袁心田，陳華國，趙 超，龔小見，周 欣,

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽 550002；2.貴州師范大學(xué)，貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽 550001；3.貴州師范大學(xué)，貴州省藥物質(zhì)量控制及評價技術(shù)工程實驗室，貴州貴陽 550001）

桑葚（Mori fructus）為桑樹的成熟果實，屬于桑科植物桑（Morus albaL.）的果穗。桑葚味甘性寒，酸甜汁多，入心、肝、腎經(jīng)，為常食的水果之一，被收錄于中國“藥食同源”目錄和《中國藥典》2020版，具有補肝益腎、生津潤燥、烏發(fā)明目、利尿、保健和消暑等功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，桑葚中含有多種維生素、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、有機酸和微量元素等營養(yǎng)成分和多酚類、多糖、生物堿、類胡蘿卜素等多種活性成分[2-3]。桑葚多糖（Mori fructuspolysaccharide，MFP）是桑葚中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、保護肝臟等多種生物活性[4]。

隨著對多糖構(gòu)-效關(guān)系的深入研究，多糖的生物活性受到其相對分子量、單糖組成、糖苷鍵類型、分子支鏈分支度及化學(xué)修飾等影響[5]。不同分子量對多糖的生物活性有一定的影響[6]，而篩選出活性較好的分子量范圍有利于提高多糖的利用度，開發(fā)出活性更好的多糖。目前常用的多糖分級技術(shù)為柱層析法和分級醇沉法[7]，而利用膜技術(shù)對多糖進行分級，可以提高分級效率、控制多糖分子量范圍，并且確保多糖的結(jié)構(gòu)和純度不受化學(xué)試劑的影響。蔡銘等[8]采用膜技術(shù)分級分離靈芝多糖，發(fā)現(xiàn)3種粗多糖均有一定的抗氧化能力，其中GLP100的羥自由基和DPPH自由基清除能力好于其他兩種多糖，GLP1的ABTS+自由基清除能力比其他兩種多糖效果更好。崔婷婷等[9]利用膜技術(shù)分級分離鎖陽多糖，發(fā)現(xiàn)在50～100 kDa分子量范圍的鎖陽多糖有更好的抗氧化活性。

目前對于桑葚多糖分級常用的方法為柱層析法[10-11]和分級醇沉法[12]。暫無文獻采用膜技術(shù)對桑葚多糖進行分級，且無研究表明不同分子量的桑葚多糖具有生物活性的差異。所以本實驗采用膜技術(shù)對桑葚多糖進行分級，對不同分子量的桑葚多糖的主要化學(xué)成分進行測定，以及對不同分子量的桑葚多糖進行活性篩選。通過以上研究為后期桑葚多糖分級技術(shù)的改進升級和桑葚多糖生物活性的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚干品 購買于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，產(chǎn)品批號210702，四川博仁藥業(yè)有限責(zé)任公司；葡萄糖（純度≥98%）、葡萄糖醛酸（純度≥96%） 上海西寶生物科技股份有限公司；苯酚、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）、焦磷酸鈉 上海凜恩科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白、α-葡萄糖苷酶（酶活力1 kU）、阿卡波糖、α-淀粉酶（酶活力1 KU）、木瓜蛋白酶（酶活力100 kU/g）、可溶性淀粉、透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鈉、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）、乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH） 北京索萊寶科技有限公司；濃硫酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水楊酸、硫酸亞鐵、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、無水乙醇 天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸（Vitamin C，VC） 天津博迪化工股份有限公司；四硼酸鈉 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍 上海藍季生物科技發(fā)展有限公司；咔唑 上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

HC-GL1812-1X多功能膜分離實驗系統(tǒng) 成都和誠過濾技術(shù)有限公司；XS105DU METTLER TOLEDO十萬分之一電子天平 國際貿(mào)易（上海）有限公司電子天平；Max Plus 384光吸收酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司酶標(biāo)儀；FD-80冷凍干燥機

北京博益康醫(yī)院實驗儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 取一定量的桑葚，70 ℃烘干，用粉碎機粉碎，過40目篩后得到桑葚干粉。以石油醚為溶劑，采用冷卻回流法脫脂，料液比1:2 g·mL-1，脫脂2次，每次2 h，溫度65 ℃，濾渣為脫脂桑葚樣品，備用。

1.2.2 桑葚多糖的提取與純化 參考譚西[13]的提取方法，并進行一定的修改。取200 g的脫脂桑葚樣品，以水為溶劑，在熱水（90 °C）中浸提2 h，料液比1:15 g·mL-1。對濾液離心（轉(zhuǎn)速4000 r·min-1，10 min）和減壓過濾后保存濾液，對濾渣以相同條件進行熱水浸提。反復(fù)2次并合并濾液，最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液至1000 mL左右得到濃縮液。參考王倩等[14]采用三氯乙酸+木瓜蛋白酶法進行脫蛋白，并進行一定的修改。向濃縮液中加入3%三氯乙酸溶液，體積比1:1，室溫放置20 min，離心收集上清液。調(diào)節(jié)上清液pH至6～7，加入3%木瓜蛋白酶，50 ℃反應(yīng)45 min，離心（轉(zhuǎn)速4000 r·min-1，10 min）收集上清液。此過程進行兩次，最終得到桑葚多糖粗提液。

1.2.3 桑葚多糖粗提液的分級分離 取桑葚多糖粗提液，用300 kDa濾膜在0.2 MPa，5.5 L·min-1條件下超濾分級，截留液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后按體積比1:4加入乙醇，4 °C下靜置過夜。次日離心（轉(zhuǎn)速4000 r·min-1，10 min）得沉淀，真空冷凍干燥得多糖，記為MFP300；取300 kDa濾過液，用50 kDa濾膜進行上述操作得多糖，記為MFP50；取50 kDa濾過液，用5 kDa濾膜進行上述操作得多糖，記為MFP5；取5 kDa濾過液，用1 kDa濾膜進行上述操作得多糖，記為MFP1。

1.2.4 桑葚多糖中總糖含量的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考論文中的苯酚-硫酸法[13]。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，將濃度配制為0.1 mg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補至0.50 mL，各加入0.30 mL的5%苯酚溶液，迅速加入1.50 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴30 min，冷卻至室溫后，490 nm處測定吸光度A490。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.172x+0.109，R2=0.999。

1.2.4.2 總糖含量的測定 用1.2.4.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中總糖含量計算公式為：

式中：W為桑葚多糖中總糖含量，%；A為樣品溶液反應(yīng)后在490 nm處的吸光度；m為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 桑葚多糖中蛋白質(zhì)含量的測定

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考論文中的考馬斯亮藍G-250法[13]。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取1 mL 5 mg·mL-1牛血清蛋白，將濃度配制為0.2 mg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0、20、40、60、80、100、120、140 μL牛血清蛋白溶液于試管中，補蒸餾水至200 μL，搖勻，各加入1 mL考馬斯亮藍溶液，搖勻，避光放置10 min，595 nm處測定吸光度值A(chǔ)595。以牛血清蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.704x+0.2221，R2=0.9928。

1.2.5.2 蛋白質(zhì)含量的測定 用1.2.5.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中蛋白質(zhì)含量計算公式為：

式中：Y為桑葚多糖中蛋白質(zhì)含量，%；A為樣品溶液反應(yīng)后在595 nm處的吸光度；m為稀釋倍數(shù)。

1.2.6 桑葚多糖中糖醛酸含量的測定

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考咔唑-硫酸法[15]。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取10.00 mg葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，將濃度配制為0.1 mg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水定容至1 mL，冰水浴中加入5 mL四硼酸鈉-硫酸溶液，旋渦混合器混勻，沸水浴20 min，取出后立即冷卻至室溫，加0.15%咔唑溶液0.2 mL，搖勻，室溫反應(yīng)2 h，523 nm處測定吸光度值A(chǔ)523。以葡萄糖醛酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.2456x+0.1，R2=0.9992。

1.2.6.2 糖醛酸含量的測定 用1.2.6.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中糖醛酸含量計算公式為：

式中：T為桑葚多糖中糖醛酸含量，%；A為樣品溶液反應(yīng)后在523 nm處的吸光度；m為稀釋倍數(shù)。

1.2.7 桑葚多糖中還原糖含量的測定

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻[16]DNS法。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，將濃度配制為1 mg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，分別置于25 mL試管中，不足1 mL的用蒸餾水補充至1 mL，再加入DNS溶液2 mL，混合均勻后，沸水浴5 min，迅速流水冷卻，加水至刻度線，550 nm測定吸光度值A(chǔ)550。空白調(diào)零，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸收度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.3529x+0.0913，R2=0.9993。

1.2.7.2 還原糖含量的測定 用1.2.7.1中的方法測定吸光度。桑葚多糖中還原糖含量計算公式為：

式中：D為桑葚多糖中還原糖含量，%；A為樣品溶液反應(yīng)后在550 nm處的吸光度；m為稀釋倍數(shù)。

1.2.8 不同分子量桑葚多糖的抗氧化活性測定

1.2.8.1 DPPH自由基清除活性測定 DPPH自由基清除活性測定選參考Zhang等[17]的方法，并稍作修改。取3 mL 0.2 mg·mL-1的DPPH乙醇溶液，與2 mL MFP溶液充分混勻，避光靜置20 min后，以無水乙醇作空白調(diào)零，517 nm波長測吸光度A517，以蒸餾水代替多糖溶液作陰性對照，VC作陽性對照，DPPH自由基清除率計算公式如下所示。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A0為空白溶液吸光度；A2為不含DPPH的樣品溶液吸光度。

1.2.8.2 ABTS+自由基清除活性測定 ABTS+自由基清除活性測定參考田義敏[18]的方法。精密稱取38.90 mg ABTS和15.16 mg過硫酸鉀溶液混合，分別用蒸餾水定容至10 mL，按1:1混合后置于4 ℃冰箱中避光反應(yīng)12～16 h，形成ABTS儲備液。使用前用水稀釋成工作液，使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02。將MFP溶液和ABTS儲備液溶液按1:1體積加入96孔板中，在室溫黑暗條件下反應(yīng)15 min，以蒸餾水代替多糖溶液作為空白，測定在734 nm下的吸光度A734，VC做陽性對照，ABTS+自由基清除率計算公式如下所示。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A0為空白溶液吸光度；A2為不含ABTS的樣品溶液吸光度。

1.2.9 不同分子量桑葚多糖的降血糖活性測定

1.2.9.1α-葡萄糖苷酶抑制活性測定α-葡萄糖苷酶抑制活性測定參考龍曉珊[19]的方法，并稍作修改。α-葡萄糖苷酶溶液（0.1 U·mL-1）由PBS緩沖溶液（0.1 mol·L-1，pH6.9）配制。將50 μL MFP溶液和25 μLα-葡萄糖苷酶溶液混合，37 ℃反應(yīng)10 min，之后加入25 μL對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（1.5 mmol·L-1）。充分混勻后于37 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL碳酸鈉（0.2 mol·L-1）停止反應(yīng)，在405 nm下測定其吸光度A405，以阿卡波糖作為陽性對照，計算α-葡萄糖苷酶抑制率，抑制率公式如下所示。

式中：A1為樣品溶液得吸光度；A2為不含α-葡萄糖苷酶的樣品溶液吸光度；A0為空白溶液的吸光度。

1.2.9.2α-淀粉酶抑制活性測定α-淀粉酶抑制活性測定參考Chen等[20]方法，并稍作修改。α-淀粉酶溶液（0.5 mg·mL-1）由PBS緩沖溶液（0.1 mol·L-1，pH6.9）配制。將100 μL MFP和100 μLα-淀粉酶溶液混合，37 ℃水浴10 min，加入200 μL 1%可溶性淀粉溶液，37 ℃反應(yīng)10 min，沸水浴中反應(yīng)10 min。沸水浴結(jié)束后加入200 μL DNS試劑，在沸水浴顯色反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)物冷卻至室溫并加入4 mL蒸餾水稀釋，在540 nm處測定吸光度A540，抑制率公式如下所示。

式中：A1為多糖溶液及α-淀粉酶溶液正常反應(yīng)的吸光度；A2為用緩沖液代替α-淀粉酶溶液時的吸光度；A3為用緩沖液代替多糖溶液時的吸光度；A4為用緩沖液代替多糖溶液及α-淀粉酶溶液時的吸光度。

1.2.10 不同分子量桑葚多糖的透明質(zhì)酸酶抑制活性測定 透明質(zhì)酸酶抑制活性采用CTAB濁度法進行測定，參考易曉敏[21]的方法，并稍作修改。以pH6.0，0.2 mol·L-1乙酸-乙酸鈉溶液為緩沖液，用緩沖液配制0.5 mg·mL-1透明質(zhì)酸酶的溶液及3.44 mg·mL-1透明質(zhì)酸鈉溶液。取100 μL MFP溶液于10 mL試管中，加入100 μL透明質(zhì)酸酶溶液，再用緩沖液補充定容至0.9 mL，振蕩均勻后，置于37 ℃的恒溫水浴中，預(yù)熱15 min后加入100 μL透明質(zhì)酸鈉溶液，并開始計時，準(zhǔn)確計時10 min，迅速加入4 mL CTAB溶液（以2% NaOH溶液為溶劑配制的2.5% CTAB溶液）終止反應(yīng)，混合均勻，常溫靜置10 min后測定反應(yīng)液在405 nm波長下的吸光度A405，抑制率公式如下所示。

式中：A1為多糖溶液及透明質(zhì)酸酶溶液正常反應(yīng)的吸光度；A2為用緩沖液代替透明質(zhì)酸酶溶液時的吸光度；A3為用緩沖液代替多糖溶液時的吸光度；A4為用緩沖液代替多糖溶液及透明質(zhì)酸酶時的吸光度。

1.2.11 不同分子量桑葚多糖體外乙醇脫氫酶活性測定 乙醇脫氫酶活性采用瓦勒-霍赫法測定，參考了鄧青芳[22]的方法。在酶標(biāo)板中依次加入100 μL焦磷酸鈉緩沖液（pH8.8）、70 μL 2 mmol·L-1NAD+、35 μL 2 mol·L-1乙醇及20 μL MFP溶液，混勻后，35 ℃下密封溫育5 min，時間到后立即向酶標(biāo)板中加入20 μL 0.1 U·mL-1ADH，搖勻后立即用酶標(biāo)儀測定其340 nm處的吸光度A340，每隔10 s讀取1次吸光度值，連續(xù)測定5 min，并記錄數(shù)據(jù)，空白組則是以20 μL蒸餾水代替樣品溶液，其余步驟不變，最后根據(jù)公式（10）計算ADH活性、公式（11）計算ADH的抑制（激活）率。

式中：E為ADH酶活性，U·mL-1；E1為樣品組酶活性，U·mL-1；E0為空白組酶活性，U·mL-1；ΔA340為反應(yīng)最初線性部分340 nm波長處吸光度每1 min的增值；6.2為NAD+在340 nm處的摩爾消光系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，使用IBM SPSS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。采用GraphPad Prism 8軟件作圖，實驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量的桑葚多糖的主要成分分析

采用水提醇沉法從桑葚中提取多糖，并使用多功能膜分離設(shè)備對提取液進行分級得到MFP1、MFP5、MFP50和MFP300。四個組分顏色變化由淺到深，MFP1顏色最淺，為紫紅色；MFP300顏色最深，為深紫色。四個組分的主要成分如表1所示。結(jié)果表明，MFP5中總糖和糖醛酸含量最高，為68.45%±1.53%和22.78%±2.32%；其次是MFP300，為66.32%±0.70%和21.48%±1.24%；MFP1兩者含量最低，為46.34%±0.73%和3.34%±1.57%。MFP5中還原糖含量最低，為6.03%±3.92%；MFP1中還原糖含量最高，為16.51%±0.83%。蛋白質(zhì)含量普遍偏低，MFP300含量最高，為3.67%±0.18%，MFP1含量最低，為0.10%±0.08%。桑葚多糖的主要成分含量不是按照分子量大小順序依次降低，且多糖主要集中在MFP5和MFP300兩個組分。四個組分中蛋白質(zhì)含量較低，說明純化效果較好，蛋白質(zhì)對活性影響可以忽略。

表1 不同分子量桑葚多糖的主要成分含量Table 1 Contents of main components of MFP with different molecular weights

2.2 不同分子量桑葚多糖的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 四個組分的DPPH自由基清除活性如圖1a所示，4種多糖均有較好的DPPH自由基清除活性，其中，MFP300在0.1、0.6和1.2 mg·mL-1濃度下清除率最高，且與其他三組多糖相比有極顯著差異（P＜0.01），所以選擇MFP300研究其“量-效”關(guān)系，如圖1b所示。MFP300的DPPH自由基清除能力隨濃度的升高而增強。當(dāng)MFP300濃度為1.2 mg·mL-1時，清除率最大為97.09%±0.14%，與同等濃度下VC對DPPH自由基的清除率無顯著差異（P＞0.05）。MFP300的IC50值為0.2235 mg·mL-1，VC的IC50值為0.005276 mg·mL-1，與錢燕芳等[23]通過超聲提取得到的桑葚多糖相比，MFP300的IC50值較小，表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除活性。

圖1 不同分子量桑葚多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of MFPs of different molecular weight against DPPH free radicals

2.2.2 ABTS+自由基清除活性 四個組分的ABTS+自由基清除活性如圖2a所示，當(dāng)濃度為0.6 mg·mL-1時，4種多糖的清除率均大于50%，其中MFP300活性最好，在濃度為1.2 mg·mL-1時，MFP300的ABTS+自由基清除率為98.23%±0.54%，與MFP1和MFP5相比有極顯著差異（P＜0.01），與MFP50相比有顯著差異（P＜0.05），所以選擇MFP300研究其“量-效”關(guān)系，如圖2b所示。MFP300的IC50值為0.2979 mg·mL-1，VC的IC50值為0.02981 mg·mL-1；在測定范圍內(nèi)，MFP300對ABTS+自由基的清除率隨濃度先升高后趨于平緩，在1.2 mg·mL-1時與同濃度下的VC無顯著差異（P＞0.05），與Deng等[24]采用酶輔助提取的桑葚多糖相比，MFP300的IC50值更小，表明MFP300有較好的ABTS+自由基清除能力。

圖2 不同分子量桑葚多糖對ABTS+自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of MFPs of different molecular weight against ABTS+ free radicals

多糖是天然高分子多聚物，分子量高低會影響其生物活性。一般而言，低分子量多糖更容易進入生物體內(nèi)，活性更好；但多糖并非分子量越低活性越好，因為分子量過低，無法形成多糖產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)[25]。Su等[26]發(fā)現(xiàn)木耳多糖的DPPH、ABTS+和羥自由基清除活性與其分子量呈顯著正相關(guān)；李小蓉等[27]發(fā)現(xiàn)海帶中高分子量的巖藻多糖具有較好的抗衰老活性。與其他組分相比，MFP300分子量較大，可形成較多產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)，進而表現(xiàn)出較好的DPPH和ABTS+自由基清除能力。

2.3 不同分子量桑葚多糖的降血糖活性

2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性α-葡萄糖苷酶抑制劑可降低食物中葡萄糖的消化速率，抑制餐后血糖的升高，是防治糖尿病的有效手段之一[28]。如圖3a所示，不同分子量的桑葚多糖對α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用，且有隨著濃度升高抑制率增強的趨勢。在同等濃度對比下，MFP1與阿卡波糖相比均無顯著差異（P＞0.05）；1 mg·mL-1時，MFP1抑制率已超過50%，為63.02%±4.99%，與其他組多糖相比有顯著差異（P＜0.05），故選取MFP1繪制其“量-效”關(guān)系曲線，如圖3b所示。MFP1的IC50值為0.7944 mg·mL-1，阿卡波糖的IC50值為0.4050 mg·mL-1，表明阿卡波糖的抑制效果要優(yōu)于MFP1，但與文獻報道的相比[29]，MFP1的IC50更小。綜上所述，MFP1有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖3 不同分子量桑葚多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.3 Inhibitory activity of MFPs of different molecular weights against α-glucosidase

2.3.2α-淀粉酶抑制活性α-淀粉酶抑制劑可降低食物中淀粉的消化速率，抑制餐后血糖的升高是防治糖尿病的有效手段之一[30]。如圖4a所示，不同分子量的桑葚多糖對α-淀粉酶均有一定抑制作用，且有隨著濃度升高抑制率增強的趨勢。與其他三組多糖相比，MFP1表現(xiàn)出更強的抑制活性：5 mg·mL-1時，MFP1的抑制率超過50%，為69.51%±2.23%；10 mg·mL-1時，MFP1的抑制率極顯著地高于其他三組多糖和阿卡波糖的抑制率（P＜0.01），所以選取MFP1研究其“量-效”曲線如圖4b所示。MFP1的IC50值為4.6419 mg·mL-1，阿卡波糖的IC50值為1.5916 mg·mL-1，表明阿卡波糖的抑制效果要優(yōu)于MFP1，但與已有文獻相比[29]，MFP1的IC50更小。結(jié)果表明，MFP1有較好的α-淀粉酶抑制活性。

圖4 不同分子量桑葚多糖對α-淀粉酶的抑制能力Fig.4 Inhibitory ability of MFPs of different molecular weights on α-amylase

2.4 不同分子量桑葚多糖的抗過敏活性

透明質(zhì)酸酶是降解透明質(zhì)酸的水解酶，是機體結(jié)締組織細胞外基質(zhì)的主要成分，與大多數(shù)由IgE介導(dǎo)的I型和T細胞介導(dǎo)的IV型過敏反應(yīng)有關(guān)，因此，透明質(zhì)酸酶體外抑制實驗是體外快速篩選抗過敏藥物的有效方法[31]。如圖5a所示，不同分子量的桑葚多糖對透明質(zhì)酸酶均有一定的抑制作用。其中，MFP300的抑制率隨濃度增大而升高，且在1.2 mg·mL-1時，抑制率為53.9%±5.87%，與其他三組有顯著差異（P＜0.05），所以選取MFP300研究其“量-效”關(guān)系，如圖5b所示。MFP300的透明質(zhì)酸酶抑制能力的IC50值為0.6634 mg·mL-1，表明MFP300有較好的抗過敏活性。

圖5 不同分子量桑葚多糖對透明質(zhì)酸酶的抑制能力Fig.5 Inhibitory ability of MFPs of different molecular weight on hyaluronidase

2.5 不同分子量桑葚多糖的體外乙醇脫氫酶活性

ADH是一種肝臟中重要的代謝酶，它能利用NAD+作為輔助性因子催化乙醇氧化生成還原型輔酶I（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和相應(yīng)的羰基化合物，這是哺乳動物肝臟酒精代謝的限速步驟[13]。因此，通過檢測ADH體外活性來評價活性物質(zhì)對肝臟的保護作用具有重要意義。如圖6a所示，大部分桑葚多糖在體外表現(xiàn)出激活A(yù)DH活性。盡管MFP300在低濃度中表現(xiàn)出抑制ADH活性，但其在中和高濃度表現(xiàn)出較好的激活A(yù)DH活性，與其他三組相比有顯著差異（P＜0.05），故選取MFP300研究其“量-效”關(guān)系，如圖6b所示。MFP300對ADH的激活能力的IC50為10.2646 mg·mL-1，這與文獻報道的不同[32]，這可能是提取和純化工藝不同導(dǎo)致的。

圖6 不同分子量桑葚多糖的乙醇脫氫酶活性Fig.6 Alcohol dehydrogenase activity of MFPs of different molecular weight

3 討論與結(jié)論

分子量是影響多糖生物活性的一個重要因素，而不同來源的多糖產(chǎn)生生物活性的最佳分子量范圍不同[33]。朱曉冉等[34]發(fā)現(xiàn)小分子量（分子量＜30 ku）的黑木耳多糖的抗氧化活性更好；Xu等[35]利用H2O2對黑加侖多糖進行降解，得到DBCP-1（1.3×104kDa）和DBCP-2（9.62×103kDa）兩種低分子量多糖，并發(fā)現(xiàn)降解后的多糖比未降解的多糖有更好的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性。

本實驗采用300、50、5和1 kDa四種不同孔徑超濾膜對桑葚多糖進行分級。不同分子量段多糖的主要成分有明顯的不同，MFP1、MFP5、MFP50和MFP300的總糖含量分別為46.34%、68.45%、48.60%和66.32%，糖醛酸含量分別為3.34%、22.78%、16.11%和21.48%，還原糖含量分別為16.51%、6.03%、7.90%和6.67%。此外，體外生物活性表明，MFP300的抗氧化、抗過敏和ADH活性最好，而MFP1的降血糖活性最好，這表明分子量大小會影響桑葚多糖的生物活性。綜上所述，本實驗利用不同孔徑濾膜對桑葚提取液進行處理，多糖的主要化學(xué)成分和生物活性差異說明膜技術(shù)在桑葚多糖分級分離中的應(yīng)用是有效的，為桑葚多糖的分級分離提供了一種新的思路，也為桑葚多糖的生物活性測定提供理論及實驗基礎(chǔ)。