李 歡，鄧舜洲，朱芝秀

江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的總稱，能耐受動(dòng)物胃腸道內(nèi)的酸性環(huán)境，廣泛分布在恒溫動(dòng)物和魚類胃腸道中[1]。近年來，人們對(duì)生活水平的要求日益嚴(yán)格，在我國的大部分地區(qū)，尤其是南方的城市中，乳酸菌的應(yīng)用已經(jīng)成為一大熱潮。目前，乳酸菌在食品加工行業(yè)、醫(yī)療保健行業(yè)、畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中大量應(yīng)用[2-3]。尤其是以乳酸菌為代表的微生態(tài)制劑，因其具有維持動(dòng)物腸道微生物平衡、預(yù)防疾病、促進(jìn)生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和改善畜禽飼養(yǎng)環(huán)境等作用，日益成為各大飼料加工企業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。其中，從魚類腸道提取的具有抑菌效果的乳酸菌，可通過生物拮抗作用調(diào)節(jié)腸道微生物的生態(tài)環(huán)境、增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的屏障層、提高動(dòng)物的免疫機(jī)能，對(duì)各種魚類的營養(yǎng)改善、免疫增強(qiáng)以及疾病防治都具有重要的作用[4]。

隨著人們生活水平的不斷提升，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的安全性也受到了重視，嗜水氣單胞菌因其感染暴發(fā)力強(qiáng)、致病率高、傳染速度快等特點(diǎn)成為了對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有重要危害的病原菌，如何在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中防治嗜水氣單胞菌成為一大焦點(diǎn)問題[5]。目前，臨床上對(duì)于嗜水氣單胞菌的防治仍以抗生素治療為主，然而抗生素治療帶來的藥物殘留以及細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，引起了國內(nèi)的重視。近日來，國家開始實(shí)施《飼料和飼料添加劑管理?xiàng)l例》（國務(wù)院令第609號(hào)），以及即將施行《新食品安全法》，預(yù)示著國家將進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)企業(yè)生產(chǎn)的監(jiān)管，尤其是對(duì)飼料添加劑、藥物添加劑使用的監(jiān)管。因此，如何在降低成本的同時(shí)提高產(chǎn)品的安全性與品質(zhì)，已經(jīng)成為新形勢(shì)下對(duì)畜禽養(yǎng)殖者及飼料加工企業(yè)的重大考驗(yàn)。同時(shí)，飼料添加劑的選擇和應(yīng)用成為關(guān)鍵。因此，本試驗(yàn)對(duì)魚源乳酸菌進(jìn)行水產(chǎn)主要病原菌嗜水氣單胞菌體外抑制試驗(yàn)，并進(jìn)一步開展抑制作用影響因素的試驗(yàn)，擬為減少抗生素的藥物殘留問題提供解決方案以及魚源乳酸菌在水產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗(yàn)用菌。嗜水氣單胞菌C-1、C-2、C-3，魚源乳酸菌Y-2、Y-6、Y-7、Y-10、Y-11、Y-13：均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院預(yù)防獸醫(yī)教研室提供。

2）主要儀器。電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為HH.BII.420BS），購自上海躍進(jìn)科學(xué)儀器廠；立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌鍋（型號(hào)為LDZX-40BI），購自上海申安醫(yī)療器械廠；數(shù)顯游標(biāo)卡尺，購自上海上工儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，購自蘇州凈化集團(tuán)；牛津杯：購自上海申源科學(xué)儀器有限公司。

3）主要試劑。乳酸菌MRS 培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、溴甲酚紫蛋白胨培養(yǎng)基：均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方 法

1）魚源乳酸菌體外抑菌試驗(yàn)。

①嗜水氣單胞菌CFU 檢測(cè)。無菌操作，將嗜水氣單胞菌C-1、C-2、C-3接種于普通肉湯，培養(yǎng)24 h 后，按10-1倍遞減稀釋至10-10，用移液器取0.2 μL 的各稀釋度于平板上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)定嗜水氣單胞菌CFU。

②魚源乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑制試驗(yàn)。按照瓊脂擴(kuò)散法，將魚源乳酸菌Y-2、Y-6、Y-7、Y-10、Y-11、Y-13 接種于MRS 肉湯，37 ℃震蕩48 h。將嗜水氣單胞菌C-1、C-2、C-3培養(yǎng)液分別稀釋為1×105，均勻涂布于普通瓊脂培養(yǎng)基表面，將牛津杯等距離放置其上，用注射器將Y-2、Y-6、Y-7、Y-10、Y-11、Y-13 培養(yǎng)液上清液按一定順序緩慢注入牛津杯中，放于4 ℃冰箱，待菌液全部擴(kuò)散完畢后放于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測(cè)量并記錄抑菌圈大小。

2）魚源乳酸菌體外抑制作用的影響因素。

①乳酸菌產(chǎn)酸強(qiáng)度與抑制作用相關(guān)性。無菌操作，將6 株乳酸菌分別點(diǎn)種于溴甲酚紫蛋白胨培養(yǎng)基，放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，每天觀察產(chǎn)酸圈的大小，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量產(chǎn)酸圈的直徑，并與乳酸菌體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，尋找產(chǎn)酸圈與抑菌圈之間的關(guān)系，探求乳酸菌產(chǎn)酸強(qiáng)度與抑制作用相關(guān)性。

②嗜水氣單胞菌濃度與抑制作用相關(guān)性。按照瓊脂擴(kuò)散法，取C-1的不同稀釋液為試驗(yàn)菌液，均勻涂布在普通瓊脂培養(yǎng)基表面，將牛津杯等距放置于平板上，用注射器將Y-2、Y-6、Y-11 培養(yǎng)液分別緩慢注入牛津杯中，放入4 ℃冰箱，待菌液全部擴(kuò)散完畢后置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，測(cè)量并記錄抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚源乳酸菌體外抑菌試驗(yàn)

1）嗜水氣單胞菌CFU 檢測(cè)，C-1CFU 為1.3×105，C-2CFU 為9×106，C-3CFU 為1.1×108。

2）魚源乳酸菌體外抑制試驗(yàn)結(jié)果（表1、圖1）：Y-6>Y-2>Y-11>Y-10>Y-7>Y-13。

表1 乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌結(jié)果 mm

2.2 魚源乳酸菌體外抑制作用的影響因素

1）魚源乳酸菌產(chǎn)酸強(qiáng)度與抑制作用的相關(guān)性。魚源乳酸菌的產(chǎn)酸圈（圖2、表2）：Y-6>Y-2>Y-11>Y-10>Y-7>Y-13，與抑菌圈呈正相關(guān)，說明魚源乳酸菌產(chǎn)酸度越強(qiáng)，對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用越大。

表2 魚源乳酸菌產(chǎn)酸圈與抑菌圈 mm

2）嗜水氣單胞菌濃度與抑制作用相關(guān)性。乳酸菌對(duì)不同濃度嗜水氣單胞菌的抑制相關(guān)性結(jié)果見表3，嗜水氣單胞菌的濃度越稀，抑菌圈越大。

表3 乳酸菌對(duì)C-1 不同稀釋液的抑制試驗(yàn) mm

3 討 論

由魚源乳酸菌體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果得知：魚源乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌有較強(qiáng)的抑制作用，這與孫夢(mèng)桐等[6]、康紹珠等[7]的研究結(jié)果一致。由此可知，魚源乳酸菌可用于嗜水氣單胞菌的防治，其抑菌物質(zhì)可能為乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物——某蛋白類物質(zhì)，如類抗生素物質(zhì)、細(xì)菌素、類細(xì)菌素樣物質(zhì)或有機(jī)酸等，其抑菌機(jī)理可能為魚源乳酸菌與嗜水氣單胞菌在魚類腸道競(jìng)爭(zhēng)拮抗消化道黏膜附著點(diǎn)，從而抑制嗜水氣單胞菌的生長。此外，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是一類選擇性作用于細(xì)菌靶細(xì)胞的抗菌物質(zhì)，可有效阻止細(xì)菌的增殖，抑制有害物質(zhì)的產(chǎn)生，維持動(dòng)物腸道健康，減少嗜水氣單胞菌病的暴發(fā)。

本研究中，乳酸菌產(chǎn)酸度與嗜水氣單胞菌的抑制作用呈正相關(guān)性，試驗(yàn)結(jié)果與辛娜等[8]、吳正可[9]研究結(jié)果基本一致，但有一定的差異，可能與平板的厚薄、干濕以及操作有關(guān)。由試驗(yàn)結(jié)果可知：乳酸菌的主要抑制因素與乳酸菌的數(shù)量、嗜水氣單胞菌的接種量、培養(yǎng)基溫度和pH 值等有關(guān)，其中影響抑制作用最重要的因素是細(xì)菌的種類及產(chǎn)酸強(qiáng)度。在臨床實(shí)踐的防治過程中，乳酸菌可在腸道內(nèi)產(chǎn)生乳酸和醋酸，降低腸道pH 值，抑制嗜水氣單胞菌的生長，因此，防治嗜水氣單胞菌要選擇生長迅速、產(chǎn)酸性強(qiáng)的菌株。

從本研究結(jié)果還可知，嗜水氣單胞菌濃度與乳酸菌抑制作用呈負(fù)相關(guān)性，嗜水氣單胞菌濃度越低，乳酸菌抑制作用越強(qiáng)。因此，防治嗜水氣單胞菌關(guān)鍵在于菌液擴(kuò)散的早期，臨床上應(yīng)以預(yù)防為主。同時(shí)，因乳酸菌可作用于改良水質(zhì)、治療疾病以及水產(chǎn)動(dòng)物免疫疾病等方面，可在養(yǎng)殖水中定時(shí)定量添加乳酸菌，并定期消毒，從而使水體中乳酸菌的數(shù)量升高成為優(yōu)勢(shì)菌。這樣不僅可通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用明顯抑制養(yǎng)殖水體中的嗜水氣單胞菌，而且還可通過直接的化學(xué)作用和間接的促進(jìn)微生物的反硝化作用消除水體中的亞硝酸鹽，起到凈化水質(zhì)的效果。

作為一種安全的益生菌，乳酸菌已經(jīng)成為國際研究的熱點(diǎn)。在養(yǎng)殖過程中將乳酸菌制劑部分替換抗生素作為飼料添加劑，有望解決抗生素殘留和動(dòng)物耐藥性等問題，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展意義重大。實(shí)踐證明，乳酸菌防治水生動(dòng)物疾病是可行的。徐國輝等[10]證明乳酸菌對(duì)副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、惡臭弧桿菌、鰻弧菌均有明顯的抑制作用。目前，國內(nèi)外對(duì)于魚源乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制作用研究較少，本試驗(yàn)通過探尋乳酸菌對(duì)嗜水氣單胞菌抑制作用及影響因素，可為乳酸菌對(duì)抑制嗜水氣單胞菌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。