1號(hào)化合物（100.23 mg）、2號(hào)化合物（150.29 mg）、3號(hào)化合物（128.43 mg）和4號(hào)化合物（105.49 mg）。各色譜圖中小圖對(duì)應(yīng)各色譜峰的紫外吸收光譜，由紫外光譜分析得知，色譜峰紫外吸收在峰帶I，300～400 nm及峰帶II，220～280 nm有明顯紫外吸收，符合黃酮類化合物紫外光譜吸收特征，故所分離得到的化合物為黃酮類化合物[24]。

圖3 HSCCC及反相硅膠分離化合物的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the targeted compounds purified by HSCCC and reversed-phase silica gel.

2.5 高速逆流色譜出峰經(jīng)驗(yàn)公式

為了驗(yàn)證HSCCC梯度洗脫是否真正起到了縮短分離時(shí)間的作用，對(duì)課題組前期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行歸納，總結(jié)高速逆流色譜出峰經(jīng)驗(yàn)公式，當(dāng)k≥1時(shí)，有如下公式：

式中，t為高速逆流色譜色譜峰出峰時(shí)間（min）；Vc為螺旋管體積（mL）；F為流動(dòng)相流速（mL/min）；SF為固定相保留率（%）；k為分配系數(shù)。

據(jù)此公式1估算溶劑系統(tǒng)I中化合物4的出峰時(shí)間，t=300/2[0.633（4.68-1）+1]=499.416 min，小于化合物4實(shí)際分離時(shí)間（約300～310 min）。根據(jù)系統(tǒng)I切換系統(tǒng)II的時(shí)間（150 min），以此為基點(diǎn)計(jì)算系統(tǒng)II條件下，估算化合物4的出峰時(shí)間。t=300/2[0.616（1.17-1）+1]=165.708 min，以及基點(diǎn)時(shí)間150 min預(yù)計(jì)分離時(shí)間315 min左右，與實(shí)際分離時(shí)間較為接近。

2.6 結(jié)構(gòu)表征

1、2和4號(hào)化合物的1H NMR和13C NMR信息與前期實(shí)驗(yàn)工作所得化合物信息相同[25]，鑒定為楊梅素3,3'-二-α-L-鼠李糖苷（1號(hào)化合物）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（2號(hào)化合物）和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（4號(hào)化合物）?；衔?前期實(shí)驗(yàn)尚未分離得到，核磁信息如下，1～4號(hào)化合物結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4 1～4號(hào)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.4 Chemical structure of Compound 1～4

3號(hào)化合物：1H NMR（DMSO-d6，500 MHz，ppm）：δ7.53（1H，d，J=2.1 Hz，2'-H），7.46（1H，dd，J=2.1 Hz，2.1 Hz，6'-H），6.97（1H，d，J=8.4 Hz，5'-H），6.27（1H，d，J=1.9 Hz，8-H），6.11（1H，d，J=1.9 Hz，6-H），5.30（1H，s，3-rha-1-H），5.26（1H，s，3'-rha-1-H），3.47-3.97（4H，m，3-rha-2,3,4,5），3.11-3.96（4H，m，3'-rha-2,3,4,5），1.17（3H，d，J=6.2 Hz，3'-rha-CH3），0.81（3H，d，J=6.2 Hz，3-rha-CH3）。13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz，ppm）：δ177.70（C-4），167.84（C-7），161.65（C-5），157.16（C-8a），156.81（C-2），144.78（C-3'），116.76（C-5'），119.35（C-2'），151.79（C-4′），134.38（C-3），121.05（C-1'），125.25（C-6'），103.45（C-4a），102.05（C-1''），100.95 （C-1'''），99.97（C-6），94.46（C-8），72.41（C-4''），71.63（C-4'''），71.04（C-3''），70.86（C-3'''），70.80（C-2''），70.60（C-2'''），70.49（C-5''），70.06（C-5'''），18.38（C-6'''），17.95（C-6''）。通過與文獻(xiàn)[26]對(duì)比，鑒定化合物3為槲皮素3,3'-二-α-L-鼠李糖苷（Quercetin 3,3'-di-α-L-rhamnopyranoside）。

從化合物的來源來看，上述四種化合物在其他植物中也有報(bào)道，其中化合物1、3只在大金錢草（Lysimachia christinaeHance）中[26]分離得到，目前還沒有關(guān)于這兩種化合物活性方面的報(bào)道?；衔?和4除在前期工作中分離得到外，也廣泛分布在其他植物中，如穿心蓮（Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees.）[27]、鵝不食草（Centipeda minima（L.）A.Br.et Aschers.）[28]及獨(dú)腳金（Striga asiatica（L.）O. Kuntze）[29]等?；钚苑矫婊衔?和4具有抗氧化活性、降糖活性[30]、抗心肌缺血活性[31]、抗癌及抗炎[32]等藥理活性。而從小葉金錢草中分離得到的黃酮苷類成分則進(jìn)一步豐富了上述四種化合物的植物來源，為進(jìn)一步研究藥理活性奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本文采用柱層析與高速逆流色譜結(jié)合的方式分離制備小葉金錢草中四種黃酮苷類成分，以正己烷-正丁醇-水-冰乙酸（系統(tǒng)I：1:2:1:0.1，v/v/v/v）及正己烷-正丁醇-水-冰乙酸（系統(tǒng)II：1:1:1:0.1，v/v/v/v）為溶劑系統(tǒng)，在轉(zhuǎn)速900 r/min、流速2 mL/min的條件下，以梯度洗脫方式分離制備分配系數(shù)差異較大的黃酮苷類化合物，并輔以高速逆流色譜出峰經(jīng)驗(yàn)公式驗(yàn)證洗脫效果。分離化合物經(jīng)1H NMR和13C NMR鑒定為楊梅素3,3'-二-α-L-鼠李糖苷（1）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（2）、槲皮素3,3'-二-α-L-鼠李糖苷（3）和芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（4），純度均高于95%，其中化合物3為首次從小葉金錢草中分離得到，為進(jìn)一步研究小葉金錢草的化學(xué)成分、藥效以及綜合利用奠定了理論基礎(chǔ)。